一种益生植物乳杆菌的制作方法

本发明涉及工业微生物技术领域，尤其涉及一种益生植物乳杆菌。

背景技术：

乳酸菌（lacticacidbacteria，lab）是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。乳酸菌不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，提高食品保藏性和附加值，而且乳酸菌的特殊生理活性和营养功能，正日益引起人们的重视。大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。

果酒是用水果本身的糖分被酵母菌发酵成为酒精的酒，含有水果的风味与酒精。因此民间的家庭时常会自酿一些水果酒来饮用。如李子酒，葡萄酒，杨梅酒、猕猴桃酒等等。因为这些水果表皮会有一些野生的酵母，加上一些蔗糖，因此不需要额外添加酵母也能有一些发酵作用，但民间传统做酒的方法往往旷日费时，也容易被污染。所以外加一些活性酵母是快速酿造水果酒的理想方法。

当前市面上的柑橘饮品供应较少，我国的蜜桔等果蔬深加工水平也相对滞后,其使用价值和经济还没有完全开发出来。导致柑橘市场供大于求，造成很大的资源浪费。如何运用益生植物乳杆菌作为发酵菌剂，对果酒的发酵工艺具有重要的意义。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种益生植物乳杆菌，用于发酵果酒。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种益生植物乳杆菌，所述益生植物乳杆菌为植物乳杆菌nfl-131（lactobacillusplantarum），于2018年11月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno:m2018823。

本申请还提供了所述的益生植物乳杆菌于果酒发酵中的应用。

本申请还提供了该益生植物乳杆菌发酵果酒的方法，包括如下步骤：

（1）将柑橘鲜果去皮去核榨汁后，接种植物乳杆菌进行发酵20～30h；

（2）待发酵液产生乳酸、琥珀酸等有机酸后，调整成分，再接种酿酒酵母菌继续进行发酵；

（3）待发酵的果浆含糖量降至1%时，去除浮渣，放出果酒到新桶发酵2～3周；

（4）将果酒贮存6～18个月，即为陈酿，制得果酒。

进一步的，步骤（1）中接种益生植物乳杆菌的总重量为柑橘汁的4%～6%，在28～32℃下发酵20～30h。

进一步的，步骤（2）中调整成分时先调糖，用砂糖，每次加糖后发酵液中总糖量应控制在14%～16%，其次是调酸，每升果浆中含酸8～12g。

进一步的，步骤（2）中按每升原料接种酿酒酵母菌50～100g，同时加入酵母营养粉，按0．4%～0．5%加。接种后8～12h内，充分搅拌，使酵母在原料内均匀分布。

进一步的，步骤（2）中接种酵母之后，逐渐升温至23℃，27℃，30℃。在酒帽形成之后，每天下压酒帽搅2～4次，每次10～15分钟，直到发酵结束。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果：

本发明所提供的益生植物乳杆菌有促进营养物质吸收的作用，可以维持肠道内菌群的平衡，并且作为一种生物型的防腐剂，延长了果酒的保质期，不会产生污染物，保证不污染环境。

主要表现在以下几个方面：

（1）本发明提供的益生植物乳杆菌具有良好的体内生存能力，对于胃肠环境的低ph和高胆盐条件表现出良好的耐受能力，能够在体内存活发酵，促进肠道蠕动，改善肠道菌群环境。以植物乳杆菌具体实验过程如下：

将过夜生长的植物乳杆菌nfl-131取1ml置于含有9ml人工胃液（胃蛋白酶(1:5000)3.5g/l，nacl2g/l，用盐酸调节至ph=3）、0.3%胆盐的mrs肉汤培养基中，利用活菌计数法将混合均匀后的样品以及37℃培养4h后的样品取样涂布，计算其存活率：

存活率=4h后平板菌落数目/接种时平板菌落数目×100%

（2）本发明提供的益生植物乳杆菌具有一定的抑菌效果，对于志贺菌、沙门氏菌等菌株均具有一定的拮抗作用，维持肠道菌群平衡，延长果酒保质期，具体实验过程如下：

选取大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，伤寒沙门氏菌，福氏志贺菌，蜡样芽孢杆菌，共计五种致病菌为指示菌，使用牛津杯法来测试植物乳杆菌nfl-131的抑菌能力；

附图说明

下面结合附图说明对本发明作进一步说明。

图1是本发明一株益生植物乳杆菌发酵果酒的流程图；

图2为益生植物乳杆菌的细胞菌落形态的照片。

图3为益生植物乳杆菌的细胞显微形态的照片。

具体实施方式

实施例一：

植物乳杆菌nfl-131（lactobacillusplantarum）的分离选育

1、植物乳杆菌nfl-131的分离：

以南丰蜜桔为原料，经挑选、清洗、榨汁，过滤等工艺，制成蜜桔果汁，在自然条件下，分装在5l发酵罐中，在室温下自然发酵，作为乳酸菌筛选菌源。

待果汁样品在发酵罐中的取样有明显醋香时，取发酵液3%接入乳酸菌富集培养基（mrs肉汤培养基），37℃培养48h。在无菌条件下将发酵液进行10倍梯度稀释，选取3个适宜的稀释度10^-3、10^-4和10^-5使得平板菌落能够彼此分开，各吸取0.1ml，涂布于mrs培养基平板上，每个稀释度做2个平行，置于37℃培养箱中恒温培养48h。挑取具有典型乳酸菌菌落形态的单菌落，在mrs培养基平板上进行4-5次划线传代，经显微镜镜检，从采集的样品中共分离得到6株酵母菌株。对6株菌株进行接触酶试验，挑选岀具有典型乳酸菌菌落特征的初筛菌株1株。将其分别编号为nfl-131并分别转移至mrs琼脂斜面培养基上，于4℃条件下保藏、备用。

乳酸菌nfl-131的鉴定

(1)乳酸菌nfl-131的形态学

乳酸菌nfl-131的细胞显微形态如图3所示。

(2)16srdna序列测定与同源性分析

采用试剂盒提取的方法提取纯培养目标菌株的基因组dna。以引物27f和1492r扩增其16srdna基因保守区27f：agagtttgatcctggctcag1429r：ggttaccttgttacgactt。

采用40μl反应体系进行pcr扩增，反应体系为：premixrtaq20μl、nl12.0µl、nl42.0µl、dna1.0µl、ddh2o15µl。扩增条件：95℃预变性2min，然后95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共29次循环，最后72℃充分延伸5min，4℃保存。pcr产物检测：取5μl的pcr产物，1μl的上样缓冲液，在1.0%琼脂糖凝胶电泳中分离（130v，20min）。用凝胶成像系统进行分析，将含有目标片段的产物进行测序。将植物乳杆菌nfl-131的16srdna序列输入genebank，以blast软件进行序列同源性比较，利用mega6.0软件构建系统发育进化树，进行亲缘关系和系统发育分析，其16srdna序列系统发育进化树示于图1。结果显示，与nfl-131菌株基因序列相似性较高的序列主要为植物乳杆菌属，与其相似性最高的是该属中的植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）种，与多株已知植物乳杆菌的同源性达99%以上，说明该菌在分子系统发育分类学上属于植物乳杆菌属中的一个种。经16srdna序列同源性分析，依据同源性在系统发育中的分类原则并结合形态，最终确定nfl-131菌株为植物乳杆菌，命名为lactobacillusplantarumnfl-131。

为了充分公开本发明的植物乳杆菌新菌株nfl-131及其应用，现结合附图和发明人给出植物乳杆菌nfl-131在果汁发酵和果酒酿造中的应用，来进一步说明本发明的有益效果。

一种益生植物乳杆菌发酵果酒的的方法如下步骤：

（1）将柑橘鲜果去皮去核榨汁后，接种植物乳杆菌进行发酵20～30h。

（2）待发酵液产生乳酸、琥珀酸等有机酸后，调整成分，再接种酿酒酵母菌继续进行发酵；

（3）待发酵的果浆惨糖量降至1%时，去除浮渣，放出果酒到新桶发酵2～3周；

（4）将果酒贮存6～18个月，即为陈酿，制得果酒。

其中步骤（1）中接种益生植物乳杆菌的总重量为柑橘汁的4%～6%，在28～32°c下发酵20～30h。在步骤（2）中调整成分时先调糖，一般用砂糖，每次加糖后发酵液中总糖量应控制在14%～16%，其次是调酸，一般每升果浆中含酸8～12g。在步骤（2）中按每升原料接种酿酒酵母菌50～100g，同时加入酵母营养粉，按0．4%～0．5%加。接种后8～12h内，充分搅拌，使酵母在原料内均匀分布。在步骤（2）中接种酵母之后，逐渐升温至23℃，27℃，30℃。在酒帽形成之后，每天下压酒帽搅2～4次，每次10～15分钟，直到发酵结束。

测得发酵过程中有机酸成分的含量变化前后对比如下表所示：

本发明的益生植物乳杆菌可较好的应用于果酒发酵的工艺中，同时，其可用于相关发酵乳制品的生产。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。