一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于应用微生物领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌（bacillusvelezensis）fs001及其在白色念珠菌防治中的应用。

背景技术：

白色念珠菌（candidaalbicans）是人类最主要的致病真菌之一。约25%～50%健康人的口腔、阴道、消化道带有白色念珠菌，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约失调时，就会引起疾病；近年来，随着大剂量抗生素、激素、免疫抑制剂的使用以及器官移植的普遍发展，白色念珠菌发病率近年来渐趋增高。研究表明，深部白色念珠菌感染病死亡率高达40%。目前，临床上用于治疗白色念珠菌的药物种类较少，长期的预防性治疗和反复给药，促进了白色念珠菌的致病与耐药性白色念珠菌的产生，从而使对白色念珠菌的防治效果越来越差。

微生物产生抗生素与抗菌活性物质的发现与开发是近年来颇受关注的领域，已有多种抗生素与抗菌肽被发现、生产并被应用于多种疾病的防治与治疗。微生物产生的抗菌活性物质具有抗菌机制独特、天然无毒、生产效率高、易于工业化生产等优势。然而对于微生物抑制病原酵母菌白色念珠菌的研究与产品尚鲜有报道。因而寻找具有抑制白色念珠菌活性的微生物并将其应用于相应疾病的预防与治疗是一种研发白色念珠菌疾病防治的新思路。b.velezensis是近年来被发现能够产生抗真菌活性物质，并被用于农业真菌病害生物防治相关研究与应用的新型生物防治微生物，而将其用于人类与动物疾病防治的研究尚未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一株从鹿粪便分离得到的贝莱斯芽孢杆菌（bacillusvelezensis）fs001，该菌株已于2019年6月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，cgmccno.17946。

本发明贝莱斯芽孢杆菌是从云南野生动物园梅花鹿的粪便中分离得到，并经过鉴定获得的；该贝莱斯芽孢杆菌的菌落呈白色不透明状，表面有褶皱，边缘不规则；菌体呈短小杆状，长3.0-4.0μm，宽0.8-1.0μm，细胞椭圆形，可以形成芽孢，芽孢中生，革兰氏阳性。

对该菌株16srrna基因进行pcr扩增，并进行测序及系统发育分析，鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌，命名为贝莱斯芽孢杆菌fs001（bacillusvelezensisfs001）。

本发明另一目的是将上述贝莱斯芽孢杆菌应用在抑制白色念珠菌中。

使用琼脂打孔扩散法测定其抑菌活性，发现本发明的b.velezensisfs001对于白色念珠菌canidiaalbicansatcc90029具有较强抑制活性。

在白色念珠菌细胞的显微观察中发现添加b.velezensisfs001发酵液后白色念珠菌的细胞发生膨大，子细胞不能与母细胞分离乃至细胞裂解死亡。

本发明的b.velezensisfs001对于临床上妇女阴道白色念珠菌具有较强的特异性抑制活性。对妇科病人阴道分泌物中携带的8株白色念珠菌、9株光滑念珠菌、1株毕赤酵母和1株热带假丝酵母进行抑菌实验，结果表明b.velezensisfs001发酵液对所有白色念珠菌均具有较强抑制作用，而对光滑念珠菌、毕赤酵母以及热带假丝酵母无抑制。

本发明的b.velezensisfs001对酿酒酵母无抑制作用。

本发明的b.velezensisfs001对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌无抑制作用。

本发明的b.velezensisfs001对于绿色木霉（trichodermaviride）、总状毛霉（mucorracemosus）、尖孢镰刀菌（fusariumoxysporum）菌具有一定的抑制作用。

本发明b.velezensisfs001的应用，包括将活菌、菌种发酵液用于抑制白色念珠菌的生长与繁殖；本发明应用还可以将该菌株作为活性成分，添加适宜的辅料用于制成粉剂、微胶囊、干混悬剂、栓剂、洗液、喷剂等产品用于抑制白色念珠菌的生长与繁殖。

本发明另一个目的是提供一种产生于贝莱斯芽孢杆菌（bacillusvelezensis）fs001的环脂肽，对b.velezensisfs001发酵液中抑制白色念珠菌的化合物进行分离纯化后通过结构分析确认该发酵液中的抑菌活性物质为一种环脂肽。

该环脂肽的分子式为c47h74n10o16,其分子量为1034.528da。

该环脂肽的分子中含有一个15个碳原子的脂肪酸链。

该环脂肽的分子中含有7个氨基酸，其中有3个d-氨基酸，4个l-氨基酸。这7个氨基酸与脂肪酸中的羧基碳原子以及α、β碳原子形成一个环状结构。

本发明的环脂肽对白色念珠菌的抑菌机制是特异性抑制了白色念珠菌葡聚糖合成酶活性从而抑制白色念珠菌细胞壁的合成；红外光谱分析白色念珠菌细胞壁β-1,3-d葡聚糖发现b.velezensisfs001处理后的白色念珠菌细胞壁葡聚糖大大减少；提取白色念珠菌的细胞壁葡聚糖合成酶并进行酶活性分析，发现添加环脂肽后该合成酶活性丧失。

本发明的环脂肽性能十分稳定，肽在100℃处理30min后其活性仍然保留90%以上；在ph1-9环境中处理过夜后其活性仍然保留87%以上，尤其在ph4-9之间，处理后的活性均为90%以上。

本发明环脂肽的应用是将环脂肽作为活性成分，可以添加适宜的辅料用于制成粉剂、微胶囊、干混悬剂、栓剂、洗液、喷剂等产品用于抑制白色念珠菌的生长与繁殖。

总之，本发明提供的从梅花鹿粪便中分离得到的贝莱斯芽孢杆菌（b.velezensis）fs001以及其产生的特异性抑制白色念珠菌的环脂肽，均具有特异性抑制白色念珠菌的能力，具有较高的应用价值；尤其是能够抑制对氟康唑不敏感或敏感性较低的白色念珠菌，对于研制和开发高效、不易引起耐药性的新型抗白色念珠菌药物，减少临床上唑类药物的使用具有积极意义和广阔的应用前景。

附图说明

图1为b.velezensisfs001的菌落形态图；

图2为b.velezensisfs001的菌体细胞革兰氏染色后的显微照片；

图3为b.velezensisfs001的16srrna基因片段pcr扩增结果图；

图4为b.velezensisfs001的系统发育树图；

图5为b.velezensisfs001对临床白色念珠菌的抑制作用图；其中a为空白培养基对照，b为b.velezensisfs001发酵液；

图6为正常白色念珠菌细胞的电镜照片；

图7为b.velezensisfs001发酵液处理过的白色念珠菌细胞的电镜照片；

图8为b.velezensisfs001对临床妇科病人白色念珠菌的特异性抑制作用；

图9为正常白色念珠菌细胞壁β-1,3-d葡聚糖的红外光谱图；

图10为被b.velezensisfs001抑制的白色念珠菌细胞壁β-1,3-d葡聚糖的红外光谱图。

图11为白色念珠菌中细胞壁β-1,3-d葡聚糖合成酶活性的测定；

图12为b.velezensisfs001产生的环脂肽在不同温度下的稳定性；

图13为b.velezensisfs001产生的环脂肽在不同ph下的稳定性。

图14为b.velezensisfs001对酿酒酵母的抑制作用图；其中a为空白培养基对照，b为b.velezensisfs001发酵液；

图15为b.velezensisfs001对大肠杆菌的抑制作用图；其中a为空白培养基对照，b为b.velezensisfs001发酵液；

图16为b.velezensisfs001对金黄色葡萄球菌的抑制作用图；其中a为空白培养基对照，b为b.velezensisfs001发酵液；

图17为b.velezensisfs001对绿色木霉的抑制作用图；其中a为空白培养基对照，b为b.velezensisfs001发酵液；

图18为b.velezensisfs001对总状毛霉的抑制作用图；其中a为空白培养基对照，b为b.velezensisfs001发酵液；

图19为b.velezensisfs001对尖孢镰刀菌的抑制作用图；其中a为空白培养基对照，b为b.velezensisfs001发酵液。

具体实施方式

本发明中涉及到的主要材料、试剂和仪器设备：供试病原菌采用白色念珠菌atcc90029（candidaalbicansatcc90029），购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。鹿的粪便样品采自云南野生动物园，取样后低温保存，至实验室进行分离；培养基采用lb培养基（氯化钠1%（w/v），胰蛋白胨1%（w/v）），酵母膏0.5%（w/v），琼脂1.5%（w/v））；bph-9082型恒温培养箱，bxm-30r型高压自动灭菌锅，sw-cj-1f型超净工作台，thermox1r小型台式高速冷冻离心机，thz-100b型恒温摇床，tprofessional梯度pcr仪，dyy-6c，dycp-31e/31bn型dna电泳系统，bio-radgeldocxr+凝胶成像系统，奥林巴斯bx53研究型生物显微镜，德国布鲁克（bruker）alpha红外光谱仪，其余试剂均为分析纯。

本发明中选用的主要材料、试剂和仪器设备都为本领域所熟知，其他领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、b.velezensisfs001的分离、筛选及鉴定

1、菌株的分离

梯度稀释分离菌株：取鹿的粪便样品10g，放入装有90ml无菌水的锥形瓶中，37℃，200rpm振荡30min，之后用无菌水进行梯度稀释，各取0.1ml稀释液（10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6）分别涂布于lb平板上，37℃培养箱中培养24h，对平板上长出的菌落进行划线纯化。

2、菌株的鉴定

（1）形态观察

参见图1，获得的有抑制白色念珠菌活性的菌株，在lb平板上35℃条件下，培养20-24h，菌落中等大小，呈白色不透明状，表面有褶皱，边缘不整齐；挑取单菌落，置载玻片上的生理盐水中，涂匀，风干后进行固定，经革兰氏染色后观察菌体形态。观察结果（图2）表明菌体呈短小杆状，长3.0-4.0μm，宽0.8-1.0μm，革兰氏阳性，染色均匀，可以形成芽孢，芽孢中生，椭圆形。

（2）生理生化性质鉴定

依照第九版《伯杰氏系统细菌学手册》（<bergey'smanualofsystematicbacteriology>）和《常用细菌系统鉴定手册》对有抑制白色念珠菌活性的菌株的生理生化性质进行鉴定。结果如表1所示，表明该菌是一株芽孢杆菌（bacillus），命名为fs001。

（3）pcr扩增fs001的16srdna序列及其测序

根据引物设计的原则，通过软件vectornti设计pcr引物；引物如下：

引物1（f）：5＇-caagtcgagcggacagatgggagct-3＇

引物2（r）：5＇-acctgcggctggatcacctcctt-3＇

以菌株fs001的总dna为模板，在引物1和引物2的引导下，进行pcr扩增反应；pcr反应体系为50µl，pcr反应条件为：95℃0.5min，55℃0.5min，72℃1.5min，共30个循环；反应结束后取2μlpcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外检测在1500bp附近有一条明显的条带（图3）。

（4）16srdna序列比对及系统发育分析

将测序得到的16srdna序列与ncbi数据库中的核苷酸序列进行blast分析，从中获取同源性相近的16srdna序列，用mega7.0中的邻位相连法（neighbor-joining）构建系统发育树。

经过序列分析，目标片段长1492bp如seqidno:1所示；将fs001的16srdna序列进行blast分析，结果显示，fs001与菌株b.velezensisdsyz的同源性最高。构建系统发育树发现（图4），fs001与b.velezensisdsyz之间的进化距离最短，结合fs001的形态特征及生理生化特征，确定其为贝莱斯芽孢杆菌（b.velezensis）。

实施例2：b.velezensisfs001对白色念珠菌以及妇科临床病人白色念珠菌的特异性抑制活性

b.velezensisfs001在lb固体培养基上划线培养进行活化，35℃培养24h后，挑取单菌落接种到装有50ml最适生长培养基的250ml的锥形瓶中，在35℃，摇床转速250rpm的条件下培养24h。用离心机10000rpm离心20min，收集上清液。将上清液用0.22μm的无菌滤膜过滤，得到fs001发酵的无细胞上清液。

采用琼脂扩散法，将白色念珠菌atcc90029在马铃薯葡萄糖肉汤培养基上培养至对数期，以5%的添加量将菌液加入灭菌的pda培养基中，混匀后倒平板；用8mm打孔器在平板上打孔，然后在孔中加入0.1ml的b.velezensisfs001发酵的无细胞上清液，空白对照为未发酵培养基；将平板置于28℃培养，2天后观察白色念珠菌生长情况，记录透明圈直径。结果见图5，由图可见b.velezensisfs001发酵无菌上清液对白色念珠菌具有较强的抗菌活性。

将过夜培养的白色念珠菌按照1：100稀释度分别接种在pda液体培养基和含有fs001发酵无菌上清液的pda液体培养基中，28℃培养8h后，取对照白色念珠菌与fs001发酵无菌上清液处理后的白色念珠菌细胞于电子显微镜下观察；发现对照白色念珠菌细胞完整、卵圆形有小突起（图6）；而经fs001发酵无菌上清液处理后的白色念珠菌细胞破碎明显（图7）。

从23个临床病人阴道分泌物样品中分离得到19株菌，采用琼脂扩散法测定fs001发酵无菌上清液对其抗菌活性，同时通过18srdna序列分析对这19株菌进行鉴定；结果表明fs001发酵无菌上清液对所有8株白色念珠菌均具有较强抗菌活性，而对与之相近的所有9株光滑念珠菌（candidaglabrata）没有抗菌活性，对毕赤酵母（pichiacecembensis16）与热带假丝酵母（candidatropicalis79）也没有抗菌活性（图8）。

实施例3：b.velezensisfs001发酵液抗白色念珠菌活性物质的分离纯化与鉴定

将b.velezensisfs001无菌发酵上清液真空冷冻干燥后，用甲醇浸提1-2h后减压蒸发，所得的蒸发残留物甲醇溶解，即得到粗提物。

粗提物用c18色谱柱经过反相高效液相色谱(rp-hplc)进一步纯化后收集活性峰冷冻干燥。重蒸水溶解干燥物后经lc-ms-ddms2分析得到活性物质的离子流谱图；通过质谱分析得到活性物的分子量为1034.528da；

对质谱结果进行解谱分析，确定其分子式为c47h74n10o16；进一步分析二级质谱的特征基团确定fs001产生的抗菌物质为含有15个碳原子脂肪酸尾巴的环脂肽，其结构如下式所示：

。

实施例4：b.velezensisfs001产生的环脂肽对白色念珠菌细胞壁葡聚糖含量的影响

在白色念珠菌atcc90029中加入经纯化的环脂肽后，在28℃、180r/min培养24h；收集细胞并冻干；白色念珠菌细胞壁β-(1-3)-d葡聚糖通过1m氢氧化钠和0.5m乙酸反复处理，用无水乙醇反复脱水后得到难溶于水、酸和碱的多糖，即为白色念珠菌细胞壁β-(1,3)-d葡聚糖；对提取的白色念珠菌细胞壁β-(1,3)-d葡聚糖用kbr压片做红外光图谱，对照未处理白色念珠菌细胞壁葡聚糖（图9）和加入环脂肽的白色念珠菌细胞壁葡聚糖红外光谱（图10），结果表明环脂肽处理过的白色念珠菌细胞壁葡聚糖含量大大降低。

实施例5：b.velezensisfs001产生的环脂肽对白色念珠菌细胞壁葡聚糖合成酶活性的影响

收集培养至对数期的白色念珠菌atcc90029菌体细胞，使用真菌/酵母β-(1,3)-d葡聚糖合成酶活性比色法定量检测试剂盒（上海哈灵生物科技有限公司）提取菌体细胞中的β-(1,3)-d葡聚糖合成酶，添加fs001产生的环脂肽、酶反应底物进行反应，以无环脂肽的缓冲液为对照。使用同样试剂盒测定环脂肽对白色念珠菌葡聚糖合成酶活性的影响。结果显示添加了环脂肽的白色念珠菌细胞壁β-（1,3）-d葡聚糖合成酶丧失了酶活性（图11）。

实施例6：b.velezensisfs001产生的环脂肽的稳定性分析

1、温度稳定性

提取的环脂肽分别置于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃、120℃处理30min，然后迅速置于冰上；处理后的样品通过琼脂扩散的方法，用白色念珠菌atcc90029为测试菌进行抗菌活性的测试，结果发现环脂肽在低于80℃时抗菌活性基本不变，在100℃处理后其活性仍然剩余90%（图12）。

2、ph稳定性

提取的环脂肽分别置于ph1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14的缓冲液中，4℃处理过夜，然后将ph值调节至7；处理后的样品通过琼脂扩散的方法，用白色念珠菌atcc90029为测试菌进行抗菌活性的测试。结果发现在ph1-9范围内，环脂肽抗菌活性均保持在90%以上，当ph大于9时，其抗菌活性急剧下降（图13）。

实施例7：b.velezensisfs001对其他菌株的抑制活性

本实施例采用琼脂扩散法检测了b.velezensisfs001对酿酒酵母、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿色木霉、总状毛霉、尖孢镰刀菌的抑制活性，具体如下:

琼脂扩散法（酿酒酵母、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）：将酿酒酵母、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别在培养基上（其中酿酒酵母使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌使用lb琼脂培养基）培养至对数期，并分别以5%的添加量将菌液加入灭菌的培养基（其中酿酒酵母使用pda，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌使用lb）中，混匀后倒平板；用8mm打孔器在平板上打孔，然后在孔中加入0.1ml的b.velezensisfs001发酵的无细胞上清液，空白对照为未发酵培养基；将平板置于恒温培养箱中（其中酿酒酵母在28℃，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在37℃）培养，2天后观察菌株生长情况，记录透明圈直径；结果见图14，图15和图16，由图可见b.velezensisfs001发酵无菌上清液对酿酒酵母、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌无抗菌活性。

琼脂扩散法（绿色木霉、总状毛霉、尖孢镰刀菌）：将绿色木霉、总状毛霉、尖孢镰刀菌分别在pda培养基上培养2天后，用8mm打孔器在平板上打孔，然后在孔中加入0.1ml的b.velezensisfs001发酵的无细胞上清液，空白对照为未发酵培养基，再将平板置于28℃培养箱培养，3-5天后观察真菌生长情况，记录抑菌圈直径并拍照，结果见图17，图18和图19，由图可见b.velezensisfs001发酵无菌上清液对绿色木霉、总状毛霉、尖孢镰刀菌有较好的抗菌活性。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1492

<212>dna

<213>贝莱斯芽孢杆菌fs001(bacillusvelezensisfs001)

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<213>人工序列(artificial)

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<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>3

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