一种高产异丁醇的YH-76S菌株及其制备方法与流程

本发明涉及大肠杆菌菌株的制备技术领域，特别涉及一种高产异丁醇的yh-76s菌株及其制备方法。

背景技术：

异丁醇(2-methyl-1-propanol)是一种无色易燃，有特殊气味的有机化合物。其异构体为正丁醇、仲丁醇和叔丁醇。它被列为醇类，因此，它被广泛用作化学反应的溶剂，同时也是有机合成的一个有用的原料。在自然界，异丁醇能通过碳水化合物的自然发酵得到。它也可能是有机质降解过程中的一个副产品。工业上从丙烯的羰基合成得到正丁醛、异丁醛，再加氢、分离产物便得到异丁醇。

传统化学合成异丁醇采用异丁醇丙烯羰基合成法。高压羰基合成技术由于选择性较差、丙烷和高沸物等副产品较多,已被以铑为催化剂的低压羰基合成技术所取代。有研究表明，当发酵液中丁醇浓度达13-14g/l时菌体的生长会受到抑制作用，从而导致发酵结束时产物浓度极低。因此，筛选出高丁醇耐受性的优良菌株是解决此现象的有效方法之一。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌菌株的制备方法，以筛选出高丁醇耐受性的优良菌株。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

一种高产异丁醇的yh-76s菌株的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、出发菌的活化：以实验室保藏的大肠杆菌mg1655作为出发菌，将所述出发菌在固体培养基中划线，并在30℃-37℃的环境下培养出单菌落，将所述单菌落在液体培养基中培养，获得活化的菌体；

步骤2、artp诱变处理：将涂布有菌体液的无菌载片置于处理源下进行诱变处理获得突变体单克隆；

步骤3、在培养基中对异丁醇高产菌株筛选：通过bmor生物传感器系统对步骤2中获得的突变体单克隆进行荧光筛选，筛选经发酵验证荧光强度高于出发菌2倍以上的菌株作为目标菌株；

步骤4、在培养基中对异丁醇高产菌株改造：将转化质粒pyh15，表达丙酮酸到2-酮异戊酸的酶alss，ilvc和ilvd，构建得到异丁醇高产菌株yh-76s。

可选的：所述培养基包括种子培养基和发酵培养基。

可选的：所述种子培养基和发酵培养基包括：nah2po41-6g/l，kh2po42-6g/l，nacl0.2-2g/l，nh4cl0.5-5g/l，mgso40.5-1mm，cacl20.1-2mm，维生素b15-20mg/l和葡萄糖20-60g/l。

根据本发明的另一方面，还提供了一种高产异丁醇的yh-76s菌株，其保藏编号为syh015。

采用上述技术方案，通过artp(常温常压等离子体)诱变系统对大肠杆菌mg1655进行突变，然后使用bmor生物传感器系统筛选得到异丁醇高产菌株yh-76s，其能够通过发酵生产高浓度异丁醇，发酵液中的异丁醇含量可以达到为50-70g/l。

附图说明

图1为异丁醇生产菌株yh-76s发酵生产异丁醇，生物量和糖利用关系的情况图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

一种高产异丁醇的yh-76s菌株的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、出发菌的活化：以实验室保藏的大肠杆菌mg1655作为出发菌，将所述出发菌在lb固体培养基中划线，并在30℃-37℃的环境下培养出单菌落，将所述单菌落在lb液体培养基中培养，获得活化的菌体。

步骤2、artp诱变处理：将涂布有菌体液的无菌载片置于处理源下进行诱变处理获得突变体单克隆。

artp(atmosphericandroomtemperatureplasma)诱变即常温常压等离子体诱变：用无菌生理盐水洗涤活化后的菌体后重悬菌体，并适当稀释菌体至合适浓度，将其置于处理源下对出发菌株进行突变文库的构建，获得突变体单克隆。

步骤3、在培养基中对异丁醇高产菌株筛选：通过bmor生物传感器系统对步骤2中获得的突变体单克隆进行荧光筛选，筛选经发酵验证荧光强度高于出发菌2倍以上的菌株作为目标菌株。

bmor是一种转录因子，将其与异丁醇分子结合后，可与rnap构成复合体，以作为异丁醇的生物传感器，其中复合体起始gfp为荧光蛋白。

步骤4、在培养基中对异丁醇高产菌株改造：将转化质粒pyh15，表达丙酮酸到2-酮异戊酸的酶alss，ilvc和ilvd，构建得到异丁醇高产菌株yh-76s。

上述培养基包括种子培养基和发酵培养基，在本发明的实施例中，种子培养基和发酵培养基包括：nah2po41-6g/l，kh2po42-6g/l，nacl0.2-2g/l，nh4cl0.5-5g/l，mgso40.5-1mm，cacl20.1-2mm，维生素b15-20mg/l和葡萄糖20-60g/l。

步骤5、异丁醇高产菌株的鉴定：

通过培养基优化，将异丁醇的产量提高至5-20g/l，通过发酵罐发酵异丁醇高产菌株yh-76s产生异丁醇，并利用gc检测异丁醇产量。

上述发酵罐的体积为2-4l，接种量为0.1％-4％(v/v)，发酵温度为30-37℃，搅拌转速为200-300rpm，发酵过程使用盐酸和氨水控制ph在6.5-7.5，发酵时间为72-144小时。

在本发明的实施例中，发酵罐发酵培养基体积为3.5l，先在121℃的环境中灭菌20分钟，然后接种发酵，其中接种量为0.2％(v/v)，发酵温度为37℃，搅拌转速为250rpm，发酵过程使用盐酸和氨水控制ph在7.0左右，发酵时间为120小时；最后使用gc分析发酵液中的异丁醇含量为60g/l，如图1所示，图1a纵坐标为生物量浓度，横坐标为时间，图1b纵坐标为葡萄糖浓度，恒坐标为时间，圆点折线代表生物量数据，方形折线为葡萄糖。

以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

技术特征：

1.一种高产异丁醇的yh-76s菌株的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1、出发菌的活化：以实验室保藏的大肠杆菌mg1655作为出发菌，将所述出发菌在固体培养基中划线，并在30℃-37℃的环境下培养出单菌落，将所述单菌落在液体培养基中培养，获得活化的菌体；

步骤2、artp诱变处理：将涂布有菌体液的无菌载片置于处理源下进行诱变处理获得突变体单克隆；

步骤3、在培养基中对异丁醇高产菌株筛选：通过bmor生物传感器系统对步骤2中获得的突变体单克隆进行荧光筛选，筛选经发酵验证荧光强度高于出发菌2倍以上的菌株作为目标菌株；

步骤4、在培养基中对异丁醇高产菌株改造：将转化质粒pyh15，表达丙酮酸到2-酮异戊酸的酶alss，ilvc和ilvd，构建得到异丁醇高产菌株yh-76s。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌菌株的制备方法，其特征在于：所述培养基包括种子培养基和发酵培养基。

3.根据权利要求2所述的大肠杆菌菌株的制备方法，其特征在于：所述种子培养基和发酵培养基包括：nah2po41-6g/l，kh2po42-6g/l，nacl0.2-2g/l，nh4cl0.5-5g/l，mgso40.5-1mm，cacl20.1-2mm，维生素b15-20mg/l和葡萄糖20-60g/l。

4.一种根据权利要求1-3所述的制备方法制备的高产异丁醇的yh-76s菌株，其保藏编号为syh015。

技术总结
本发明公开了一种高产异丁醇的YH‑76S菌株的制备方法，包括以下步骤：出发菌的活化，ARTP诱变处理，在培养基中对异丁醇高产菌株筛选，在培养基中对异丁醇高产菌株改造。本发明制备的YH‑76S菌株是通过ARTP(常温常压等离子体)诱变系统对大肠杆菌MG1655进行突变，然后使用BmoR生物传感器系统筛选得到的，其能够通过发酵生产高浓度异丁醇，发酵液中的异丁醇含量可以达到为50‑70g/L。

技术研发人员：张沨;王新飞;王兴春
受保护的技术使用者：山东汇冠康博生物科技有限公司
技术研发日：2019.08.19
技术公布日：2019.11.15