一种纳米荧光标记的人工细菌及其制备方法与流程

[0001]
本发明涉及纳米医学领域，尤其涉及一种纳米荧光标记的人工细菌及其制备方法和应用。


背景技术：

[0002]
肿瘤是人类亟待攻克的顽疾之一，近年来人们利用改造的工程细菌来治疗肿瘤，取得了很好的疗效，用减毒细菌的肿瘤靶向性定向释放治疗基因已成为肿瘤基因治疗领域的新亮点，其中鼠伤寒沙门氏菌是这些细菌中的一个典型代表。鼠伤寒沙门氏菌作为兼性厌氧的革兰氏阴性菌，具有潜在的肿瘤靶向性和肿瘤杀伤能力，还具有遗传操作简易等优点。来坷炯(“鼠伤寒沙门氏菌yb1抑制肿瘤转移机理研究”，2018年，厦门大学硕士学位论文)报道了一株鼠伤寒沙门氏菌yb1，其经过基因改造后具有严格厌氧特性的减毒菌株，它具有极佳的肿瘤靶向性和抑制肿瘤转移的能力。
[0003]
虽然细菌疗法因其有靶向肿瘤、侵袭肿瘤细胞、可塑性强等优点受到了研究人员的广泛关注，但是细菌疗法的治疗机理不清、可控性弱等问题，限制了其作为肿瘤治疗药物的开发和应用。因此，需要寻找一种安全高效的方法来跟踪、监测细菌，并且评估其治疗的效果。在细菌表面加入纳米材料为细菌提供保护层，或用纳米探针标记细菌的方法已成为细菌疗法的研究热点。
[0004]
现有技术中，cn200910188814公开了一种纳米颗粒及其制备方法，以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)形成内核、磷脂形成的中间层环绕内核表面，含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇形成的外壳部分穿插于所述中间层。该文献不涉及荧光探针的标记，使用范围有限。cn201010607708公开了一种荧光纳米探针，也是以聚乳酸-羟基乙酸共聚物形成内核、磷脂形成的中间层环绕所述内核表面，含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 (dspe-peg)形成的外壳部分穿插于所述中间层，在其内核中分散有吲哚菁绿(icg)，该荧光探针可对肿瘤细胞进行识别，但仅可用于肿瘤的早期诊断。上述两种现有技术中纳米颗粒的制备方法均采用的是搅拌混合的方式，制备效率较低，耗时较长。cn201210424026和 cn201210574535也别公开了两种纳米药物颗粒及其制备方法，这两种方法结合了纳米包裹技术、化疗药物与用于热疗的近红外光热转换试剂三者的优点，两者所要解决的技术问题是热疗和化疗的联合作用，同时负载近红外光热转换试剂和化疗药物两种药物，并且缓释的技术问题。上述现有技术均没有采用减毒细菌进行肿瘤的靶向性治疗，更不涉及鼠伤寒沙门氏菌。
[0005]
而现有技术中对于细菌的纳米探针标记技术，通常采用纳米探针与细菌外膜蛋白质中官能团通过化学反应进行交联，如采用碳二亚胺化反应形成酰胺键，但羧基和氨基之间的交叉交联可能降低纳米探针与细菌表面反应的效率及特异性。而像糖工程化的交联方法，在细菌外膜表面引入人工官能团(如酮和叠氮化物)时，表达特定官能团时，所消耗的时间较长，甚至需要几天时间。
[0006]
基于目前现有技术的种种缺陷和不足，本发明人创造性地将纳米荧光标记技术与
工程细菌靶向治疗肿瘤相结合，提供了一种特异性强、快速简便的荧光标记方法，将纳米荧光探针 inps高效、稳定地标记到沙门氏菌yb1表面，从而实现在细菌肿瘤治疗中跟踪、监测细菌，并且可实时评估其治疗的效果，为肿瘤发生发展及其临床治疗，以及相关抗肿瘤药物研究提供极大便利，有广阔的应用前景。


技术实现要素：

[0007]
本发明提供了一种人工细菌，所述人工细菌的表面标记有纳米荧光探针(inps)，所述inps 是通过表面的马来酰亚胺基团与经还原剂处理后的沙门氏菌表面的巯基化学交联；所述inps 包括两性化合物、单层脂类分子、近红外光热转换试剂和疏水性多聚物；所述两性化合物含有马来酰亚胺基团；所述细菌为沙门氏菌。
[0008]
本发明还提供了一种特异性强、快速简便的纳米荧光探针标记沙门氏菌的方法，所述方法包括将纳米荧光探针(inps)表面的马来酰亚胺基团与经还原剂处理后的沙门氏菌表面的巯基化学交联，所述inps包括亲水性外壳、中间层和疏水性内壳，所述亲水性外壳含有两性化合物，所述中间层含有单层脂类分子，所述疏水性内壳含有近红外光热转换试剂和疏水性多聚物；所述两性化合物穿插于所述中间层形成疏水性外壳；所述近红外光热转换试剂吸附在疏水性多聚物上，形成疏水性内壳。
[0009]
优选地，所述两性化合物为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-羧基聚乙二醇(dspe-peg)或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰胺(dspe-peg-mal)，优选为dspe-peg-mal；优选地，所述单层脂类分子包括卵磷脂脂或脑磷脂，优选为植物卵磷脂，进一步优选为大豆卵磷脂。
[0010]
优选地，所述外壳包括大豆卵磷脂和dspe-peg-mal，两者质量比为2：3。
[0011]
优选地，所述近红外光热转换试剂包括吲哚菁绿(icg)、金纳米棒、碳纳米管中任一一种或多种，优选为icg；优选地，所述疏水性多聚物选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)、聚乳酸、聚己内酯，优选为plga。
[0012]
优选地，所述inps还包括化疗药物，所述化疗药物吸附于两性化合物的脂端及单层脂类分子上；优选地，所述化疗药物包括阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、去甲长春花碱、铂类药物中任一一种或多种。
[0013]
优选地，所述沙门氏菌为沙门氏菌yb1菌株；优选地，所述还原剂为三(2-羧乙基)膦 (tcep)。
[0014]
本发明还提供了一种inps的制备方法，包括如下步骤：
[0015]
(1)将大豆卵磷脂乙醇溶液和dspe-peg-mal乙醇溶液以2：3的质量比混合，卵磷脂和 dspe-peg-mal总重量为plga总重量的15％；
[0016]
(2)icg 4％乙醇溶液加入2ml 4％乙醇溶液中；
[0017]
(3)将步骤(1)和(2)溶液混合，得到混合液，用超声破碎仪超声分散所述混合液5 分钟；
[0018]
(4)在步骤(3)所述超声过程中，将plga丙酮溶液逐滴滴入所述混合溶液中，形成纳米探针分散液；
[0019]
(5)将步骤(4)所述纳米探针分散液转移到3500kda的透析袋中透析浓缩，得到纯化的inps。
[0020]
优选地，所述的纳米荧光探针标记沙门氏菌的方法，包括如下步骤：
[0021]
(1)制备inps；
[0022]
(2)将密度为10
7-108cfu/ml的沙门氏菌收集在离心管中，在3500rpm重力下离心；
[0023]
(3)将沙门氏菌重悬于20-30mm tcep的pbs溶液中，在37℃下孵育20-120分钟；
[0024]
(4)用pbs洗涤细菌两次；
[0025]
(5)将1ml步骤(1)制备的inps加入到步骤(4)所得的沙门氏菌中，在37℃下孵育 20-120分钟；
[0026]
(6)离心洗涤，即得纳米荧光探针标记的沙门氏菌。
[0027]
本发明还提供了上述任一方法制备的纳米荧光探针标记的沙门氏菌。
[0028]
本发明还提供了上述沙门氏菌在制备或筛选治疗和/或预防肿瘤相关药物中的应用。
[0029]
本发明的技术原理及有益效果：
[0030]
本发明公开了一种特异性强、快速简便的沙门氏菌纳米荧光标记方法，旨在提供一种制备工艺简单、性质稳定的获得人工沙门氏菌的方法，实现对人工沙门氏菌载体有效的荧光示踪。本发明选择安全性高、厌氧靶向性强的沙门氏菌yb1作为细菌生物载体，采用还原剂三 (2-羧乙基)膦(tcep)将沙门氏菌yb1外膜蛋白表面上的二硫键(s-s)温和还原为巯基 (sh)；然后，将富含游离-sh的沙门氏菌yb1与负载近红外荧光染料icg且表面带有马来酰亚胺基团(mal)的磷脂-聚合物纳米探针(inps)进行化学交联，构建具有荧光成像能力的yb1-inps。本发明所述的方法快速简便，安全高效，将纳米荧光探针inps稳定地标记到沙门氏菌yb1表面，能够避免因交叉交联降低纳米探针与细菌表面反应的效率，所得 yb1-inps能够满足基础研究及临床上对跟踪、监测细菌及实时评估肿瘤治疗效果的切实需求。
附图说明
[0031]
图1为yb1、经tcep处理后的yb1和yb1-inps表面巯基的数量(a)及yb1和yb1-inps 的sem图(b)。
[0032]
图2为纳米荧光探针inps和经纳米荧光标记的沙门氏菌yb1-inps的荧光光谱图。
具体实施方式
[0033]
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。
[0034]
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035]
实施例1
[0036]
采用一步超声法制备inps。首先，将大豆卵磷脂乙醇溶液(10mg/ml，12μl)和 dspe-peg-mal乙醇溶液(10mg/ml，18μl)以2：3的质量比混合(卵磷脂和dspe-peg-mal 总重量为plga总重量的15％)，icg 4％乙醇溶液(1mg/ml，1ml)加入2ml 4％乙醇溶液中。然后，采用vcx130超声破碎仪以20khz的频率和130w的功率超声分散上述混合液5分钟，并在超声过程中，将plga丙酮溶液(4mg/ml，0.5ml)逐滴滴入上述混合溶液中，形成纳米探针分散液。最后，将纳米探针分散液转移到3500kda的透析袋中透析浓缩，即得到纯化的inps。
[0037]
将密度为108cfu/ml的沙门氏菌yb1收集在离心管中，在3500rpm重力下离心，重悬于30mm tcep的pbs溶液中。然后将细菌在37℃下孵育20分钟后，用pbs洗涤细菌两次。随后将1ml的inps加入到108cfu/ml细菌中在37℃下孵育2小时，离心洗涤，获得 yb1-inps。
[0038]
实施例2
[0039]
采用一步超声法制备inps。首先，将大豆卵磷脂乙醇溶液(10mg/ml，12μl)和 dspe-peg-mal乙醇溶液(10mg/ml，18μl)以2：3的质量比混合(卵磷脂和dspe-peg-mal 总重量为plga总重量的15％)，icg 4％乙醇溶液(0.8mg/ml，1ml)加入2ml 4％乙醇溶液中。然后，采用vcx130超声破碎仪以20khz的频率和130w的功率超声分散上述混合液5分钟，并在超声过程中，将plga丙酮溶液(4mg/ml，0.5ml)逐滴滴入上述混合溶液中，形成纳米探针分散液。最后，将纳米探针分散液转移到3500kda的透析袋中透析浓缩，即得到纯化的inps。
[0040]
将密度为107cfu/ml的沙门氏菌yb1收集在离心管中，在3500rpm重力下离心，重悬于20mm tcep的pbs溶液中。然后将细菌在37℃下孵育20分钟后，用pbs洗涤细菌两次。随后将1ml的inps加入到107cfu/ml细菌中在37℃下孵育2小时，离心洗涤，获得 yb1-inps。
[0041]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。