CD19-CD20双特异性和双通道CAR-T及其使用方法与流程

cd19-cd20双特异性和双通道car-t及其使用方法


背景技术：

[0001]
t细胞是一种淋巴细胞，在细胞介导的免疫中起核心作用。它们通过在细胞表面存在t细胞受体(tcr)而与其他淋巴细胞(例如b细胞和自然杀伤细胞(nk细胞))区分开来。一旦激活，这些细胞迅速增殖并分泌调节免疫应答的细胞因子。记忆t细胞是t细胞的亚群，长期持续存在并对它们的关联抗原产生应答，从而为免疫系统提供针对过去的感染和/或肿瘤细胞的“记忆”。
[0002]
可以对t细胞进行基因工程改造，以在其表面上产生称为嵌合抗原受体(car)的特殊受体。将t细胞特异性重定向至期望肿瘤相关抗原(taa)的car(eshhar z等，1993)被工程化以仅在接触taa后才激活t细胞的存活、连续杀伤和细胞因子产生(savoldo b等，2011)。car t细胞的过继转移可以在某些患者中获得持久的完全响应；成功的结果与car t细胞的移植和长期持续存在相关(porter dl等，2015)。持续存在car t细胞产生的长期免疫监视可能是在过继细胞治疗(act)中获得持久响应的关键。记忆t细胞亚群似乎沿着分化的梯度存在，其特征在于长寿和效应子功能的相互潜力。实际上，鼠和非人灵长类动物模型中衍生自中枢记忆(tcm)或初始(tn)t细胞亚群的过继转移效应器cd8+t细胞表现出增加的治疗潜力。因此，与未成熟分化状态相对应的t细胞亚群因其提供卓越临床效用的潜力而是有吸引力的(berger c等，2008；hinrichs cs等，2011)。
[0003]
t记忆干细胞(tscm)是迄今为止鉴定出的分化程度最低的记忆t细胞亚群，可以在特定的离体培养条件下产生(例如il-7、il-15或靶向代谢或发育途径的小分子)(cieri n等，2013；gattinoni l等，2011；sabatino m等，2016)。这种记忆亚群具有最高的自我更新能力和治疗潜力。由于在没有抗原驱动刺激的情况下具有卓越的持久性，tscm被认为是抗原在免疫应答中被清除后，t细胞记忆的主要前体(lugli e等，2013)。此外，仅有输注产品中cd8+cd45ra+ccr7+tscm样细胞的频率与cd19特异性car t细胞的扩增相关(xu y等，2014)。由于tscm仅占外周血单核细胞(pbmc)的一小部分(2-3％)，因此制造适用于人类应用的tscm的策略是必不可少的，并且正在开发中。
[0004]
内源性和施用的t细胞通过常见的细胞因子受体γ链接受促生存信号，例如由il-2和il-7介导的那些信号，独立于天然或引入的免疫受体。常见的γ链(γc)(或cd132)，也称为白细胞介素2受体亚基γ或il-2rg，是一种细胞因子受体亚基，其对于至少六种不同的白细胞介素受体的受体复合物是常见的：il-2、il-4、il-7、il-9、il-15和il-21受体。γc糖蛋白是在大多数淋巴细胞(白细胞)群体上表达的ⅰ型细胞因子受体家族的成员，其基因见于哺乳动物的x染色体上。该蛋白位于骨髓中未成熟造血细胞的表面。蛋白质的一端位于细胞外，在那里与细胞因子结合，蛋白质的另一端位于细胞内，在那里其将信号传递至细胞核。常见的γ链与其他蛋白质合作以指导造血细胞形成淋巴细胞(白细胞的一种)。该受体还指导淋巴细胞亚型的生长和成熟：t细胞，b细胞和自然杀伤细胞。这些细胞杀死病毒，制造抗体并帮助调节整个免疫系统。
[0005]
cd20是在所有成熟b细胞的表面表达的非糖基化磷蛋白。它在b细胞发育的所有阶段表达，除了第一个和最后一个(jungmin等，2010)。cd20由位于11号染色体上的基因编码。
它是参与激活后b淋巴细胞的生长调节的信号转导复合物的组件(thomas e tedder等，1994)。cd20在调节b细胞增殖和分化中起重要作用。因此，它是重要的b细胞表面抗原，可以作为b细胞恶性肿瘤免疫治疗的有效靶点(daming shan等，1998)。具有人γ-1和κ恒定区以及鼠可变区的嵌合抗体利妥昔单抗识别cd20并已被证明对b细胞非霍奇金淋巴瘤(nhl)患者的治疗有效(thomas a.davis等，1999)。显然，靶向cd20以及其他有效的免疫靶标可以成为通向癌症免疫治疗的有效方法。
[0006]
迄今为止的临床试验表明嵌合抗原受体(car)t细胞在对标准化学疗法有抗性的血液系统恶性肿瘤中具有广阔的前景。最值得注意的是，cd19特异性car(cd19-car)t细胞疗法已取得了令人瞩目的结果，包括b细胞恶性肿瘤的长期缓解(kochenderfer jn等，2010；kalos m等，2011；porterdl等，2011；grupp sa等，2013；kochenderfer jn等，2013；maude sl等，2014)。
[0007]
迄今为止，当前的工作集中在证实在各种b细胞恶性肿瘤中具有功效的car t细胞。虽然使用cd19-car的b-all的初始缓解率通常约为90％，但这些中的大多数在一年内复发。复发至少部分是由于抗原逃逸。因此，靶向单一抗原具有免疫逃逸的风险，这可以通过靶向多种期望抗原来克服，特别是在具有更高肿瘤异质性的实体瘤中。因此，仍然需要改进的基于嵌合抗原受体的疗法，其允许更有效、安全和效率地靶向各种各样的癌症，例如b细胞相关恶性肿瘤(all，cll和nhl)、多发性骨髓瘤、aml、淋巴瘤以及许多其他实体瘤。


技术实现要素：

[0008]
本发明提供了用于治疗癌症及其他疾病的组合物和方法。癌症可以是血液学恶性肿瘤、实体瘤、原发性或转移性肿瘤。
[0009]
在本发明的另一方面，本发明的分离的多核苷酸包含编码第一多肽的第一基因，该第一多肽包含第一抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、icos的共刺激信号传导结构域、和cd3-ζ信号传导结构域；和编码第二多肽的第二基因，其中所述第二多肽包含第二抗原结合结构域、铰链区，跨膜结构域、4-1bb的共刺激信号传导结构域，和cd3-ε/cd3-ζ信号传导结构域；其中所述第一和第二抗原结合结构域结合癌细胞上的不同抗原。在优选的实施方式中，多核苷酸还包含编码2a肽的第三核酸序列以连接两个基因。在优选的实施方式中，第一和第二基因还包含编码信号肽的核酸序列。
[0010]
在本发明的另一方面，诱导型自杀基因通过编码2a肽的核酸序列连接至多核苷酸。
[0011]
在本发明的另一方面，所述第一多肽包含靶向靶cd19的抗原识别结构域。此外，所述第二多肽包含靶向靶cd20的抗原识别结构域。
[0012]
在本发明的另一方面，所述第一多肽包含靶向靶cd20的抗原识别结构域。此外，所述第二多肽包含靶向靶cd19的抗原识别结构域。
[0013]
在本发明的另一方面，工程化细胞是t细胞(cd4和cd8 t细胞)或nk细胞(nkt和nk92细胞)。
[0014]
在一些实施方式中，所述多肽包含选自seq id no:6、16、17、18、19、39、41、43和45的序列。在一些实施方式中，所述多肽包含seq id no:6和16两者。在一些实施方式中，所述多肽包含seq id no:6和17两者。在一些实施方式中，所述多肽包含seq id no:18。在一些
实施方式中，所述多肽包含seq id no:19。在一些实施方式中，所述多肽包含seq id no:39。在一些实施方式中，所述多肽包含seq id no:41。在一些实施方式中，所述多肽包含seq id no:43。在一些实施方式中，所述多肽由seq id no:43组成。在一些实施方式中，所述多肽包含seq id no:45。在一些实施方式中，所述多肽由seq id no:45组成。在本发明的另一方面，提供了分离的多核苷酸，其编码具有选自seq id no:25、35、36、37、38、40、42、44和46的序列的上述多肽(seq id no:6、16、17、18、19、39、41、43和45)。
[0015]
在本发明的另一方面，t细胞可以用慢病毒载体转导以表达具有或不具有膜结合融合蛋白的多信号传导嵌合抗原受体(car)系统。
[0016]
在本发明的另一方面，编码所述多个多肽亚基的基因可以使用2a肽基因(包括t2a、p2a、e2a或f2a)连接至单个载体构建体。
[0017]
在本发明的另一方面，跨膜结构域可以衍生自天然或合成来源。在来源为天然的情况下，结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白(即，至少包含其跨膜区)，例如t细胞受体的α、β、ε或ζ链，cd28，cd3，cd45，cd4，cd5，cd8，cd9，cd16，cd22，cd33，cd37，cd64，cd80，cd86，cd134，cd137，cd154。优选实施方式的跨膜区可以衍生自具有seq id no:22或32的序列的人源。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。任选地，短寡或多肽接头，优选长度在2至10个氨基酸之间，可形成car的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供了特别合适的接头。
[0018]
在本发明的另一方面，本发明的car的细胞质结构域或者否则是细胞内信号传导结构域负责其中已放置car的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的激活。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可包含信号传导基序，其被称为免疫受体酪氨酸基激活基序或itam。在本发明中特别使用的包含初级细胞质信号传导序列的itam包括衍生自cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。特别优选的是，本发明car中的细胞质信号传导分子包含衍生自cd3ζ或cd3ε的细胞质信号传导序列。
[0019]
在本发明的另一方面，提供了包括用于施用的细胞的组合物，包括药物组合物和制剂，例如单位剂量形式的组合物，其包括用于以给定剂量或其分数施用的数量的细胞。药物组合物和制剂通常包含一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方式中，组合物包含至少一种另外的治疗剂。
[0020]
在本发明的另一方面，施用细胞、群体和组合物以治疗或预防疾病、病症和紊乱(包括癌症)的方法，以及这样的细胞、群体和组合物治疗或预防疾病、病症和紊乱(包括癌症)的用途。在一些实施方式中，例如通过过继细胞疗法(例如过继t细胞疗法)将细胞、群体和组合物施用于患有特定疾病或病症的待治疗受试者或患者。在一些实施方式中，将通过提供的方法制备的细胞和组合物(例如工程化组合物以及孵育和/或其他加工步骤后的生产结束产物)施用于受试者，例如患有疾病或病症或处于疾病或病症的风险的受试者。在一些方面，方法由此治疗例如疾病或病症的一种或多种症状，例如通过减轻表达被工程化t细胞识别的抗原的癌症中的肿瘤负担。
附图说明
[0021]
在附图中示出了示例性实施方式。旨在将本文公开的实施方式和附图视为说明性
而非限制性的。
[0022]
图1是双特异性cd19/cd20双car的示意图。该双特异性car由(从n端到c端)以下组成：引导cd19-car定位至细胞膜的信号序列、cd19 scfv，然后是间隔子(例如igg8铰链区)、跨膜结构域(icos的跨膜结构域)、一个共刺激结构域(icos的细胞质结构域)，和cd3ζ链的细胞质结构域。cd20可通过自裂解肽(例如p2a或t2a)连接至cd19-car。引导cd20-car定位到细胞膜的信号序列、cd20 scfv、然后是间隔子(igg8铰链区)、跨膜结构域(cd8的跨膜结构域)、一个共刺激结构域(4-1bb的细胞质结构域)，和cd3ζ或cd3ε链的细胞质结构域。
[0023]
图2是显示在与表达cd19的k562细胞靶细胞共孵育4小时后，单cd19、单cd20和cd19/cd20双car-t细胞造成的细胞裂解的图。报告的值是一式三份的平均值，误差线表示一个标准偏差。car特性如本文所述。
[0024]
图3是显示在与表达cd20的k562细胞靶细胞共孵育4小时后，单cd19、单cd20和cd19/cd20双car-t细胞造成的细胞裂解的图。报告的值是一式三份的平均值，误差线表示一个标准偏差。car特性如本文所述。
[0025]
图4显示了cd19/cd20双car t细胞的体内功效。携带raji异种移植物的nsg小鼠中的肿瘤进展。生物发光成像在治疗前(基线)以及治疗后第7、14、21、28、35和42天进行。结果表明与对照组和单car组相比，cd19/cd20双car显著抑制体内肿瘤生长。
具体实施方式
[0026]
结合旨在是示例性和说明性而非限制范围的系统、组合物和方法来描述和说明以下实施方式及其方面。
[0027]
定义
[0028]
如在本文中所使用的术语“包含”或“包含”是指对实施方式有用的组合物，方法和其相应的一个或多个组分，还对包含未指定的要素开放，无论是否有用。通常，本领域技术人员将理解本文中所使用的术语通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应该解释为“至少具有”，术语“包括”应解释为“包括但不限于”等等)。
[0029]
除非另有说明，否则在描述本申请的特定实施方式的上下文中使用的术语“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”以及类似的指示(尤其是在权利要求的上下文中)可以被解释为涵盖单数和复数两者。本文中数值范围的记载仅旨在用作单独指代落入该范围内的每个单独数值的简写方法。除非本文另外指出，否则每个单独的数值都被并入说明书中，就好像在本文中被单独记载一样。除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。相对于本文的某些实施方式提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本申请，而不向以其他方式要求保护的本申请的范围施加限制。缩写“例如”源自拉丁文示例性，并在本文中用于指示非限制性实例。因此，缩写“例如”与术语“例如”同义。说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的要素对实施本申请必不可少。
[0030]
如在本文中所使用的术语“约”指可测量的值，例如量、持续时间等，并且包括与指定值相差
±
20％、
±
10％、
±
5％、
±
1％、
±
0.5％或
±
0.1％的变化方式。
[0031]
如在本文中所使用的术语“抗体”指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可
以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、fv、fab和f(ab)，以及单链抗体和人源化抗体(harlow等,1999.in:using antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,ny:harlow等,1989,in:antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor,n.y.:houston等,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85:5879 5883；bird等,1988,science242:423-426)。
[0032]
如在本文中所使用的术语“抗原”或“ag”被定义为引起免疫应答的分子。免疫应答可涉及抗体产生，或特定免疫活性细胞的激活，或两者。技术人员将理解任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组dna或基因组dna。本领域技术人员将理解包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna因此编码如本文中所使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见，本发明包括但不限于一个以上基因的部分核苷酸序列的使用，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发期望的免疫应答。此外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见，抗原可以合成产生或可以来源于生物样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
[0033]
如在本文中所使用的术语“抗肿瘤作用”指可以通过肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、转移瘤数量减少、寿命预期增加，或与癌症状况相关的各种生理症状改善来表现的生物学作用。“抗肿瘤作用”也可以通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体预防肿瘤初始发生的能力来表现。
[0034]
如在本文中所使用的术语“自体的”是指衍生自同一个体，且随后将其重新引入该个体的任何物质。
[0035]“同种异体的”指衍生自相同物种的不同动物的移植物。
[0036]“异种的”指衍生自不同物种的动物的移植物。
[0037]
如在本文中所使用的术语“癌症”定义为特征在于异常细胞快速且不受控制地生长的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
[0038]“编码”指多核苷酸中核苷酸的特定序列的固有性质。例如基因、cdna或mrna，用作在生物过程中其他聚合物和大分子的合成的模板，具有确定的核苷酸序列(即rrna、trna和mrna)或确定的氨基酸序列，以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于基因的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mran序列相同且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cdna的转录模板)两者可称为编码该基因或cdna的蛋白质或其他产物。
[0039]“同源的”指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列的两者中的一个位置被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个dna分子的每个中的一个位置被腺嘌呤占据，则该分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置数除以所比较的位置数
×
100的函数。例如如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，那么两个序列是60％同源。举例来说，
dna序列attgcc和tatggc具有50％的同源性。通常，当比对两个序列以给出最大同源性时进行比较。
[0040]
如在本文中所使用的术语“共刺激配体”包括在抗原呈递细胞(例如apc、树突状细胞、b细胞和其他免疫细胞)上的分子，其特异性结合t细胞上的关联共刺激分子，从而提供信号，该信号除了通过例如tcr/cd3复合物与载有肽的mhc分子结合提供的初级信号外，还介导t细胞响应，包括但不限于增殖、激活、分化等。共刺激配体可包括但不限于cd7、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1、pd-l2、4-1bbl、ox40l、诱导型共刺激配体(icos-l)、细胞间粘附分子(icam)、cd30l、cd40、cd70、cd83、hla-g、mica、micb、hvem、淋巴毒素β受体、3/tr6、ilt3、ilt4、hvem，与toll配体受体结合的激动剂或抗体以及与b7-h3特异性结合的配体。共刺激配体还包括尤其是与t细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，例如但不限于cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7 light、nkg2c、b7-h3和与cd83特异性结合的配体。
[0041]“共刺激分子”或“共刺激受体”指t细胞上的关联结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导t细胞的共刺激响应，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于mhc i类分子、btla、toll配体受体。共刺激分子还包括非天然工程化蛋白。
[0042]
如在本文中所使用的“共刺激信号”指与初级信号例如tcr/cd3连接结合，导致t细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
[0043]
术语“刺激”是指通过刺激性分子(例如tcr/cd3复合物)与其关联配体结合诱导的初级响应，从而介导信号转导事件，例如但不限于，通过tcr/cd3复合物进行信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，例如tgf-b的下调，和/或细胞骨架结构的重组，等等。
[0044]
如在本文中所使用的术语“刺激性分子”指t细胞上与抗原呈递细胞上存在的关联刺激性配体特异性结合的分子。
[0045]
如在本文中所使用的“刺激性配体”指当存在于抗原呈递细胞(例如apc、树突状细胞、b细胞等)上时可以与t细胞上的关联结合配偶体(在本文中称为“刺激性分子”)特异性结合，从而介导t细胞的初级应答，包括但不限于激活、免疫应答的启动、增殖等的配体。刺激性配体在本领域中是众所周知的，并且包括，尤其是，载有肽的mhc i类分子、抗cd3抗体、超激动剂抗cd28抗体，和超激动剂抗cd2抗体。
[0046]“载体”是包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语也应解释为包括有助于核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物，脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于慢病毒、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。非病毒载体的实例包括但不限于crispr载体系统、sleeping beauty转座子系统等。
[0047]
如在本文中所使用的“激活”指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的t细胞的状态。激活还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“激活的t细胞”尤其指正在进行细胞分裂的t细胞。
[0048]
如在本文中所使用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且指包含通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽的序列的最大氨基酸数没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个
或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如在本文中所使用的该术语指短链(其在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚体)和较长链(其在本领域中通常称为蛋白质，其中有很多类型)两者，“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
[0049]
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”在全文中可互换使用，包括dna分子(例如cdna或基因组dna)、rna分子(例如mrna)、使用核苷酸类似物产生的dna或rna的类似物(例如肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)，及其杂合物。核酸分子可以是单链或双链的。术语“基因”指编码具有功能的分子的dna或rna的序列。
[0050]
术语“结合蛋白”包括天然蛋白结合结构域(例如细胞因子、细胞因子受体)、抗体片段(例如fab、scfv、双抗体、可变区衍生的结合体、vhh纳米抗体)、替代支架衍生的蛋白质结合结构域(例如fn3变体、锚蛋白重复变体、centyrin变体、avimer、亲和体)或任何识别特定抗原的蛋白质。
[0051]“信号肽”。本发明的共刺激分子或car可以包含信号肽，使得当共刺激分子或car在例如t细胞的细胞内表达时，初生蛋白被定向至内质网并随后定向至在那里表达它的细胞表面。信号肽的核心可包含一长段疏水性氨基酸，其具有形成单个α-螺旋的倾向。信号肽可以以一小段带正电荷的氨基酸开始，这有助于在转运过程中实施多肽的适当拓扑。在信号肽的末端，通常是一段被信号肽酶识别和切割的氨基酸。信号肽酶可在易位过程中或完成后裂解，以生成游离信号肽和成熟蛋白。然后游离信号肽被特异性蛋白酶消化。信号肽可以是在分子的氨基末端。
[0052]
本发明提供了用于治疗癌症及其他疾病的组合物和方法。癌症可以是血液学恶性肿瘤、实体瘤、原发性或转移性肿瘤。
[0053]
在一个实施方式中，本发明的分离的多核苷酸包含编码第一多肽的第一基因，其中所述第一多肽包含第一抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、icos的共刺激信号传导区域，和cd3-ζ信号传导结构域，和编码第二多肽的第二基因，其中所述第二多肽包含第二抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、4-1bb的共刺激信号传导结构域，和cd3-ε信号传导结构域；其中第一和第二抗原结合结构域结合癌细胞上的不同抗原。在优选的实施方式中，多核苷酸还包含编码2a肽的第三核酸序列以连接两个基因。在优选的实施方式中，第一和第二基因还包含编码信号肽的核酸序列。
[0054]
在另一个实施方式中，本发明的分离的多核苷酸包含编码第一多肽的第一基因，其中所述第一多肽包含抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、icos的共刺激信号传导区域，和cd3-ζ信号传导结构域，和编码第二多肽的第二基因，其中所述第二多肽包含另外的抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、4-1bb的共刺激信号传导区域，和cd3-ζ信号传导结构域。在优选的实施方式中，多核苷酸还包含编码2a肽的第三核酸序列以连接两个基因。在优选的实施方式中，第一和第二基因还包含编码信号肽的核酸序列。
[0055]
在另一个实施方式中，上述多核苷酸连接至诱导型自杀基因。
[0056]
在另一个实施方式中，诱导型自杀基因通过编码2a肽的核酸序列连接至上述多核苷酸。
[0057]
在一些实施方式中，所述第一多肽包含靶向靶cd19的抗原识别结构域。此外，所述
第二多肽包含靶向靶cd20的抗原识别结构域。
[0058]
在另一个实施方式中，所述第一多肽包含靶向靶cd20的抗原识别结构域。此外，所述第二多肽包含靶向靶cd19的抗原识别结构域。
[0059]
在一些实施方式中，工程化细胞是t细胞(cd4和cd8t细胞)或nk细胞(nkt和nk92细胞)。
[0060]
在一些实施方式中，包含编码双car的多核苷酸的工程化细胞可用于治疗前列腺癌，其中一个car包含靶向psca的抗原识别结构域；并且另一个car包含靶向psma的抗原识别结构域。
[0061]
在一些实施方式中，抗原结合结构域是scfv或vhh纳米抗体。
[0062]
在一些实施方式中，所述工程化细胞通过基因敲除方法包含pd-1、tim3或lag3的失活基因。
[0063]
在一些实施方式中，工程化细胞是工程化t细胞或工程化nk细胞。
[0064]
在一些实施方式中，所述工程化t细胞是cd4 t细胞或cd8 t细胞。
[0065]
在一些实施方式中，所述工程化nk细胞是nk t细胞或nk-92细胞。
[0066]
在一些实施方式中，所述多肽包含选自seq id no:6、16、17、18、19、39、41、43和45的序列。在一些实施方式中，所述多肽包含seq id no:6和16两者。在一些实施方式中，所述多肽包含seq id no:6和17两者。在一些实施方式中，所述多肽包含seq id no:18。在一些实施方式中，所述多肽包含seq id no:19。在一些实施方式中，所述多肽包含seq id no:39。在一些实施方式中，所述多肽包含seq id no:41。在一些实施方式中，所述多肽包含seq id no:43。在一些实施方式中，所述多肽由seq id no:43组成。在一些实施方式中，所述多肽包含seq id no:45。在一些实施方式中，所述多肽由seq id no:45组成。
[0067]
在一些实施方式中，与选自seq id no:6、16、17、18、19、39、41、43和45的序列相比，所述多肽具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
[0068]
本文还提供了编码上述多肽(seq id no:6、16、17、18、19、39、41、43和45)的多核苷酸，其可以具有选自seq id no：25、35、36、37、38、40、42、44和46的序列。
[0069]
在一些实施方式中，可以用慢病毒载体转导t细胞以表达具有或不具有膜结合融合蛋白的多信号传导嵌合抗原受体(car)系统，其中所述慢病毒载体包含编码选自多肽a和多肽b的多种多肽的分离的多核苷酸，其中多肽a包含以下中的五个或更多个：(i)信号肽，(ii)第一结合蛋白，(iii)铰链区，(iv)跨膜结构域，(v)由icos组成的共刺激结构域，和(vi)衍生自cd3ζ信号传导结构域的tcr亚基，及其组合；并且其中多肽b包含以下中的五个或更多个：(i)信号肽，(ii)第二结合蛋白，(iii)铰链区，(iv)跨膜结构域，(v)41bb的共刺激结构域，和(vi)衍生自cd3ζ或cd3ε信号传导结构域的tcr亚基，及其组合。在一些实施方式中，铰链区域是任选的。
[0070]
在一些实施方式中，载体是选自腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体的病毒载体。在一些其他实施方式中，载体是选自crispr载体系统和sleeping beauty转座子系统的非病毒载体。
[0071]
在一些实施方式中，可以使用包括t2a、p2a、e2a或f2a的2a肽基因将编码所述多个多肽亚基的基因连接到单个载体构建体中。
[0072]
在本发明的另一个实施方式中，工程化免疫细胞包含编码针对b淋巴细胞抗原的工程化膜结合单链可变片段(scfv)的分离的多核苷酸分子，其中工程化膜结合b细胞抗原包括(i)信号肽，(ii)单链可变片段(scfv)，(iii)铰链区，(iv)跨膜结构域，(v)icos的共刺激结构域，和(vi)cd3-ζ信号传导结构域。
[0073]
在本发明的另一个实施方式中，工程化免疫细胞包含编码针对b淋巴细胞抗原的工程化膜结合单链可变片段(scfv)的分离的多核苷酸分子，其中工程化膜结合b细胞抗原包含(i)信号肽，(ii)单链可变片段(scfv)，(iii)铰链区，(iv)跨膜结构域，(v)41bb的共刺激结构域，和(vi)cd3ε信号传导结构域。
[0074]
在本发明的另一个实施方式中，工程化免疫细胞包含编码针对b淋巴细胞抗原的工程化膜结合单链可变片段(scfv)的分离的多核苷酸分子，其中工程化膜结合b细胞抗原包含(i)信号肽，(ii)单链可变片段(scfv)，(iii)铰链区，(iv)跨膜结构域，(v)41bb的共刺激结构域，和(vi)cd3ζ信号传导结构域。
[0075]
在一些实施方式中，单链可变片段(scfv)抗原是针对cd19，其中工程化t细胞产生能够识别在b细胞表面表达的cd19蛋白的膜结合融合蛋白，但不是异常t细胞增殖。用car表达针对cd19的scfv的t细胞保留tscm样表型的记忆潜力。
[0076]
在一些实施方式中，单链可变片段(scfv)抗原是针对cd20，其中工程化t细胞产生能够识别在b细胞表面表达的cd20蛋白的膜结合融合蛋白，但不是异常t细胞增殖。用car表达针对cd20的scfv的t细胞保留tscm样表型的记忆潜力。
[0077]
在一些实施方式中，单链可变片段(scfv)抗原是针对cd19和cd20两者，其中工程化t细胞产生能够识别在b细胞表面表达的cd19和cd20蛋白的膜结合融合蛋白，但不是异常t细胞增殖。用car表达针对cd19和cd20的scfv的t细胞保留tscm样表型的记忆潜力。
[0078]
在另一个实施方式中，工程化免疫细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码第一多肽的第一基因和编码第二多肽的第二基因，其中所述第一多肽包含(i)信号肽，(ii)结合蛋白，(iii)铰链区，(iv)跨膜结构域，(v)icos的共刺激信号传导结构域，和(vi)cd3ζ信号传导结构域；并且所述第二多肽包含(i)信号肽，(ii)免疫调节细胞因子或细胞因子受体的细胞外结构域，(iii)铰链区，(iv)跨膜结构域，(v)4-1bb的共刺激信号传导结构域，和(vi)cd3ε信号传导结构域；其中结合蛋白结合癌细胞上的抗原；其中第一基因和第二基因通过编码2a肽的基因连接。
[0079]
在另一个实施方式中，工程化免疫细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码第一多肽的第一基因和编码第二多肽的第二基因，其中所述第一多肽包含(i)信号肽，(ii)结合蛋白，(iii)铰链区，(iv)跨膜结构域，(v)icos的共刺激信号传导结构域，和(vi)cd3ζ信号传导结构域；并且所述第二多肽包含(i)信号肽，(ii)免疫调节细胞因子或细胞因子受体的细胞外结构域，(iii)铰链区，(iv)跨膜结构域，(v)4-1bb的共刺激信号传导结构域，和(vi)cd3ζ信号传导结构域；其中结合蛋白结合癌细胞上的抗原；其中第一基因和第二基因通过编码2a肽的基因连接。
[0080]
在优选的实施方式中，本发明提供了表达各自包含细胞外和细胞内结构域的两个嵌合抗原受体(car)的单一载体。car的细胞外结构域包含靶标特异性结合元件或者否则称为抗原结合部分。细胞内结构域或者否则是细胞质结构域包含共刺激信号传导区域和ζ或ε链部分。在car的细胞外结构域和跨膜结构域之间，或在car的细胞质结构域和跨膜结构域
之间，可以引入铰链结构域。如在本文中所使用的术语“铰链结构域”通常指起将跨膜结构域连接至多肽链中的细胞外结构域或细胞质结构域的功能的任何寡或多肽。铰链结构域可包含至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。铰链区(“h”)可以是单个或多个h1或h2(seq id no:2或12)。
[0081]
跨膜结构域可以衍生自天然或合成来源。在来源为天然的情况下，该结构域可衍生自任何膜结合或跨膜蛋白(即至少包含其跨膜区)，例如t细胞受体的α、β、ε或z链，cd28，cd3，cd45，cd4，cd5，cd8，cd9，cd16，cd22，cd33，cd37，cd64，cd80，cd86，cd134，cd137，cd154。优选实施方式的跨膜区可以衍生自具有seq id no:22或32的序列的人源。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。任选地，短寡或多肽接头，优选长度在2至10个氨基酸之间，可形成car的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供了特别合适的接头。
[0082]
本发明的car的细胞质结构域或者否则是细胞内信号传导结构域负责激活其中已放置car的免疫细胞的正常效应子功能的至少一种。术语“效应子功能”指细胞的专门功能。t细胞的效应子功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此术语“细胞内信号传导结构域”指蛋白质的一部分，其转导效应子功能信号并指导细胞执行专门的功能。尽管通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这样的截短部分可以代替完整链使用，只要其转导效应子功能信号即可。因此术语细胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
[0083]
初级细胞质信号传导序列以刺激方式或抑制方式调节tcr复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可包含信号传导基序，其被称为免疫受体酪氨酸基激活基序或itam。
[0084]
在本发明中特别使用的包含初级细胞质信号传导序列的itam的实例包括衍生自cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。特别优选地，本发明的car中的细胞质信号传导分子包含衍生自cd3ζ或cd3ε的细胞质信号传导序列。
[0085]
在优选的实施方式中，可以将car的细胞质结构域设计为与在本发明的car的上下文中有用的任何其他期望的细胞质结构域结合的包含cd3ζ链(cd3-ζ)或cd3ε链(cd3-ε)信号传导结构域。例如，car或任何其他共刺激分子的细胞质结构域可包含cd3ζ链部分和共刺激信号传导区域。共刺激信号传导区指包含共刺激分子的胞内结构域的car的一部分。共刺激分子是除初级抗原受体或其配体以外、淋巴细胞针对抗原的有效应答所需的细胞表面分子。这样分子的实例包括cd27、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和与cd83特异性结合的配体等。优选地，本发明的car中的共刺激信号传导元件或共刺激分子是4-1bb和/或icos。并且特别优选的是，细胞质结构域包含icos/cd3-ζ或4-1bb/cd3-ε或4-1bb/cd3-ζ的组合。
[0086]
在另一个实施方式中，多共刺激信号car t细胞还包含诱导型自杀基因。
[0087]
具有单个载体的多基因共表达的策略包括多个启动子，融合蛋白，基因之间的蛋白水解切割位点，内部核糖体进入位点，和“自切割”2a肽的使用。2a肽是18-22个氨基酸(aa)长的病毒寡肽，其在真核细胞中的翻译过程中介导多肽的“切割”。名称“2a”指病毒基因组的特定区域，并且不同的病毒2a通常根据其衍生的病毒来命名。最早发现的2a是f2a
(口蹄疫病毒)，其后还鉴定了e2a(马甲鼻炎病毒)、p2a(猪捷申病毒-1 2a)和t2a(thosea asigna病毒2a)。最近发现2a介导的“自切割”的机制是核糖体跳过在2a的c端的糖基-脯氨酰肽键的形成。(donnelly，m.l.等，2001)。
[0088]
合成了编码新car系统的dna，并将其克隆到慢病毒载体中。这些载体质粒将在质量控制下在293t细胞中制造成成熟的慢病毒颗粒，并将用包含我们的新car结构的慢病毒转导t细胞或其他免疫细胞，例如从患者的pbmc中分离的nk或nk t细胞。转导的免疫细胞将在生物反应器中生长和扩增约10天以达到治疗数量。在质量控制放行后，这些表达car的免疫细胞将被输注回到患者中用于医疗用途。
[0089]
本公开还提供了细胞、细胞群以及包含所述细胞和群的组合物(包括药物和治疗组合物)，例如通过所提供的方法产生的细胞和群，以及方法，例如用于施用所述细胞和组合物至受试者如患者的治疗方法。
[0090]
还提供了包括用于施用的细胞的组合物，包括药物组合物和制剂，例如包括用于以给定剂量或其分数施用的数量的细胞的单位剂量形式组合物。药物组合物和制剂通常包含一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方式中，组合物包含至少一种另外的治疗剂。
[0091]
术语“药物制剂”指形式为允许其中所含活性成分的生物活性有效，并且不包含对将要施用该制剂的受试者有不可接受的毒性的另外组分的制备物。
[0092]“药学上可接受的载体”指药物制剂中除活性成分之外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0093]
在一些方面，载体的选择部分地由特定细胞和/或施用方法来确定。因此，存在多种合适的制剂。例如，药物组合物可包含防腐剂。合适的防腐剂可包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以组合物总重量的约0.0001重量％至约2重量％的量存在。载体描述于例如remington's pharmaceutical sciences第16版，osol,a.ed.(1980)。药学上可接受的载体通常在使用的剂量和浓度下对受体无毒，并包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵(hexamethonium chloride)；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；盐形成抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(peg)。
[0094]
在一些方面，缓冲剂包括在组合物中。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以组合物总重量的约0.001重量％至约4重量％的量存在。制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性的方法在例如remington:the science and practice of pharmacy,lippincott williams&wilkins；第21版(2005年5月1日)中更详细描述。
[0095]
制剂可以包括水溶液。制剂或组合物还可包含多于一种可用于正在用细胞治疗的
特定适应症、疾病或病症的活性成分，优选具有与细胞互补的活性的那些，其中各自的活性不会彼此不利地影响。这样的活性成分合适地以对于预期目的有效的量组合存在。因此，在一些实施方式中，药物组合物还包含其他药物活性剂或药物，例如化学治疗剂例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/或长春新碱。
[0096]
在一些实施方式中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量的细胞，例如治疗有效量或预防有效量。在一些实施方式中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。可以通过单次推注施用细胞、多次推注施用细胞，或连续输注施用细胞来递送期望剂量。
[0097]
细胞和组合物可以使用标准施用技术、制剂和/或装置来施用。细胞的施用可以是自体的或异源的。例如免疫应答细胞或祖细胞可以从一个受试者获得，并施用于相同受试者或不同的、相容的受试者。外周血衍生的免疫应答细胞或其后代(例如体内、离体或体外衍生的)可以通过局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉注射或肠胃外施用。当施用治疗组合物(例如包含遗传修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制为单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳剂)。
[0098]
制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌内、鼻内、颊、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施方式中，细胞群是肠胃外施用的。如在本文中所使用的术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方式中，细胞通过静脉内，腹膜内或皮下注射施用使用外周全身递送而施用至受试者。
[0099]
在一些实施方式中，组合物作为无菌液体制备物提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳剂、分散液或粘性组合物，其在某些方面可以缓冲至选定的ph。液体制备物通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物在某种程度上更方便施用，尤其是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制以提供与特定组织更长的接触时间。液体或粘性组合物可包含载体，其可以是溶剂或分散介质，包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
[0100]
无菌可注射溶液可以通过将细胞引入溶剂中来制备，例如与合适的载体、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合。组合物可以包含辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、ph缓冲剂、胶凝或增粘添加剂、防腐剂、矫味剂和/或颜色，这取决于施用途径和期望制备物。在某些方面，可以参考标准文本以制备合适的制备物。
[0101]
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。微生物作用的预防可以通过各种抗细菌和抗真菌剂来确保，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸。可注射药物形式的延长吸收可通过使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
[0102]
用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌性可以通过例如经过无菌滤膜过滤而容易地实现。
[0103]
还提供了施用细胞、群体和组合物以治疗或预防疾病，病症和紊乱(包括癌症)的方法，以及这样的细胞、群体和组合物治疗或预防疾病，病症和紊乱(包括癌症)的用途。在一些实施方式中，将细胞、群体和组合物施用于患有特定疾病或病症的待治疗受试者或患
者，例如通过过继细胞疗法(例如过继t细胞疗法)。在一些实施方式中，将通过提供的方法制备的细胞和组合物(例如工程化组合物和孵育和/或其他加工步骤后的生产末端产物)施用于受试者，例如患有疾病或病症或处于疾病或病症风险的受试者。在一些方面，方法由此治疗例如疾病或病症的一种或多种症状，例如通过减轻表达被工程化t细胞识别的抗原的癌症中的肿瘤负担。
[0104]
用于过继细胞疗法的细胞施用方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继性t细胞疗法的方法在例如gruenberg等的美国专利申请公开号2003/0170238；rosenberg的美国专利号4,690,915；rosenberg(2011)nat rev clin oncol.8(10):577-85)中描述。参见例如themeli等(2013)nat biotechnol.31(10):928-933；tsukahara等(2013)biochem biophys res commun 438(1):84-9；davila等(2013)plos one 8(4):e61338。
[0105]
如在本文中所使用的“受试者”是哺乳动物，例如人或其他动物，并且通常是人。在一些实施方式中，向其施用细胞、细胞群或组合物的受试者例如患者是哺乳动物，通常是灵长类动物例如人。在一些实施方式中，灵长类动物是猴子或猿。受试者可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成人和老年受试者。在一些实施方式中，受试者是非灵长类哺乳动物，例如啮齿动物。
[0106]
如在本文中所使用的“治疗”(及其语法变化，例如“治疗”或“治疗”)指完全或部分改善或减轻疾病或病症或紊乱，或与之相关的症状、不良作用或结果或表型。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的减轻、疾病的任何直接或间接病理后果的减轻、预防转移、降低疾病进展速度、缓解或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。这些术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或后果的影响。
[0107]
如在本文中所使用的“延缓疾病的发展”是指推迟、阻碍、减缓、阻滞、稳定、抑制和/或延迟疾病(例如癌症)的发展。该延缓可以具有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。对本领域技术人员显而易见的是，足够或明显的延迟实际上可以包括预防，因为个体不发生该疾病。例如，晚期癌症例如转移的发展可能被延迟。
[0108]
如在本文中所使用的“预防”包括针对可易患疾病但尚未被诊断患有该疾病的受试者中该疾病的发生或复发提供预防。在一些实施方式中，提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。
[0109]
如在本文中所使用的“抑制”功能或活性是指当与相同条件(除感兴趣的条件或参数)相比时，或者与另外的条件相比时，降低功能或活性。例如，抑制肿瘤生长的细胞与在该细胞不存在下的肿瘤的生长速率相比降低肿瘤的生长速率。
[0110]
在施用的上下文中，试剂(例如药物制剂、细胞或组合物)的“有效量”指在必要的剂量/量和时间段下，有效达到期望结果例如治疗或预防结果的量。
[0111]
试剂(例如药物制剂或细胞)的“治疗有效量”指在必要的剂量和时间段下，有效达到期望治疗效果(例如用于治疗疾病、病症、或紊乱，和/或治疗的药代动力学或药效学作用)的量。治疗有效量可以根据例如疾病状态、受试者的年龄、性别和体重以及所施用的细胞群等因素而变化。在一些实施方式中，提供的方法包括以有效量例如治疗有效量施用细胞和/或组合物。
[0112]“预防有效量”指在必要的剂量和时间段下，有效达到期望预防结果的量。通常但
不是必须的，因为在疾病之前或早期在受试者中使用预防剂量，所以预防有效量将小于治疗有效量。在较低肿瘤负荷的情况下，在某些方面中预防有效量将高于治疗有效量。
[0113]
在一些实施方式中，细胞疗法例如过继性t细胞疗法通过自体转移进行，其中从要接受细胞疗法的受试者或衍生自这样的受试者的样品中分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，细胞衍生自需要治疗的受试者例如患者，并且细胞在分离和加工后施用于同一受试者。
[0114]
在一些实施方式中，细胞疗法例如过继性t细胞疗法通过同种异体转移进行，其中从除了要接受或最终接受细胞疗法的受试者例如第一受试者以外的受试者中分离和/或以其他方式制备细胞。在这样的实施方式中，然后将细胞施用给相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方式中，第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方式中，第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方式中，第二受试者表达与第一受试者相同的hla类别或超类型(supertype)。
[0115]
在一些实施方式中，在施用细胞或含有细胞的组合物之前，受试者已经用靶向疾病或病症例如肿瘤的治疗剂治疗。在一些方面，受试者对其他治疗剂是难治的或无响应的。在一些实施方式中，受试者患有持续性或复发性疾病，例如，在用另一种治疗性干预治疗后，包括化学疗法、放射和/或造血干细胞移植(hsct)，例如同种异体hsct。在一些实施方式中，尽管受试者已经变得对另外的疗法有抗性，但施用仍有效地治疗受试者。
[0116]
在一些实施方式中，受试者对另外的治疗剂有反应，并且用该治疗剂进行的治疗减少了疾病负担。在一些方面，受试者最初对治疗剂有反应，但是随着时间的推移表现出疾病或病症的复发。在一些实施方式中，受试者尚未复发。在一些这样的实施方式中，确定受试者处于复发风险中，例如处于高复发风险中，并且因此预防性地施用细胞，例如以减少复发可能性或预防复发。
[0117]
在一些方面，受试者未接受用另外的治疗剂进行的前治疗。
[0118]
在用提供的组合物、细胞、方法和用途治疗的疾病、病症和紊乱中的是肿瘤，包括实体瘤、血液学恶性肿瘤和黑素瘤，和传染性疾病，例如病毒或其他病原体感染，例如hiv、hcv、hbv、cmv，和寄生虫病。在一些实施方式中，疾病或病症是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、瘤，或其他增生性疾病或病症。这样的疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤、例如慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性成淋巴细胞白血病(all)、非霍奇金淋巴瘤、急性髓样白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性b细胞淋巴瘤、b细胞恶性肿瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌和脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺腺癌、霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、尤因肉瘤、髓母细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤和/或间皮瘤。
[0119]
在一些实施方式中，以期望剂量施用细胞，其在某些方面包括期望剂量或数量的细胞或细胞类型和/或期望比率的细胞类型。因此，在一些实施方式中，细胞的剂量是基于细胞的总数(或每千克体重的数量)和个体群体或亚型的期望比率，例如cd4+与cd8+的比率。在一些实施方式中，细胞的剂量是基于个体群体中的细胞或个体细胞类型的期望总数(或每千克体重的数量)。在一些实施方式中，剂量是基于这样的特征的组合，例如个体群体中期望数量的总细胞，期望的比率，和期望总数量的细胞。
[0120]
在一些实施方式中，细胞的群体或亚型，例如cd8+和cd4+t细胞，以总细胞的期望
个t细胞或其一定误差范围内施用。在一些实施方式中，细胞以约108至10
12
之间或约10
10
至10
11
个t细胞之间，约108至10
12
之间或约10
10
至10
11
个cd4+细胞之间，和/或约108至10
12
之间或约10
10
至10
11
个cd8+细胞之间，或其一定误差范围内施用。
[0127]
在一些实施方式中，细胞以多种细胞群体或亚型，例如cd4+和cd8+细胞或亚型的期望输出比率或其容忍范围内施用。在一些方面，期望比率可以是特定比率或可以是比率范围。例如，在一些实施方式中，期望的比率(例如，cd4+与cd8+细胞的比率)在处于或约5:1与处于或约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)，或处于或约1:3与处于或约3:1之间(或大于约1:3与小于约3:1)，例如处于或约2:1与处于或约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1，例如处于或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5)。在一些方面，允许差异在期望比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％内，包括在这些范围之间的任何值。
[0128]
为了疾病的预防或治疗，适当的剂量可取决于待治疗疾病的类型，细胞或重组受体的类型，疾病的严重程度和病程，是否出于预防或治疗目的施用细胞，过往治疗，受试者的临床病史和对细胞的应答，以及主治医师的判断。在一些实施方式中，将组合物和细胞一次或通过一系列治疗适当地施用于受试者。
[0129]
细胞可以通过任何合适的方式来施用，例如通过推注，通过注射，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、会阴下注射、结膜下注射、眼球筋膜囊下(sub-tenon)注射、球后注射、球周注射，或后近巩膜(posterior juxtascleral)递送。在一些实施方式中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内施用，并且如果局部治疗是期望的，则通过病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一些实施方式中，给定剂量通过单次推注施用细胞来施用。在一些实施方式中，其通过多次推注施用细胞来施用，例如，在不超过3天的期间，或通过连续输注施用细胞来施用。
[0130]
在一些实施方式中，将细胞作为联合治疗的一部分施用，例如与另外的治疗干预措施同时或以任何顺序相继进行，例如抗体或工程化细胞或受体或试剂，例如细胞毒性或治疗剂。在一些实施方式中，同时或以任何顺序相继地，将细胞与一种或多种另外的治疗剂或者与另外的治疗性干预相关地共施用。在某些情况下，将细胞与另外的疗法在时间上足够接近地共施用，使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的作用，反之亦然。在一些实施方式中，细胞在一种或多种另外的治疗剂之前施用。在一些实施方式中，细胞在一种或多种另外的治疗剂之后施用。在一些实施方式中，一种或多种另外的试剂包括细胞因子，例如il-2，以增强持久性。在一些实施方式中，方法包括化学治疗剂的施用。
[0131]
在施用细胞后，在一些实施方式中，工程化细胞群体的生物活性通过例如许多已知方法中的任一种来测量。评估的参数包括在体内例如通过成像或在离体例如通过elisa或流式细胞术评估的工程化或天然t细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合。在某些实施方式中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可使用本领域已知的任何合适方法来测量，例如描述于如kochenderfer等，j.immunotherapy，32(7)：689-702(2009)，和herman等，j.immunological methods，285(1)：25-40(2004)中的细胞毒性测定法。在某些实施方式
中，细胞的生物活性通过测定一种或多种细胞因子例如cd107a、ifnγ、il-2和tnf的表达和/或分泌来测量。在一些方面，生物活性通过评估临床结果例如肿瘤负荷或负荷的降低来测量。
[0132]
在某些实施方式中，以多种方式进一步修饰工程化细胞，从而增加其治疗或预防功效。例如，群体表达的工程化car或tcr可以通过接头直接或间接偶联至靶向部分。将化合物例如car或tcr偶联至靶向部分的实践是本领域已知的。参见例如wadwa等，j.drugtargeting3:111(1995)和美国专利no.5,087,616。
[0133]
在一些实施方式中，提供了重复剂量方法，其中给予第一剂量的细胞，然后给予一个或多个第二连续剂量。当以过继治疗方法施用于受试者时，通常设计细胞的多剂量的时机和大小以增加表达抗原的t细胞(例如表达car的t细胞)的功效和/或活性和/或功能。在一些实施方式中，重复给药减少了当抑制性免疫分子例如pd-1和/或pd-l1在表达抗原的例如表达car的t细胞上被上调时可发生的下调或抑制活性。方法包括施用第一剂量，通常随后是一个或多个连续剂量，并且在不同剂量之间具有特定的时间范围。
[0134]
在过继细胞疗法的背景下，给定“剂量”的施用包括作为单一组合物和/或单次不间断施用(例如，作为单次注射或连续输注)的给定量或数量的细胞的施用，并且还包括在指定的时间段(不超过3天)中，以多个个体组合物或输注提供的给定量或数量的细胞数量作为分次剂量的施用。因此，在某些情况下，第一或连续剂量是在单个时间点给予或启动的指定数量细胞的单次或连续施用。然而，在某些情况下，第一或连续剂量在不超过三天的时间段内以多次注射或输注施用，例如三天或两天、每天一次，或在一天时间内多次输注。
[0135]
因此，在一些方面，第一剂量的细胞以单一药物组合物施用。在一些实施方式中，连续剂量的细胞以单一药物组合物施用。
[0136]
在一些实施方式中，第一剂量的细胞以多个组合物施用，其共同包含第一剂量的细胞。在一些实施方式中，连续剂量的细胞以多个组合物施用，其共同包含连续剂量的细胞。在一些方面，另外的连续剂量可以在不超过3天的时间段内以多个组合物施用。
[0137]
术语“分次剂量”指拆分使得其在超过一天施用的剂量。这种类型的给药包括在本方法中并且被认为是单剂量。
[0138]
因此，在一些方面，第一剂量和/或连续剂量可以作为分次剂量施用。例如，在一些实施方式中，剂量可在2天或3天内施用于受试者。分次给药的示例性方法包括在第一天施用25％的剂量并在第二天施用剩余75％的剂量。在其他实施方式中，可在第一天施用第一剂量的33％并在第二天施用剩余的67％。在一些方面，在第一天施用10％的剂量，在第二天施用30％的剂量，并在第三天施用60％的剂量。在一些实施方式中，分次剂量不在超过3天分布。
[0139]
关于在先剂量例如第一剂量，术语“连续剂量”指在先前(例如，第一)剂量之后向相同受试者施用的剂量，而在其间没有向该受试者施用任何中间剂量。但是，该术语不包括在包含在单个分次剂量内的一系列输注或注射中的第二、第三等等注射或输注。因此，除非另有说明，否则在一天，两天或三天的时间内的第二次输注不被视为如在本文中所使用的“连续”剂量。同样，就“连续”剂量的意义而言，在分次剂量内的一系列多次剂量中的第二、第三等等也不被视为“中间”剂量。因此，除非另有说明，否则在开始第一或在先剂量后超过三天的一定时间段内施用的剂量被视为“连续”剂量，即使受试者在第一剂量开始后接受了
第二或后续细胞注射或输注，只要第二或后续注射或输注发生在第一或在先剂量开始后的三天时间内。
[0140]
因此，除非另有说明，否则在至多3天的时间内多次施用相同细胞被视为单个剂量，并且在初次施用的3天内施用细胞不被视为连续剂量，也不出于确定第二剂量是否与第一剂量“连续”的目的而被视为是中间剂量。
[0141]
在一些实施方式中，在一些方面使用与关于第一剂量和第一连续剂量之间的时机的相同时机指南来给予多个连续剂量，例如通过施用第一和多个连续剂量，在一段时间内给予每个连续剂量，其中抑制性免疫分子例如cd19和/或cd20已因施用的第一剂量在受试者的细胞中上调。凭经验确定何时提供连续剂量是在技术人员的水平内，例如通过评估来自外周血或其他体液的表达car的细胞中的cd19和/或cd20表达水平。
[0142]
在一些实施方式中，第一剂量和第一连续剂量之间，或第一和多个连续剂量之间的时机，使得在大于约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天或更多天的时间内给予每个连续剂量。在一些实施方式中，在施用第一或紧邻在先剂量后少于约28天的时间段内给予连续剂量。另外的多个另外连续剂量或剂量也称为后续剂量或后续连续剂量。
[0143]
第一和/或一个或多个连续剂量的细胞的大小通常设计成提供改善的功效和/或降低的毒性风险。在一些方面，第一剂量或任何连续剂量的剂量或大小是如上所述的任何剂量或量。在一些实施方式中，第一剂量或任何连续剂量中的细胞数量是约0.5
×
106细胞/kg受试者体重与5
×
106细胞/kg受试者体重之间，约0.75
×
106细胞/kg受试者体重和3
×
106个细胞/kg受试者体重之间，或约1
×
106个细胞/kg受试者体重和2
×
106个细胞/kg受试者体重之间，包括两端值。
[0144]
如在本文中所使用的“第一剂量”用于描述在施用连续或后续剂量之前的给定剂量的时机。该术语不一定意味着受试者此前从未接受过一定剂量的细胞疗法，或甚至受试者此前从未接受过一定剂量的相同细胞或表达相同重组受体或靶向相同抗原的细胞。
[0145]
在一些实施方式中，由连续剂量中的细胞表达的受体，例如car，包含至少一个免疫反应性表位作为由第一剂量的细胞表达的受体例如car。在一些方面，由连续剂量施用的细胞表达的受体例如car与由第一剂量表达的受体例如car相同或与由第一剂量中施用的细胞表达的受体例如car基本上相同。
[0146]
由以各种剂量施用于受试者的细胞表达的重组受体，例如car，通常识别或特异性结合待治疗的疾病或病症或其细胞中表达、与之相关和/或特异性的分子。与分子例如抗原特异性结合后，受体通常将免疫刺激信号如itam转导信号递送至细胞中，从而促进靶向疾病或病症的免疫应答。例如，在一些实施方式中，第一剂量的细胞表达与疾病或病症的细胞或组织表达的或与疾病或病症相关的抗原特异性结合的car。
[0147]
表1car-结构/系统和car的结构域的多肽和编码多核苷酸确定的代表性序列
[0148]
[0149][0150]
实施例
[0151]
实施例1.细胞毒性测定
[0152]
将以1104个细胞/孔接种到96孔板的靶细胞(cd19-k562或cd20-k562细胞)与效应细胞以不同的效应物与靶标(e:t)比率在不含酚红且含5％fbs的完全培养基中共孵育4小
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[0181]
序列表
[0182]
在以下列表中，对于每个加上标题的实体，上面的序列是氨基酸序列，下面的序列是编码核酸序列。
[0183]
sp1
[0184]
氨基酸序列,seq id no:1
[0185][0186]
dna序列,seq id no:20
[0187][0188]
铰链1
[0189]
氨基酸序列,seq id no:2
[0190][0191]
dna序列,seq id no:21
[0192][0193]
tm 1
[0194]
氨基酸序列,seq id no:3
[0195][0196]
dna序列,seq id no:22
[0197][0198]
icos细胞内结构域
[0199]
氨基酸序列,seq id no:4
[0200][0201]
dna序列,seq id no:23；
[0202]
tgctggctgacaaagaaaaagtactccagctccgtgcacgaccctaacggagagtac
[0203]
atgttcatgagggccgtcaacacagccaagaaaagcaggctgacagacgtcaccctc
[0204]
cd3ζ
[0205]
氨基酸序列,seq id no:5
[0206][0207]
dna序列,seq id no:24；
[0208][0209][0210]
信号1结构:tm1+icos+cd3z
[0211]
氨基酸序列,seq id no:6
[0212][0213]
dna序列,seq id no:25
[0214][0215]
t2a
[0216]
氨基酸序列,seq id no:7
[0217][0218]
dna序列,seq id no:26
[0219][0220]
p2a
[0221]
氨基酸序列,seq id no:8
[0222][0223]
dna序列,seq id no:27
[0224][0225]
e2a
[0226]
氨基酸序列,seq id no:9
[0227][0228]
dna序列,seq id no:28
[0229][0230]
f2a
[0231]
氨基酸序列,seq id no:10
[0232][0233]
dna序列,seq id no:29
[0234][0235]
sp3
[0236]
氨基酸序列,seq id no:11
[0237][0238]
dna序列,seq id no:30
[0239][0240]
铰链2
[0241]
氨基酸序列,seq id no:12
[0242][0243]
dna序列,seq id no:31
[0244]
acaaccacacccgctcccaggccccctacccctgcccctaccattgcctcccaacccctcagcctcagacctgaagcctgtaggcccgctgccggaggcgctgtgcataccaggggcctcgattttgcctgtgat
[0245]
tm2
[0246]
氨基酸序列,seq id no:13
[0247][0248]
dna序列,seq id no:32
[0249]
atctacatttgggctcccctcgccggaacctgcggagtgctcctgctc
[0250]
agcctcgtgattaccctctactgc
[0251]
41bb细胞内结构域
[0252]
氨基酸序列,seq id no:14
[0253][0254]
dna序列,seq id no:33
[0255][0256]
cd3ε信号结构域
[0257]
氨基酸序列,seq id no:15
[0258][0259]
dna序列,seq id no:34
[0260][0261]
信号2结构:tm2+41bb+cd3ε
[0262]
氨基酸序列,seq id no:16
[0263][0264]
dna序列,seq id no:35
[0265]
atctacatttgggctcccctcgccggaacctgcggagtgctcctgctcagcctcgtgattaccctctactgcaagaggggcaggaagaagctcctgtacattttcaagcagcctttcatgaggcccgtccagacaacccaggaggaggacggatgctcctgcaggttccctgaggaagaggaaggcggatgcgaactgaaaaacaggaaggctaaggctaagcctgtgacaagaggagccggagccggaggcaggcagaggggccagaacaaggagaggccccctcccgtccccaaccctgactacgagcctatcaggaagggacagagggacctctactccggcctcaaccaaagaaggatcatt
[0266]
信号3结构:tm2+41bb+cd3ζ
[0267]
氨基酸序列,seq id no:17
[0268]
[0269][0270]
dna序列,seq id no:36
[0271]
atctacatttgggctcccctcgccggaacctgcggagtgctcctgctcagcctcgtgattaccctctactgcaagaggggcaggaagaagctcctgtacattttcaagcagcctttcatgaggcccgtccagacaacccaggaggaggacggatgctcctgcaggttccctgaggaagaggaaggcggatgcgaactgagagtcaagttctccagatccgccgacgctcccgcttacaagcagggacagaaccagctctacaacgagctcaacctcggcaggagagaggaatacgacgtcctggacaagaggagaggaagagaccctgagatgggaggcaagcccagaaggaagaaccctcaggagggactgtacaacgagctccagaaggacaaaatggctgaggcttactccgagattggcatgaagggagagaggagaaggggcaagggacacgacggactgtaccagggactgtccaccgctaccaaggacacatacgacgctctgcacatgcaggctctgcctcccagg
[0272]
人源化抗-cd19 scfv
[0273]
氨基酸序列,seq id no:18
[0274][0275][0276]
dna序列,seq id no:37
[0277]
gacattcagatgacacagtccccctccagcctcagcgctagcgtcggcgacagggtgacaatcacatgcagggcctcccaggacattagcaagtacctcaactggtatcagcagaagcctggcaaggctcccaagctcctcatctaccacacaagcaggctgcactccggcgtcccctccagattcagcggctccggctccggcacagactacacactgacaatctccagcctccagcctgaggacttcgctacctactactgccagcagggaaacacactgccctacacattcggaggc
ggaaccaaggtcgagattaagggaagcacctccggcggcggcagcggaggcggaagcggcggaggaggctccagccaggtccagctccaggagtccggccctggcctcgtgaagcctagccagacactgtccctgacatgcacagtgtccggcgtcagcctccccgactacggagtgtcctggattagacagcctcccggaaagggactggagtggctcggcgtcatctggggaagcgagacaacctactacaactccgccctcaagtccagactcaccattagcagggacaactccaagaacacactgtacctccagatgaactccctgagggccgaggacacagccgtctactactgcgctaagcactactactacggaggctcctacgctatggactactggggacagggaaccacagtgacagtgtccagcaccacaacccctgcccctagacctcccacacccgctcccacaatcgctagccagcctctgtccctgaggcccgaggcctgcagacctgccgctggcggagccgtccacacaagaggactggacttcgcttgcgacttctggctccccattggctgcgctgccttc
[0278]
人源化抗-cd20 scfv
[0279]
氨基酸序列,seq id no:19
[0280]
eivltqspatlslspgeratmtcrasssvnymdwyqqkpgqaprpwiyatsnlasgvparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqwsfnpptfgggtkveikgstsgggsgggsggggssqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsynmhwvrqapgqglewigaiypgngdtsynqkfkgkatltrdtststvymelsslrsedtavyycarsnyygssywffdvwgqgttvtvss
[0281]
dna序列,seq id no:38
[0282]
gaaatcgtgctcactcaatcccctgcaaccctttcccttagccctggagaacgggccacaatgacttgtagagcttctagctccgtgaactatatggactggtatcaacagaaacctggacaggctcctagaccttggatctacgccacttctaatcttgcttctggcgtgcctgccagattctctggaagcggatctggcacagacttcacactgaccatcagctctcttgagcctgaggactttgccgtgtattactgccagcaatggagctttaatcctcctaccttcggcggaggaaccaaagtggagatcaagggctccacaagcggaggaggctccggcggaggctccggaggcggcggaagctcccaagtgcaactggttcagtctggcgctgaggtgaagaaacctggagctagcgtgaaagtgtcctgtaaagctagcggctacacattcacatcttataatatgcattgggtgaggcaggctcctggccagggactggaatggataggagctatctatcctgggaacggagataccagctataaccagaaattcaagggaaaggctacactcacaagagatacctctaccagcacagtgtatatggagctgtctagccttagatccgaggacacagctgtttattactgtgccagaagcaattactacggctccagctattggtttttcgatgtgtggggacaaggcactaccgtcacagtttctagc
[0283]
全人源化抗-cd19单car
[0284]
氨基酸序列,seq id no:39
[0285][0286][0287]
dna序列,seq id no:40
[0288][0289][0290]
全人源化抗-cd20单car(氨基酸序列:seq id no:41；多核苷酸:seq id no:42)
[0291]
seq id no:41
[0292][0293][0294]
seq id no:42
[0295][0296][0297]
全人源化抗-cd19/抗-cd20双信号和双car，具有cd3ε信号结构域((氨基酸序列:seq id no:43；多核苷酸:seq id no:44)
[0298]
氨基酸序列,seq id no:43
[0299]
[0300]
[0301][0302]
dna序列,seq id no:44
[0303]
atggagaccgataccctcctgctctgggtcctgctcctgtgggtccccggaagcacaggcgacattcagatgacacagtccccctccagcctcagcgctagcgtcggcgacagggtgacaatcacatgcagggcctcccaggacattagcaagtacctcaactggtatcagcagaagcctggcaaggctcccaagctcctcatctaccacacaagcaggctgcactccggcgtcccctccagattcagcggctccggctccggcacagactacacactgacaatctccagcctccagcctgaggacttcgctacctactactgccagcagggaaacacactgccctacacattcggaggcggaaccaaggtcgagattaagggaagcacctccggcggcggcagcggaggcggaagcggcggaggaggctccagccaggtccagctccaggagtccggccctggcctcgtgaagcctagccagacactgtccctgacatgcacagtgtccggcgtcagcctccccgactacggagtgtcctggattagacagcctcccggaaagggactggagtggctcggcgtcatctggggaagcgagacaacctactacaactccgccctcaagtccagactcaccattagcagggacaactccaagaacacactgtacctccagatgaactccctgagggccgaggacacagccgtctactactgcgctaagcactactactacggaggctcctacgctatggactactggggacagggaaccacagtgacagtgtccagcaccacaacccctgcccctagacctcccacacccgctcccacaatcgctagccagcctctgtccctgaggcccgaggcctgcagacctgccgctggcggagccgtccacacaagaggactggacttcgcttgcgacttctggctccccattggctgcgctgccttcgtcgtggtctgcattctgggatgcattctgatttgctggctgacaaagaaaaagtactccagctccgtgcacgaccctaacggagagtacatgttcatgagggccgtcaacacagccaagaaaagcaggctgacagacgtcaccctcagagtcaagttctccagatccgccgacgctcccgcttacaagcagggacagaaccagctctacaacgagctcaacctcggcaggagagaggaatacgacgtcctggacaagaggagaggaagagaccctgagatgggaggcaagcccagaaggaagaaccctcaggagggactgtacaacgagctccagaaggacaaaatggctgaggcttactccgagattggcatgaagggagagaggagaaggggcaagggacacgacggactgtaccagggactgtccaccgctaccaaggacacatacgacgctctgcacatgcaggctctgcctcccaggggctccggcgagggcaggggaagtcttctaacatgcggggacgtggaggaaaatcccggcccaatggctctgcctgtgacagccctgctcctgcccctcgccctgctcctccacgctgccaggcccgagattgtgctcacccagtcccccgctaccctcagcctca
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[0304]
全人源化抗-cd19/抗-cd20双信号和双car，具有cd3ζ信号结构域(氨基酸序列:seq id no:45；多核苷酸:seq id no:46)
[0305]
氨基酸序列:seq id no:45:
[0306]
[0307][0308][0309]
多核苷酸:seq id no:46
[0310]
[0311]