一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法与流程

本发明属于禽病学研究领域，具体涉及一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法及其应用。

背景技术：

2型鸭疫里默氏菌可侵害雏鸭、雏鹅、雏火鸡，引起的特征性病变是肝周炎、心包炎和腹膜炎等，俗称传染性浆膜炎。1932年发现，现在仍然在全世界流行，也是危害我国水禽养殖的常见细菌病之一。氟喹诺酮类药物（诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星等）属第三代喹诺酮类，由于其抗菌谱广、抗菌活性高、组织穿透性强等特点，广泛应用于治疗家禽的全身性感染，在国内兽医临床的使用量仅次于β内酰胺类抗生素。近年来，2型鸭疫里默氏菌对氟喹诺酮类药物的耐药性多有报道，如何快速测定该细菌对氟喹诺酮类药物的敏感性、指导药物的选择显得非常迫切。细菌对氟喹诺酮类药物耐药的机制有多种，其中dna促旋酶（氟喹诺酮类药物的作用靶点）的突变是重要原因之一。

前期研究发现，2型鸭疫里默氏菌的dna促旋酶a亚基基因的喹诺酮类药物耐药决定区（quinoloneresistance-determiningregion,qrdr）第247-249位碱基，如果由agc突变为atc，则该细菌对氟喹诺酮类药物肯定耐药。基于此特征，本发明设计一对引物跨过qrdr的该差异性位点，建立pcr方法，对其进行扩增，两类细菌（指对氟喹诺酮类药物耐药或不耐药的2型鸭疫里默氏菌）的pcr扩增产物均为548bp。由于该扩增区域内核苷酸序列存在ecorv酶限制性片段长度差异，由agc突变为atc会导致该区域的增加一个ecorv酶位点（gat↓atc）。也就是说，该细菌对氟喹诺酮类药物不耐药的菌株（此处为gatagc）pcr产物可以被ecorv酶酶切为大小不变（仍然是548bp）；而该细菌对氟喹诺酮类药物耐药的菌株（此处为gat↓atc），其pcr产物pcr产物被ecorv酶酶切为不同的两段（442bp和106bp）。该方法的敏感性和pcr相当，仅仅只需对pcr产物进行额外ecorv酶酶切（无需对产物进行胶回收）后再进行电泳，简单实用、无需进行药敏试验、方便快捷，当前尚未见基于类似原理的鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法的报道，本研究可填补相关研究领域空白。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法，该方法的敏感性和pcr相当，仅仅只需对pcr产物进行ecorv酶酶切后再进行常规琼脂糖凝胶电泳，即可根据电泳条带鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药，建立的方法简单实用、方便快捷、无需进行药敏试验，为在家禽中开展2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药提供快速检测方法，将指导临床科学用药，具有十分重要的研究意义。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的引物，所述引物序列如下：

r2f：5’-cgcgtattatttgcgatgcacgaa-3’，

r2r：5’-atccctttgcgaccattgattaat-3’。

一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法，包括以下步骤：

（1）菌株基因组提取；

（2）pcr扩增基因组；

（3）利用ecorv酶进行pcr产物酶切鉴定。

本发明的有益效果在于：本发明方法的敏感性和pcr相当，仅仅只需对pcr产物进行额外ecorv酶酶切（无需对产物进行胶回收）后再进行电泳，简单实用、无需进行药敏试验、方便快捷，当前尚未见基于类似原理的鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法的报道，本研究可填补相关研究领域空白。

附图说明

图1为pcr扩增的电泳图；其中m：dl2000分子量标准；1：r125株；2：r86株；3：dev；4：mdpv；5：ducv；6：gpv；7：灭菌去离子水。

图2为pcr扩增产物的酶切鉴定；其中m：dl2000分子量标准；1：r125株；2：r86株。

图3为纸片法药物敏感试验。

具体实施方式

实施例1

1、材料

1.1毒株和菌株

试验用菌株2型鸭疫里默氏菌r125（该菌株对氟喹诺酮类药物不耐药），鸭疫里默氏菌r86（该菌株对氟喹诺酮类药物耐药）由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。

试验用对照毒株鸭肠炎病毒（dev）、番鸭细小病毒（mdpv）、鸭圆环病毒（ducv）、鸭源鹅细小病毒（gpv）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。

1.2引物设计

根据美国国家生物技术信息中心（nationalcenterofbiotechnologyinformation，ncbi）数据库的1型鸭疫里默氏菌dna促旋酶a亚基（dnagyrasesubunita）基因，利用lasergenednastar进行核苷酸系列分析比对，利用引物设计软件oligo7.0设计一套引物，如下：

r2f：5’-atgcataaagaaggagaaa-3’，

r2r：5’-aatagcattacggtttccaa-3’。

上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

需要指出的是，在使用r2f/r2r对r125株和r86株进行扩增时，r125株和r86株的pcr产物目的条带大小均是548bp（常规琼脂糖电泳无法有效区分）。但是在该扩增区域内r125株和r86株存在特征性的ecorv酶（gat↓atc）酶切位点差异，其中r86株在该扩增区域存在gat↓atc序列（可被ecorv酶酶识别），而r125株没有（通常耐药的序列为gatagc，没有ecorv酶酶切识别位点）。

1.3主要试剂

2×transtaq-tpcrsupermix、easypureviraldna/rnakit、easypurebacteriagenomicdnakit、dna分子量标准dl2000、flycutecorv酶均购自北京全式金生物技术有限公司。

2试验方法的建立

2.1基因组dna的提取

试验对照毒株dev、mdpv、ducv、gpv按照easypureviraldna/rnakit试剂盒的方法提取相应的基因组dna，-80℃冻存备用。

r125株和r86株按照easypurebacteriagenomicdnakit试剂盒的方法提取相应的基因组dna，-80℃冻存备用。

2.2反应液的配置和退火温度的优化

按照2×transtaq-tpcrsupermix试剂盒推荐的的50μl体系进行扩增，其中2×pcrmastermix扩增反应液25μl、引物r2f/r2r（10μm）分别为1.0μl、提取的基因组dna模板为1.0μl、补充灭菌去离子水至终体积50μl，混匀后进行pcr扩增。

扩增条件为94℃预变性5min后进入循环，94℃变性30s、△t（52℃-62℃）退火30s、72℃延伸45s，30个循环结束后，72℃终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。△t（52℃-62℃）表示退火温度在此区间进行优化，经优化后的最佳退火温度为56℃。

结果可见（图1），当模板仅加入r125株时，出现大小为548bp的条带（第1泳道）；当模板仅加入r86株时，出现大小为548bp的条带（第2泳道），常规琼脂糖电泳肉眼无法区分。

2.3特异性试验

将优化后的pcr体系和扩增条件，对dev、mdpv、ducv、gpv以及灭菌去离子水对照进行扩增，均未见扩增条带，结果见图1，dev（第3泳道）、mdpv（第4泳道）、ducv（第5泳道）、gpv（第6泳道）和灭菌去离子水（第7泳道），表明建立的方法特异性强，对常见水禽病原均无交叉反应。

2.4酶切鉴定

将pcr产物利用flycutecorv酶进行酶切鉴定，酶切体系为20μl体系：其中10×flycutbuffer2μl、flycutecorv酶2μl、pcr产物10μl，补充灭菌去离子水至终体积20μl。轻轻混匀后瞬时离心，37℃水浴反应15min。结果可见图2，r86株产物有两条，大小分别为442bp和106bp（第2泳道）；r125株酶切产物大小不变，仍然是548bp（第1泳道）。说明2型鸭疫里默氏菌r125对氟喹诺酮类药物不耐药，鸭疫里默氏菌r86对氟喹诺酮类药物耐药。

2.5细菌药敏试验

纸片扩散法进行细菌的药敏试验，鸭疫里默氏菌r125对氧氟沙星的抑菌圈直径为22mm，判定为敏感；鸭疫里默氏菌r86对氧氟沙星的抑菌圈直径为11mm，判定为耐药。见图3。

3临床应用

对38份临床分离的2型鸭疫里默氏菌，提取相应的核酸dna，利用优化后的方法进行鉴定是否对氟喹诺酮类药物耐药。将其利用r2f/r2r进行pcr扩增后进行ecorv酶酶切鉴定，结果可见产物大小为548bp有11株，表明这11株均对氟喹诺酮类药物不耐药，占比28.9%；可见产物大小为442bp和106bp两个片段有27株，表明这27株均对氟喹诺酮类药物耐药，占比71.1%。和2.5中的药敏试验进行对照，结果可见经本发明的方法鉴定的27株均对氟喹诺酮类药物耐药的菌株，经药敏试验均对氟喹诺酮类药物耐药，符合率为100%；经本发明的方法鉴定的，11株均对氟喹诺酮类药物不耐药的菌株，经药敏试验均对氟喹诺酮类药物不耐药，符合率为100%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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<110>福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法

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