一种抗黑穗病薏苡种质的鉴定方法与流程

本发明涉及植物抗病性分子鉴定技术领域，尤其是一种抗黑穗病薏苡种质的鉴定方法。

背景技术：

黑穗病是威胁薏苡产业健康发展的主要病害之一，病原菌主要危害薏苡植株穗部，也可危害茎、叶，形成病瘿。感病植株发病后，穗部子房膨大成近圆形或卵圆形，内部充满黑褐色粉状物，整株颗粒无收。种植过程中选用抗黑穗病的薏苡品种不仅可以减少薏苡种植过程中农药的投入，形成有利于生态环境的薏苡种植模式，也是薏苡产业稳定发展的内在需求。黑穗病病原菌主要侵染薏苡胚芽鞘，薏苡四叶期时侵染结束，直到总苞发育时才呈现发病状态。目前种植过程中预防黑穗病的方法主要是用包衣种或热水烫种，但这两种方法均只可以消灭种子上的黑穗病病原菌，无法消除土壤中的病原菌在种子萌发后对植株的侵染，还是常有薏苡植株感染黑穗病的情况发生。

常规抗病品种选育的方法是通过病原菌菌粉拌种或者将种子播种在含有病原菌菌粉的土壤中，调查植株成熟期的发病率，根据植株发病比例确定抗病等级。该方法不足的地方是，对于田间未表现发病的植株不确实是否被病原菌侵染，其不发病的表现很可能是由于病原菌未成功侵染该植株导致，因此，通过该方法确定的免疫或者抗性薏苡材料存在一定的假阳性；而且工作量大，周期长。

目前，已有不少关于植物黑穗病的分子鉴定方法。如申请号为cn201510968582.7的专利提供了一种薏苡黑穗病菌检测的方法，在有薏苡黑穗病病症的薏苡植株上分离薏苡黑穗病病原菌，对含有薏苡黑穗病病原菌的花苞表面进行消毒，用马丁氏培养基筛选获得单孢菌落，然后用马铃薯液体培养基将单孢菌落扩大培养，获得大量的病原菌；利用ctab法提取薏苡黑穗病病原菌基因组dna，用黑粉菌属be交配型基因特异性引物be4/be8对其进行扩增，若能扩增出一条长459bp黑穗病菌特异保守序列的目的片段，则证明所分离的病菌为薏苡黑穗病病原菌。该专利公开的鉴定方法是用于已感染黑穗病薏苡植株病原菌的鉴定，并未涉及抗黑穗病植株的分子鉴定方法。

又如申请号为cn201210051544.1的专利公开了利用scar标记鉴定甘蔗抗黑穗病性方法，包括基因组dna的提取、scar-pcr标记的检测体系建立和scar-pcr产物的检测；采用的检测引物是甘蔗scar-f和scar-r，其中scar-f是5'-ctttgtttcccgtagtgtcttgt-3'，scar-r是5'-atagcctgccttctctccttt-3'。该专利公开的鉴定方法是用于甘蔗抗病性品种的鉴定。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明研究者对薏苡黑穗病瘿中的菌类进行了研究，研究表明：薏苡黑穗病瘿中存在多种真菌菌群，其中，真菌属sporisorium和ustilago为优势菌群，在ncbi数据库中查找sporisorium和ustilago线粒体全长序列，选择较为保守且常见的基因atp6设计引物，用设计的引物对田间表现正常、未出现黑穗病的薏苡植株进行检测，确定为真实抗黑穗病薏苡种质。

具体是通过以下技术方案实现的：

一种薏苡抗黑穗病种质的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)dna提取：薏苡叶片在液氮中充分研磨，取0.1g加入到0.8mlctab提取液(2％ctab，100mmtris-hcl，1.4mnacl，20mmedta，2％pvp，1％sds，ph＝8)中，65℃水浴30min，冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒数次，12000rmp4℃离心15min，取上清，再加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒数次，12000rmp4℃离心15min，取上清液，加入2/3体积预冷的异丙醇，置于-20℃20min，取出放置于常温后，用枪头挑出絮状沉淀放于1.5ml离心管中或12000rpm常温离心10min后倒出上清液，用70％乙醇洗涤dna沉淀两次，无水乙醇洗涤dna沉淀1次，风干，溶于0.5mlte溶液中；

(2)dna电泳检测：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；

(3)pcr扩增反应：pcr扩增体系为总体积50μl，内含60ngdna模板，2.5ulataq(takara)，2.0mmmgcl2，2.5mmeachdntp，0.5μmatp6-f引物，0.5μmatp6-r引物，ddh2o补足到50μl；

pcr扩增程序为：94℃for5min；94℃for30s,53℃for30s,72℃for35s，35个循环；72℃for10min；

其中，atp6-f是ggwgctaggaatcctgmaag，atp6-r是ctctaaayctaccwgtacttgg；

(4)pcr扩增产物鉴定：用1.5％琼脂糖电泳检测扩增产物，若检测到一条长为550bp的目的条带，则表明该薏苡植株已被黑穗病病原侵染，且该薏苡植株在田间未出现黑穗病，则说明该薏苡植株为抗黑穗病薏苡种质；若未检测到目的条带，则说明该薏苡植株未被黑穗病病原菌侵染。

所述步骤(4)，目的条带测序结果为：ggtctatcggtgtgccgctactgtattggcaaatagccgaactccaagtgagaaagctcgtgctaggtatgagattagctcaataggtactagtagaggtactagtcctagaggtgtacctgaaggaacgaagaatgagaagaagtgtactttgtgtagtcgtagaccaagaattgtaactccaataaagattgtcatacttagaccgatacttaccataattgatgtagctactgtaaatccgtatggtacgttaccacttaggtttgcaataaggatgaagaagaatagtgagtagataaatggtaggtacatttcgttagcagcaccaatttgtgatttaactagtccgtgtactgaagcaaaactactttctagtgagatactccatcggcttggaattagttgtttgttgttacttcccataatgtgaagtgctagtactagatatactgttagaattgtatatagtcctaggttagttagacttagattaatgtatccaagtactggtagaatttagaag

本发明的有益效果在于：

本发明针对薏苡黑穗病瘿主要的两个真菌属sporisorium和ustilago为检测对象，以在ncbi数据库中查找sporisorium和ustilago线粒体全长序列，选择较为保守且常见的基因atp6，设计简并引物(命名为atp6-f和atp6-r)。其可靠性与单检测一个病原菌属要高。本发明以薏苡叶片内总dna为鉴定材料，dna是稳定的遗传物质，不受环境因素等的影响，同时550bp目的条带的显性判断一目了然，减少了环境条件的影响和人为判断的偏差，大大提高了准确性。

本发明提供的鉴定方法可以准确鉴定那些被病原菌成功侵染、却不发病的薏苡材料，能准确地鉴定出抗黑穗病薏苡种质，且操作简便、检测时间短、稳定性好、容易判断。

附图说明

图1为已发黑穗病的薏苡病株pcr检测的琼脂糖电泳图，其中：1-1、1-2代表薏苡病株1的底部老叶和顶端嫩叶，2-1、2-2代表薏苡病株2的底部老叶和顶端嫩叶，3-1、3-2代表薏苡病株3的底部老叶和顶端嫩叶，4-1、4-2代表薏苡病株4的底部老叶和顶端嫩叶，5代表分子量标准：markerdl2000。

图2为未发黑穗病的薏苡植株pcr检测的琼脂糖电泳图，其中：1代表薏苡植株1的嫩叶，2代表薏苡植株2的嫩叶，3代表薏苡植株3的嫩叶，4代表分子量标准：markerdl2000。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例1以成熟期已发黑穗病的薏苡病株为材料

一种薏苡抗黑穗病种质的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)dna提取：薏苡叶片在液氮中充分研磨，取0.1g加入到0.8mlctab提取液(2％ctab，100mmtris-hcl，1.4mnacl，20mmedta，2％pvp，1％sds，ph＝8)中，65℃水浴30min，冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒数次，12000rmp4℃离心15min，取上清，再加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒数次，12000rmp4℃离心15min，取上清液，加入2/3体积预冷的异丙醇，置于-20℃20min，取出放置于常温后，用枪头挑出絮状沉淀放于1.5ml离心管中或12000rpm常温离心10min后倒出上清液，用70％乙醇洗涤dna沉淀两次，无水乙醇洗涤dna沉淀1次，风干，溶于0.5mlte溶液中；

(2)dna电泳检测：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；

(3)pcr扩增反应：pcr扩增体系为总体积50μll，内含60ngdna模板，2.5ulataq(takara)，2.0mmmgcl2，2.5mmeachdntp，0.5μmatp6-f引物，0.5μmatp6-r引物，ddh2o补足到50μl；

pcr扩增程序为：94℃for5min；94℃for30s,53℃for30s,72℃for35s，35个循环；72℃for10min

其中，atp6-f是ggwgctaggaatcctgmaag，atp6-r是ctctaaayctaccwgtacttgg；

(4)pcr扩增产物鉴定：用1.5％琼脂糖电泳检测扩增产物，若检测到一条长为550bp的目的条带，则表明该薏苡植株已被黑穗病病原菌侵染；若未检测到目的条带，则说明该薏苡植株未被黑穗病病原菌侵染。

pcr扩增产物鉴定结果如附图1所示，从图1中可知，薏苡病株1、2、3、4的顶端嫩叶、底部老叶的dna中都检测到目的条带；说明了已发黑穗病的薏苡病株，整株都可以检测到黑穗病病原菌。

实施例2以成熟期未发黑穗病的健康薏苡植株为材料

一种薏苡抗黑穗病种质的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)dna提取：薏苡叶片在液氮中充分研磨，取0.1g加入到0.8mlctab提取液(2％ctab，100mmtris-hcl，1.4mnacl，20mmedta，2％pvp，1％sds，ph＝8)中，65℃水浴30min，冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒数次，12000rmp4℃离心15min，取上清，再加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒数次，12000rmp4℃离心15min，取上清液，加入2/3体积预冷的异丙醇，置于-20℃20min，取出放置于常温后，用枪头挑出絮状沉淀放于1.5ml离心管中或12000rpm常温离心10min后倒出上清液，用70％乙醇洗涤dna沉淀两次，无水乙醇洗涤dna沉淀1次，风干，溶于0.5mlte溶液中；

(2)dna电泳检测：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；

(3)pcr扩增反应：pcr扩增体系为总体积50μl，内含60ngdna模板，2.5ulataq(takara)，2.0mmmgcl2，2.5mmeachdntp，0.5μmatp6-f引物，0.5μmatp6-r引物，ddh2o补足到50μl；

pcr扩增程序为：94℃for5min；94℃for30s,53℃for30s,72℃for35s，35个循环；72℃for10min

其中，atp6-f是ggwgctaggaatcctgmaag，atp6-r是ctctaaayctaccwgtacttgg；

(4)pcr扩增产物鉴定：用1.5％琼脂糖电泳检测扩增产物，若检测到一条长为550bp的目的条带，则表明该薏苡植株已被黑穗病病原菌侵染；若未检测到目的条带，则说明该薏苡植株未被黑穗病病原菌侵染。

pcr扩增产物鉴定结果如附图2所示，从图2中可知，薏苡植株1、2的嫩叶的dna中检测到目的条带，说明薏苡植株1、2已经被黑穗病病原菌浸染；薏苡植株3的嫩叶的dna中未检测到目的条带，说明薏苡植株3未被黑穗病病原菌浸染，薏苡植株1、2为抗黑穗病薏苡种质。这说明了田间表现为不感病的健康植株有些也是被病原菌侵染的，这些种质可能本身含有抗病基因，能够在病原菌已入侵的情况下正常结实，为抗黑穗病薏苡种质。

在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。

序列表

序列表sequencelisting

<110>表示贵州省亚热带作物研究所

<120>一种薏苡抗黑穗病种质的鉴定方法

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<213>人工序列

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<223>根据薏苡黑穗病病菌sporisorium和ustilago线粒体全长序列

中的保守基因而设计，以用于抗黑穗病薏苡种质的鉴定

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

2

<223>根据薏苡黑穗病病菌sporisorium和ustilago线粒体全长序列中

的保守基因而设计，以用于抗黑穗病薏苡种质的鉴定

<400>2

ctctaaayctaccwgtacttgg22

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>薏苡黑穗病病原菌dna的扩增产物，用于判断薏苡植株是否

感染黑穗病病原菌

<400>3

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