一种用于辅助治疗肿瘤恶液质的化合物及其应用的制作方法

本发明涉及一种黄酮苷类化合物，具体说是能够用于制备辅助治疗肿瘤恶液质阶段药物的化合物。

背景技术：

恶病质是绝大多数恶性肿瘤发展到晚期的一个必经阶段，癌症晚期患者中发生恶病质的几率高达80％，恶性肿瘤晚期患者死亡的主要原因与恶液质密切相关。临床主要表现为厌食、嗜睡、消瘦、贫血和三大营养物质(蛋白质、脂类、碳水化合物)代谢紊乱及电解质紊乱等。恶病质的发生机制复杂，目前仍然确定不了确切的发生机制，因此在恶液质治疗方面是缺乏有针对性的有效方案。

医学界目前公认全身慢性炎症及代谢紊乱在恶病质的发生发展中起着重要作用。恶病质状态下，机体能量需要增加，无效能量利用升高，基础代谢率增高，从而造成机体血糖含量降低，肌肉脂肪组织被大量消耗。正常机体的生命活动所需的能量通过糖类有氧呼吸方式获得，但是恶液质阶段，机体能量获取几乎完全依赖糖酵解，这是一种低效产能方式，故肿瘤会消耗大量的葡萄糖，产生低血糖现象。总体来说，恶病质状态下代谢是合成的减少与消耗的增加。

通过文献调查发现，正常动物体内存在2类细胞因子，即炎症细胞因子(如il-6,tnf-α,il-1,inf-y等)和抑炎细胞因子(如可溶性肿瘤坏死因子受体stnfr,il-1受体拮抗物il-lra,il-4,il-10,il-13,il-15等)，这两者失衡在癌症恶病质中起着关键作用^[1-3]。肿瘤细胞所处的微环境本身就是一种无菌性炎症状态，往往会因为某种或某几种炎性细胞因子的含量异常的持续增高，导致体内细胞因子网络出现严重失衡，机体长期处于慢性炎症状态，从而导致恶液质状态日趋严重。目前研究已经发现，肿瘤恶液质阶段，体内某些炎性细胞因子含量处于高含量状态，目前研究比较明确的是两种炎性细胞因子与恶液质发展和恶化关系密切。其中肿瘤坏死因子-α(tnf-α)，也称为恶病质素，是最早发现的能导致机体恶病质的细胞因子，对它的研究也最多。据报道，tnf-α可作用于下丘脑或抑制胃排空，从而使病人食欲下降，它可直接作用于脂肪组织，诱导胰岛素抵抗，刺激脂解，抑制脂肪合成。又有研究表明，在恶病质患者体内和(或)荷瘤恶病质动物体内，tnf-α表达量显著增高，而且使用针对tnf-α的单克隆抗体干预后，恶病质状态明显缓解，所以目前认为血清tnf-α是恶性肿瘤恶病质的重要诱导因素^[3-5]。当前研究很明确的还有一个细胞因子白介素-6(il-6)，与肿瘤恶液质密切相关^[5]，il-6主要由th2细胞分泌，其他还有成纤维细胞、单核巨噬细胞等分泌。动物实验表明^[6],给予大鼠注射il-6，发现大鼠骨骼肌迅速降解，这说明了il-6具有直接增强蛋白降解的作用，这可以从一个新的角度解释为什么处于恶液质阶段的肿瘤患者有进行性消瘦乃至极度消瘦的现象，而且il-6浓度与肿瘤恶液质呈正相关。另外，研究人员发现，cnt0328-il-6的单克隆抗体可通过阻断il-6的作用而起到较好的抗肿瘤恶液质的效果^[7]。

不仅如此，恶液质患者极度消瘦，体重进行性减轻，除了能量大量消耗以外，也是由于患者消化吸收机能严重下降，营养物质吸收效率低下。众多基础及临床试验表明，恶病质状态并非单纯的营养不良所致，单纯的营养支持治疗并不能阻止恶病质状况的恶化。营养物质的吸收与机体是否处于炎症状态有密切关系，tnf-α、il-6是体内非常重要的炎性细胞因子，当恶液质阶段体内炎性细胞因子含量明显持续升高状态时，意味着体内始终存在炎症状态，对消化功能造成不利影响。慢性炎症与恶液质阶段消化吸收机能之间存在着明显的关联性。

目前常用的治疗恶液质的代表药物为醋酸甲羟孕酮，其不足之处在于，多是针对实体瘤，对于改善体重、增加营养吸收能力、降低过高的细胞因子水平，并没有优势。

由以上分析可知，尽管恶病质的发生机制复杂，确切的发生机制仍不清楚，治疗方面是缺乏有效的方案，但是针对患者消瘦、营养吸收不良和高水平炎症细胞因子状态，通过减轻tnf-α、il-6水平，改善恶液质炎症状态，改善营养吸收，是减轻患者癌痛痛苦，提高生存生活质量的重要措施，目前，尚未出现通过减轻tnf-α、il-6水平，改善恶液质炎症状态，改善营养吸收的相关报道。

发明人在进行药物分子活性筛选时，偶然发现天然大麦苗中的两个黄酮苷类化合物能够有针对性降低恶液质状态下过高的tnf-α、il-6水平，同时改善由此造成的营养吸收不良，以及厌食、消瘦问题，从而发现本发明化合物可以用于制备辅助治疗恶液质的药物。本发明为肿瘤恶液质的治疗提供一种可行的选择，以提高恶液质患者生存质量。

参考文献：

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[3]o.kemik，a.sumer，a.s.kemik，etal.therelationshipamongacute-phaseresponseproteins，cytokinesandhormonesincachecticpatientswithcoloncancer[j].worldjsurg.oncol.,8(2010)85-90.

[4]h.j.patel,b.m.patel.tnf-αandcancercachexia:molecularinsightsandclinicalimplications[j].lifesciences170(2017)56–63.

[5]cpaola，cneus，tluclana，etal.tumornecrosisfactor-αmediateschangesintissueproteinturnoverinaratcancercachexiamodel[j].clinlnvest,92(1993)2783-2789.

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技术实现要素：

本发明的目的在于解决肿瘤恶液质阶段炎性细胞因子tnf-α、il-6含量过高，以及营养吸收不良造成的厌食、消瘦，提供一种用于制备辅助治疗肿瘤恶液质阶段药物的化合物。

本发明的一种用于制备辅助治疗肿瘤恶液质的化合物，其特征在于结构式如下：

其中，r1为och3或h

当r1为och3时，分子式为c39h44o19

当r1为h时，分子式为c38h42o18

一种用于降低肿瘤恶液质阶段炎性细胞因子tnf-α、il-6含量的化合物的制备工艺，其特殊之处在于包括以下步骤：采集新鲜的大麦苗，冻干，粉碎，在室温下，按原料与提取溶剂重量比为1:4～10，用50％极性溶剂水溶液萃取3～6次，合并各次萃取液，将萃取液浓缩至比重为1.00～1.28，然后将浓缩后的萃取液吸附于大孔树脂柱，先用水冲洗，然后，依次用8％～50％的极性溶剂水溶液洗脱。将富含黄酮类成分的18％～20％的极性溶剂水溶液馏分收集后，进一步用反相制备液相色谱分离纯化，以20％极性溶剂水溶液为流动相，在254nm处检测流出成分，得到的本发明化合物。

本发明发明化合物针对肿瘤恶液质阶段炎性细胞因子tnf-α、il-6分泌水平过高，并由此造成的厌食、消瘦，辅助治疗肿瘤恶液质的机理在于：

(1)本发明化合物能够有针对性降低tnf-α、il-6水平，从根本上改善肿瘤恶液质阶段的炎性细胞因子含量过高造成的肿瘤微环境的无菌性炎症恶化状态，改善由于长期炎症状态造成的消化吸收功能障碍，改变恶液质阶段的厌食和消瘦；

(2)本发明化合物的母体结构为黄酮类化合物，黄酮类为公认的抗氧化剂，有较强的去除自由基功能，减少体内外各种自由基对机体的进一步损伤，从而减少炎症的进一步恶化。

附图说明

图1：正常小鼠小鼠模型；

图2：肿瘤恶液质小鼠模型；

图3：加入本发明化合物前后细胞形态变化；

图4：使用本发明化合物前后肝肾组织切片图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明的一种用于制备辅助治疗肿瘤恶液质的化合物，结构式如下：

该化合物简称化合物1

化合物1为无定形粉末，分子式为c39h44o19

质谱(ms)：816.25

333(4.38)

核磁共振氢谱¹h-nmr(dmso-d6，500mhz，δ):3.67(6h,s,sinapoyloch3×2),4.74(1h，d，j＝9hz，6-c-glc-h-1),5.05(1h，d，j＝7hz，7-o-glc-h-1),6.37(1h，d,j＝16hz,sinapoylh-8),6.66(1h,s,h-8),6.71(2h,s,sinapoylh-2,6),6.81(1h,s,h-3),6.85(2h,d,j＝9hz,h-3',5'),7.48(1h,d,j＝16hz,sinapoylh-7),7.78(2h,d,j＝9hz,h-2',6'),13.41(1h,s,c-5-oh)

核磁共振碳谱¹³c-nmr(dmso-d6,125mhz):

164.0(c-2),102.7(c-3),181.8(c-4),159.5(c-5),110.7(c-6),161.9(c-7),93.7(c-8),156.1(c-9),105.0(c-10),120.7(c-1'),127.9(c-2',6'),115.6(c-3',5'),161(c-4'),73.3(c-1”),70.6(c-2”),78.8(c-3”),70.l(c-4”),80.8(c-5”),60.7(c-6”),101.4(c-1”'),72.6(c-2”'),75.7(c-3”'),69.7(c-4”'),73.8(c-5”'),63.1(c-6”'),124.2(sinc-1),106.4(sinc-2),147.8(sinc-3),138.5(sinc-4),145.1(sinc-5),114.4(sinc-6),166.1(sinc-7),55.9(sinoch3)

实施例2

本发明的一种用于制备辅助治疗肿瘤恶液质的化合物，结构式如下：

该结构式为化合物2。

化合物2为无定形粉末，分子式为c38h42o18

质谱(ms)：786.24

329(4.47)

核磁共振氢谱¹h-nmr(dmso-d6，500mhz，δ):3.69(3h,s,feruloyl-och3),4.73(1h，d，j＝9hz，6-c-glc-h-1),5.05(1h，d，j＝7hz，7-o-glc-h-1),6.32(1h，d，j＝16hz,feruloylh-8),6.60(1h,d,j＝8hz,feruloylh-6),6.68(1h,s,h-8),6.82(1h,s,h-3),6.86(2h,d,j＝9hz,h-3',5'),7.03(1h,d,j＝2hz,feruloylh-2),7.48(1h,d,j＝16hz,feruloylh-7),7.82(2h,d,j＝9hz,h-2',6'),13.41(1h,s,c-5-oh)

核磁共振碳谱¹³c-nmr(dmso-d6,125mhz):

164.1(c-2),102.9(c-3),18l.9(c-4),159.5(c-5),110.7(c-6),161.8(c-7),93.7(c-8),156(c-9),104.5(c-10),120.8(c-1'),128(c-2',6'),115.8(c-3',5'),161(c-4'),73.3(c-1”),70.6(c-2”),78.8(c-3”),70.l(c-4”),80.7(c-5”),60.5(c-6”),100.9(c-1”'),72.7(c-2”'),75.8(c-3”'),70.1(c-4”'),73.8(c-5”'),63.2(c-6”'),125.4(ferc-1),111.7(ferc-2),149.2(ferc-3),147.7(ferc-4),115.4(ferc-5),122.3(ferc-6),144.9(ferc-7),114.5(ferc-8),166(ferc-9),55.6(feroch3)

实施例3

本发明化合物的制备方法：本发明化合物来源于天然植物大麦苗(禾本科植物大麦hordeumvulgarel.成熟果实培养而成)，采集新鲜的20-30日龄大麦苗，-20℃冻干，粉碎，称取10kg，在室温下，用50％乙腈(ch3cn)水溶液萃取3～6次，合并各次萃取液，将萃取液浓缩，然后将浓缩后的萃取液吸附于amberlitexad-2大孔吸附树脂柱，先用水冲洗，然后，依次用8％～50％的ch3cn水溶液洗脱。将富含黄酮类成分的重量比18％～20％的ch3cn水溶液馏分收集后，进一步用制备液相色谱ods-hplc(20mm×250mm)分离纯化，以重量比20％ch3cn水溶液为流动相，在254nm处检测流出成分。将得到的各个组分真空浓缩至干燥，零下20℃保存。从样品中提取得到两个纯净的单一成分化合物，分别为化合物1、2。通过质谱(ms)、核磁共振氢谱¹h-nmr、核磁共振碳谱¹³c-nmr以及紫外可见光谱(uv)、红外光谱(ir)确证了本发明化合物的结构式。

实施例4

本实施例目的在于观察本发明化合物能否降低肿瘤恶液质阶段tnf-α、il-6含量，以及对恶液质小鼠的疗效。

1.1结肠癌小鼠恶病质模型的制备

1.1.1动物

spf级(无特殊病原体级)健康balb/c小鼠，雄性，鼠龄6-8周，体重22-24克，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物生产许可证号scxk(鲁)2014-0007。用常规小鼠饲料给予常规饲料(蛋白质20％-50％，脂肪5％-10％，粗纤维3％-5％)喂养，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。

1.1.2建立balb/c小鼠结肠癌恶病质模型

小鼠结肠腺癌细胞株colon26，购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心；balb/c小鼠，6～8周龄，体质量23g左右，采用周伟等[周伟，江志伟，姜军，等.一种癌性恶病质动物模型的建立[j].中华实验外科杂志，2004，21(4):490－491]建立的结肠癌小鼠恶液质模型。肿瘤恶液质组和药物干预组小鼠右腋窝下植入小鼠结肠腺癌细胞株colon26(每只小鼠皮下注射0.2ml，含有约1×10⁶个癌细胞)，植入癌细胞7天后肉眼可观察到有肿瘤结节生成，11天小鼠出现肿块明显增大、消瘦、体重下降、进食量及饮水量下降且活动减少，与健康对照组比较差异有统计学意义(p＜0.05)时，进入恶液质状态，构建肿瘤恶液质小鼠模型成功。附图1是正常小鼠，小鼠的毛色亮且光滑；附图2是肿瘤恶液质小鼠，小鼠体毛竖起变稀疏不光滑，小鼠萎靡。

1.2动物分组:

将bale/c小鼠适应性饲养1周，分别称量体重，按照体重排序采用随机方法，将60只小鼠随机分为6组，分别用a、b、c、d、e、f编号。

1.3药物的配制:

对每一个本发明化合物分别用0.9％生理盐水溶解配置成浓度为200mg.kg^-1.d^-1，400mg.kg^-1.d^-1两个剂量组，灌胃。

阳性药选用醋酸甲羟孕酮:用0.9％生理盐水溶解，120mg.kg^-1.d^-1。

1.4实验干预过程和标本采集

按照人常用剂量与小鼠用药剂量的换算公式，待b～f组都进入恶病质状态后(第12天)开始治疗，具体如下:

a组:空白对照组。不进行任何处理，正常饲养。

b组：恶液质模型组。给予生理盐水2m1灌胃，连续七天

c组：抗癌药组。按照120mg.kg^-1.d^-1醋酸甲羟孕酮，灌胃，连续七天

d组：化合物1低剂量组(200mg.kg^-1.d^-1)+抗癌药120mg.kg^-1.d^-1醋酸甲羟孕酮，灌胃，连续七天

e组：化合物1高剂量组(400mg.kg^-1.d^-1)+抗癌药120mg.kg^-1.d^-1醋酸甲羟孕酮，灌胃，连续七天

f组：化合物1组(400mg.kg^-1.d^-1)

至第19天，采用小鼠摘眼球取血，收集血液静置两小时后，4℃，4000r/min离心十分钟，吸取上清液，分成两部分，一部分检测营养指标，另一部分-20℃冻存备用检测细胞因子。小鼠大量失血后死亡，取小鼠肿瘤称重液氮保存备用。

1.5观察指标

(1)、一般状况

观察小鼠毛色和活动情况。

(2)、体重及摄食量

固定在每天固定时间用电子天平测量小鼠的体重。在每天固定时间定量给予小鼠饲料50克，第二天上午11时测量盒内剩余的小鼠饲料量，每日饮食量＝(前一天小鼠饲料重量)一(次日小鼠饲料重量)。

(3)、小鼠腓肠肌、附睾脂肪质量和小鼠肿瘤质量

小鼠处死后，取小鼠左侧完整腓肠肌，电子天平立即称重，取小鼠双侧附睾脂肪，电子天平立即称重。剥离肿瘤，剔除周围肌肉、皮肤等非肿瘤组织，电子天平称重，放在液氮中保存备用。

(4)、营养指标检测

血清白蛋白、血糖等检测采用全自动生化检测仪进行检测。

(5)、血清细胞因子检测

血清细胞因子检测采用elisa法，参照各细胞因子试剂盒操作说明书进行。

1.6统计学分析

采用spss16.0统计分析软件进行数据处理，结果以均数±标准差表示，每组资料分别进行正态性检验，两组比较用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析检验，p<0.05认为差异有统计学意义，p<0.01认为差异具有高度统计学意义。

1.7、结果与分析

(1)、一般指标

a组小鼠的摄食量、活动度、毛色一直都保持正常状态，体型微胖；b～f组皮下接种colon26细胞悬液的荷瘤组小鼠，实验第3至5天可以触及右上腋下皮下结节，并逐渐长大，六至七天后，可以肉眼观察到到皮下隆起结节，十天左右长至lcm×lcm大小，荷瘤组小鼠自接种肿瘤细胞后活动度逐渐减少，变得迟缓，毛色由白色光滑逐渐变得灰暗粗糙，摄食量逐日减少(摄食量参见表3)。第十二天，b组模型组小鼠饮食量明显减少，活动度下降，毛色明显晦暗，体型瘦弱。c组给予抗癌药干预后，小鼠饮食量略有增加，活动度增加，毛色渐好。d～e组分别给予本发明化合物和抗癌药联合干预后，小鼠较治疗前饮食量明显增加，活动度显著增加，毛色显著转好。f组给予本发明化合物干预后，小鼠较模型组饮食量明显增加，活动度显著增加，毛色显著转好。说明对于恶液质小鼠，本发明化合物具有明显的改善摄食量、活动度、毛色等一般身体指标的功效，而且与抗癌药联合使用，改善更明显。

(2)、体重变化

治疗前各组小鼠的体重呈逐渐上升趋势，至接种肿瘤第九天，各组荷瘤组小鼠体重呈下降趋势，a组小鼠体重仍呈上升趋势，见表1。实验第1天六组小鼠体重差异无统计学意义(p>0.05，在接种小鼠的第十一天，5组接种肿瘤的小鼠体重均显著低于a组小鼠(p<0.05)，而5组接种肿瘤的小鼠之间的体重差异无统计学意义(p>0.05)，说明从体重降低的角度看，在接种后第十一天，小鼠结肠癌恶病质模型建立是成功的。

表1各组小鼠不同时间点体重变化(g，)

第十二天开始给予本发明化合物1、抗癌药和生理盐水干预，作为治疗的第一天，实验到第19天，药物干预结束。见表2可知，a组小鼠终末体重最大；b组小鼠的最小，与a组小鼠相比，具有显著性差异p<0.01；c组小鼠的终末体重虽然显著小于a组小鼠，但与b组小鼠相比也有显著提高(p<0.05)；d组、e组小鼠的终末体重均显著高于b组小鼠，均具有统计学意义(p<0.05),与c组相比，化合物低剂量组(d组)略高于c组，随着剂量增加，e组小鼠的终末体重显著高于c组，具有统计学意义(p<0.05)，说明随着本发明化合物1剂量增高，存在明显的剂量相关性，化合物1能明显协助抗癌药提高终末体重，高剂量效果最好。由f组可知，当只有化合物1存在时，尽管不与抗癌药合用，体重增加也是明显优于抗癌药物组和模型组(p<0.05)，说明化合物1本身就具有较好的作用。

5组荷瘤小鼠的肿瘤质量中，b组最大，c组与模型组相比，瘤体质量明显降低，d-f组之间肿瘤质量大小没有统计学差异(p>0.05)，但是与c组相比，瘤体质量明显减轻(p<0.05)；f组纯化合物组的瘤体质量与模型组相比，略有减小，但无统计学差异(p>0.05)。见表9。

试验表明：化合物1本身并不能作用于肿瘤瘤体组织并使之减小，但可以辅助抗癌药减小瘤体质量。

表2各组小鼠肿瘤生长比较(g，)

(3)、小鼠摄食量变化

由表3可见，a组饮食量呈稳定状态，变化不明显，b-f组小鼠自接种colon26肿瘤细胞悬液后，摄食量在初期呈上升趋势，到实验第六至七天呈下降趋势，至实验第十一天下降到最低值，且比a组小鼠摄食量显著减少，有统计学差异(p<0.05)，但这五组小鼠摄食量比较无统计学意义(p>0.05)。

第十二天分别给予本发明化合物1、抗癌药及生理盐水干预七天后，b组、c组摄食量显著低于a组(p<0.01)，但d、e、f组与b组比较，摄食量显著增加(p<0.05)；而且使用化合物1后，e、f组摄食量显著高于抗癌药c组(p<0.05)，并与化合物的量成正相关(p<0.05)；单纯使用化合物1的f组也能显著提高摄食量(p<0.05)。

结果表明，本发明化合物1能明显改善恶液质小鼠的摄食量，改善厌食状况。

表3各组小鼠摄食量(g，)

(4)、小鼠腓肠肌重量和附睾脂肪重量的变化

b组小鼠的附睾脂肪重量显著低于a组小鼠(p<0.01)，说明造模成功，c组小鼠的附睾脂肪重量显著高于b组小鼠(p<0.05)，说明抗癌药可以适当改善脂类、蛋白等营养物质吸收，但仍然显著低于a组，说明改善的效果不理想；d-f组左侧腓肠肌重量显著高于c组(p<0.01)，附睾脂肪重量也显著高于c组(分别p<0.01,p<0.05)。本试验说明，化合物1的存在，有效促进了营养吸收，促进了小鼠腓肠肌重量和附睾脂肪重量的增加，有助于改善恶液质小鼠的肌肉和脂肪消耗，而且，化合物1与抗癌药联用后能有效协同减少肌肉和脂肪的消耗。见表4

表4各组小鼠腓肠肌重量和附睾脂肪重量(g,)

(5)、小鼠营养指标的变化

各实验小鼠组中，b组、c组血清白蛋白含量均显著低于a组(分别p<0.05,p<0.01)，但d-f组血清白蛋白含量显著高于b组、c组(p<0.01)；b-f组血糖含量显著低于a组(p<0.05)，但d-f组血糖含量显著高于恶液质模型组b组(p<0.05)；说明f组单独使用本发明化合物1时，也能明显提高白蛋白、血糖等营养物质的含量，与抗癌药联用时协同增效更明显。而且见表5。

表5各组小鼠营养指标比较(g,)

(6)、恶液质小鼠血清中细胞因子tnf-α、il-6含量变化

由表6实验结果可知，抗癌药b组小鼠血清tnf-α、il-6含量虽然小于b组模型组(p<0.05)，但是依然很高，随着本发明化合物1的加入，d-f组小鼠血清tnf-α、il-6含量快速显著下降，而且降低程度与化合物1的量存在明显的相关性，高剂量效果更明显(p<0.05)，在没有抗癌药存在时，化合物1也可以明显降低小鼠血清tnf-α、il-6含量(f组)，与抗癌药合用，则可以起到明显的协同作用。

表6各组小鼠细胞因子指标比较(pg/ml,)

实施例5

实施例2的疗效实验

参照实施例4，利用与化合物1相同的方法进行药效试验，可以看出，化合物2具有与化合物1极为相似的药理效果。化合物2也可以明显降低小鼠血清tnf-α、il-6含量(tnf-α值为9.21±0.87pg/ml，il-6值为6.72±2.10pg/ml)；化合物2也可以明显促进小鼠血液中白蛋白、血糖水平，白蛋白值为9.19±1.02g/l,血糖值为6.00±0.60umol/l；提高小鼠摄食量(0.52±0.08g)，提高小鼠体重(24.54±2.00g)，提高腓肠肌重量(0.118±0.006g)和附睾脂肪质量(0.31±0.007g)，以上指标与阳性组相比，差异有极显著性p<0.01；同样，化合物2对实体瘤并没有明显的治疗作用，与抗癌药联用，具有协同增效作用。分析其原因，尽管有一个甲氧基取代基不同，二者的极性、溶解性是相似的，化合物1和2的母体结构相同，空间构型基本一致，因此二者的药效是相似的。

实施例6

在细胞实验水平上，本发明化合物对细胞分泌细胞因子的实验研究

肿瘤恶液质动物实验已经证明，本发明化合物能够明显降低恶液质小鼠血清中肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白介素-6(il-6)的水平，但是这是从整体动物水平的实验得出的结果，考虑到整体动物实验影响因素比较复杂，动物实验的结果并不能明确本发明化合物的作用靶点，因果关系不明确，为了确定本发明化合物是否是通过降低tnf-α、il-6的水平才改善了营养吸收，是否能够影响细胞分泌tnf-α、il-6的水平，以下采用细胞实验法，选取最经典的免疫细胞---小鼠腹腔原代巨噬细胞为研究对象，取细胞体外培养，然后观察本发明化合物是否影响其分泌炎性细胞因子。

由于与肿瘤恶液质相关的炎性细胞因子主要有肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白介素1β(il-1β)、白介素6(il-6)，为此，本次细胞实验选取这三种细胞因子为观测指标。希望能够进一步明确本发明化合物促进营养吸收、辅助治疗肿瘤恶液质的作用机制是否与化合物降低tnf-α、il-6的水平有关，以及是否与降低il-1β也相关。

1.1材料与方法

昆明鼠，周龄6-8周，体重18-22g，济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物生产许可证号scxk(鲁)2014-0007。

rpmi-1640细胞培养液，gibco公司；

细菌脂多糖(lps)，上海劲马生物科技有限公司；

四甲基偶氮唑兰(mtt)，sigma公司；

二甲基亚砜(dmso)，分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心；

胎牛血清(fbs)，生工生物工程(上海)有限公司；

elisa试剂盒，上海联硕生物科技有限公司；

酒精，烟台三和化学试剂有限公司；

pbs缓冲液：nacl8g，na2hpo4·12h2o2.88g，kcl0.2g，kh2po40.2g，蒸馏水定容至1000ml，浓度为0.01mol/l，调节ph值至7.4。

细胞洗液：edta-na0.02g，nacl0.8g，kcl0.04g，蒸馏水定容至100ml，调节ph值至7.8-8.0，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。

红细胞裂解液：tris0.03735g，nh4cl0.13g，双蒸水定容至100ml，调节ph值至7.2。0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

rpmi-1640培养液：①rpmi-1640一袋，丙酮酸钠0.11g，氨苄青霉素0.11g，链霉素0.125g，溶于灭过菌的800ml蒸馏水中，磁力搅拌1小时；②nahco32.0g溶于200ml无菌蒸馏水中。①②混合后磁力搅拌1小时。

10％新牛血清eagle’smem培养液：①mem9.4g溶于800ml无菌蒸馏水中；②nahco32.0g溶于200ml无菌蒸馏水中，①，②混合，调节ph值至7.0-7.2，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

lps溶液：称取lps100μg，溶于1mlrpmi-1640培养液中，配制成100μg/ml的lps溶液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

1.2仪器设备

水浴恒温振荡器，金坛市恒丰仪器厂；

tdl-5-a低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；

超净工作台，sw-cj-1cu苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；

mco-17aco2培养箱，日本sanyo公司；

ldzx-40bi立体自动电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；

al104电子天平，梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司；

移液枪(10-100μl，100-1000μl，1-5ml)，thermo；

bio-rad550酶标定量测定仪，bio-rad；

xds-1b型倒置显微镜，coic；

孔径0.22μm微孔滤膜滤器，天津市津腾实验设备有限公司；

96孔细胞培养板；1-10ml注射器和针头；烧杯，玻璃棒，离心管，剪刀，镊子等。

1.3实验方法

1.3.1本发明化合物的配制

取已经提取净化好的单一纯品化合物(纯度≥98％,hplc)，分别用0.9％生理盐水配成浓度800ug/l,使用时根据需要稀释成合适的浓度。

1.3.2小鼠腹腔巨噬细胞的提取和培养

取健康昆明种小鼠10只，将小鼠颈椎脱臼处死，放入体积分数为75％的酒精中浸泡5-10min消毒，在无菌条件下打开小鼠腹腔暴露腹膜，将4ml左右的无血清的rpmi-1640培养液注射到每只小鼠腹腔内，用酒精棉轻揉腹部2-3min使其充分流动后吸取腹腔液于离心管中，合并所有腹腔液，以1200r/min离心5分钟，弃上清，用含10％新生小牛血清的rpmi-1640培养液重悬细胞并计细胞总数，用含10％新生小牛血清的rpmi-1640培养液调整细胞浓度至4×10⁵个/ml，将100μl巨噬细胞悬液接种于96孔培养板，置于4％co2恒温培养箱中，37℃孵育培养。

1.3.3实验设计分组及细胞培养过程

为考察本发明化合物对正常巨噬细胞和病理状态的巨噬细胞的影响，采用免疫学最常用的细菌脂多糖(lps)刺激巨噬细胞，制造炎症状态下的巨噬细胞病理模型。将1.3.2培养的细胞分组如下。

空白对照组：原代巨噬细胞，以rpmi-1640培养液培养。

阳性对照组：lps刺激的巨噬细胞，以lps和rpmi-1640培养液培养

药物组：取已经配好的各单一化合物溶液，观察每个本发明化合物分别对原代巨噬细胞和lps刺激的巨噬细胞的影响。

每组3个复孔。rpmi-1640培养液组为100μlrpmi-1640培养液，阳性对照组为15μllps，和85μlrpmi-1640培养液。

实验组：加入各单一化合物溶液各100ul，各个复孔没有达到200ul的以rpmi-1640培养液补充到200ul。

细胞培养72小时后，取每孔中的上清液进行细胞因子测定。

1.3.4双抗体夹心酶联免疫吸附法(elisa)测定小鼠腹腔巨噬细胞分泌细胞因子的量。

分析过程如下：

(1)标准品的稀释：由原倍标准品,用标准稀释液在小离心管中依次稀释为五个所需标准浓度。其中：

tnf-α五个梯度浓度为480ng/l，240ng/l，120ng/l，60ng/l，30ng/l；

il-1β五个梯度浓度为为80ng/l，40ng/l，20ng/l，10ng/l，5ng/l；

il-6五个梯度浓度为为1200ng/l，600ng/l，300ng/l，150ng/l，75ng/l；

(2)加样：分别设空白孔、标准品孔和待测样品孔。空白孔，空白对照孔不加样品，生物素标记的tnf-α抗体，链霉亲和素-hrp，只加显色剂a&b和终止液，其余各步操作相同；标准品孔，加入标准品50μl，链霉亲和素-hrp50μl(标准品中已事先整合好生物抗体素，故不加)；待测样品孔，加入待测样品(细胞培养上清液)40μl，然后各加入抗tnf-α(il-1β、il-6)抗体10μl、链霉亲和素-hrp50μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，盖上封板膜，轻轻震荡混匀。

(3)温育：置于37℃温育60分钟。

(4)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

(6)显色：每孔先加入显色剂a50μl,再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

(7)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

(8)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。测定应在加终止液后10分钟以内进行。

(9)分析：根据标准品的浓度及对应的od值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的od值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

1.3.5实验结果统计分析

ˉ

统计学方法：采用spss16.0统计软件进行单因素方差分析，结果用x±s表示。

1.4结果与分析

(1)细胞因子标准曲线的绘制

通过实验，可以看出，以溶液在450nm处的od值为纵坐标，以细胞因子的浓度为横坐标,得到各细胞因子的工作曲线方程。

tnf-α标准工作曲线为y＝0.0046x+0.1488，相关系数r＝0.9991，线性范围为30-480ng/l；

il-6标准工作曲线为y＝0.0032x+0.5496，相关系数r＝0.9939，线性范围为75-800ng/l；

il-1β标准工作曲线为y＝0.0471x+0.1275，相关系数r＝0.9996，线性范围为5-80ng/l；

(2)实验前后小鼠巨噬细胞的形态观察结果

在显微镜下可以观察到，参见附图3，使用本发明化合物前，小鼠腹腔巨噬细胞形态绝大部分为圆形，体积大小均匀，加入本发明化合物12小时以后，明显看到巨噬细胞形态发生了变化，有的细胞由圆形开始形成伪足，有的细胞变得细长，细胞体积也变大。这个现象说明本发明化合物对巨噬细胞产生了影响。

(3)巨噬细胞炎性细胞因子的分泌量

为搞清楚本发明化合物对巨噬细胞分泌细胞因子的影响，通过进一步定量，观察小鼠腹腔巨噬细胞周围液体中的细胞因子含量，观察本发明化合物对小鼠腹腔巨噬细胞分泌细胞因子的量的影响。

由表7可知，无lps诱导的正常小鼠腹腔巨噬细胞，本发明化合物中各种药物对正常细胞tnf-α、il-6、il-1β的分泌略有降低，但是与空白组相比，没有明显差异(p>0.05)，说明对于生理状态的巨噬细胞，本发明化合物对炎性细胞因子分泌没有明显影响。

由表8可知，对经过lps诱导的小鼠腹腔巨噬细胞，加入lps后，巨噬细胞分泌tnf-α、il-6、il-1β与正常腹腔巨噬细胞相比均明显增加(p<0.05)，说明lps可以刺激腹腔巨噬细胞作用很显著，经lps刺激的巨噬细胞可以模拟炎症的病理状态。以此为阳性对照细胞，可以看出，加入本发明化合物1和2后，小鼠腹腔巨噬细胞分泌tnf-α、il-6的水平与阳性lps对照组相比，明显降低(p<0.05)，而且与化合物的加入量呈正相关，加入量增加，降低作用明显(p<0.05)。但是对于病理状态下il-1β的分泌量，与阳性对照相比，本发明化合物1和2没有明显降低il-1β的分泌(p>0.05)。

表7本发明化合物对正常小鼠腹腔巨噬细胞分泌细胞因子的影响

表8本发明化合物对lps刺激的小鼠腹腔巨噬细胞分泌细胞因子的影响

2.5实验结论

体外细胞实验结论：综合实验结果可知，对正常小鼠腹腔巨噬细胞分泌炎性细胞因子没有明显的影响。但是对细菌脂多糖(lps)刺激后的小鼠腹腔巨噬细胞，本发明化合物均能够不同程度抑制其分泌tnf-α和il-6，而且与阳性对照组相比，差异具有显著性(p<0.05)，而对于炎性细胞因子il-1β基本没有影响。这种体外细胞实验结果与恶液质小鼠动物实验结果是一致的，说明本发明化合物促进恶液质小鼠营养吸收，改善体重和摄食量，辅助抗癌药治疗肿瘤恶液质与降低恶液质状态下tnf-α和il-6含量密切相关。进一步分析细胞实验和动物实验结果，可以看出本发明化合物通过抑制肿瘤恶液质阶段炎症，降低主要炎性细胞因子的水平，有效促进了消化系统功能的恢复，促进了营养吸收，改善了恶液质造成的厌食和消瘦等问题。

实施例7

本发明化合物的毒性试验

1.1小鼠急性经口毒性实验：

1.1.1实验动物

选用健康、成熟，体重18～22g昆明种小鼠20只，雌雄各半。20只小鼠分成两组，每组10只，雌雄各5只，分别用于测定本发明化合物的毒性。昆明鼠，周龄6-8周，体重18-22g，济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物生产许可证号scxk(鲁)2014-0007。

检测环境条件，室温20～25℃,相对湿度范围40％～70％。

1.1.2剂量和给药方法

按最大耐受量(mtd)法，设20.0g/kg体重一个剂量组。进行实验前，称取样品20g,以1％羟甲基纤维素钠为溶媒配制成40ml样品液。小鼠灌胃前禁食(不禁水)16小时，按20ml/kg体重灌胃容量灌胃二次，间隔4小时。末次灌胃2小时后动物自由进食、饮水，记录动物中毒表现及死亡情况及各脏器病理变化。

1.1.3观察指标

灌胃后，观察小鼠的一般状况、中毒表现和死亡情况。观察期限为15天，记录小鼠初期及期末体重及病理情况。

1.1.4观察结果

小鼠急性经口毒性实验：小鼠死亡情况见表9。实验期间，各小鼠均未见明显中毒表现，也无死亡。本发明化合物对雌雄小鼠经口急性毒性最大耐受量(mtd)均大于20.0g/kgbw，属无毒级。

表9本发明化合物的小鼠急性毒性死亡情况

经口急性毒性实验小鼠灌胃后，一般状态良好，未见行为明显改变，各剂量组15天后均未见死亡。观察15天后，各脏器病理学结果见图3。显示经灌胃后重要器官肝脏、肾脏未发现病理改变，进一步说明本发明化合物是无毒级的，参见附图4。

实施例8

取上述实施例制备的化合物1克，加入赋形剂药用淀粉29克，混合均匀，制颗粒，整粒压片，制得片剂100片，每片含化合物10毫克。

实施例9取上述实施例制备的化合物2克，加入到蒸馏水1998克，加入矫味剂和防腐剂适量，制成口服液，每毫升含化合物10毫克。