与乳腺癌相关的lncRNA标志物及其检测引物和应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及与乳腺癌相关的lncrna标志物及其检测引物和应用，所述标志物为linc02422。

背景技术：

乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤，已经成为我国乃至全球的重大健康问题。乳腺癌的发病率正在逐年上升，根据这种增长趋势，预计到2021年，我国乳腺癌患者可达250万之多。

近年来，早期诊断技术的发展，和综合性治疗手段的应用，使乳腺癌的生存率较过去几十年明显升高，但是仍有约30％的早期乳腺癌患者发生复发，24％～60％的患者发生远处转移，肿瘤的复发和转移，将严重影响乳腺癌患者的生活质量和生存时间，也为临床工作带来很大的挑战。很多研究表明，肿瘤的复发和转移与其组织病理学参数有关，包括肿瘤大小、淋巴结状态、组织学分级、增殖基因表达水平等。但是，乳腺癌的临床、病理和分子生物学特征，具有这些传统的组织病理学参数无法表征的生物学异质性。因此，研究者们将乳腺癌进行分子分型，以便对不同乳腺癌患者的临床病理学特点和对治疗的反应进行鉴定和区分，从而指导临床工作。乳腺癌的分子分型如下:luminala型，luminalb型，her-2过表达型和三阴性乳腺癌。luminalb型乳腺癌又被分为两种亚型:1)her-2阴性型:er阳性，her-2阴性，且至少具有以下条件之一:ki-67高表达、pr阴性或低表达、及多基因表达分析提示高复发风险；2)her-2阳性型:er阳性，her-2阳性，pr及ki-67可任何水平。

随着基因组学研究的深入，高通量测序技术的应用，人们惊奇地发现约1.5％左右的基因组序列有能力编码蛋白质，而超过98％的基因组序列大部分区域虽然进行转录，但是生成的rna却不编码蛋白。这些非编码序列被人们认为是基因组中的“暗物质”。在这些非编码rna中，有一类长度大于200个核苷酸而且不具备编码蛋白质能力的转录产物被定义为长链非编码rna(longnoncodingrna,lncrna)。长链非编码rna的发现使生物学家进一步认识到基因组转录调控手段的复杂，这些长链非编码rna转录本可以来自于两个编码蛋白间的基因组序列，也可以起源于编码蛋白基因的内含子或者反义链等区域。越来越多的实验数据表明长链非编码rna在表观遗传学、转录调控、翻译过程、蛋白质翻译后修饰等多种过程中都能发挥重要作用；此外，许多长链非编码rna含有较为保守的二级结构，其表达具有时空特异性，这些分子特征都暗示着了长链非编码rna可能具有重要的生物学功能，在个体发育、生理和病理学上都可能会发挥关键作用。长链非编码rna的研究已经成为生物学中的一个热点。

在生物体内，长链非编码rna发挥着十分复杂的生物学功能，参与不同的生物学事件。目前的研究已经发现，长链非编码rna可以在表观遗传调控、转录调控以及翻译后等多个层面上调控基因的表达，参与dna损伤应答、x染色体沉默、细胞重编程和基因组印记等多种重要生命过程。长链非编码rna的异常表达与乳腺癌、白血病、结肠癌、前列腺癌和肝癌等多种癌症的发生侵袭转移有关。综合国内外近期的研究可以看出，lncrna有望成为乳腺癌早期诊断和治疗的潜在靶点。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与乳腺癌发生发展相关的分子标志物，所述标志物可以作为乳腺癌的特异性诊断标志物，应用于乳腺癌的早期发现；同时所述标志物可以作为乳腺癌的特异性分子靶标，应用于乳腺癌的个性化治疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测linc02422的试剂在制备诊断乳腺癌的产品中的应用。

进一步，所述乳腺癌为luminalb型乳腺癌。

进一步，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中linc02422的表达水平的试剂。所述核酸扩增技术包括聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增和基于核酸序列的扩增。

进一步，所述试剂选自：特异性识别linc02422的探针；或

特异性扩增linc02422的引物。

进一步，所述特异性扩增linc02422的引物序列如seqidno.1～2所示。

本发明提供了一种体外检测linc02422表达水平的产品，所述产品包括芯片、试剂盒、核酸膜条。

进一步，所述芯片包括特异性识别linc02422的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括特异性扩增linc02422的引物，或特异性识别linc02422的寡核苷酸探针；所述核酸膜条包括特异性识别linc02422的寡核苷酸探针。

进一步，所述特异性扩增linc02422的引物序列如seqidno.1～2所示。

进一步，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明提供了体外检测linc02422表达水平的产品在制备诊断乳腺癌的工具中的应用。

进一步，所述乳腺癌为luminalb型乳腺癌。

本发明提供了linc02422在构建预测乳腺癌的计算模型中的应用。

进一步，所述乳腺癌为luminalb型乳腺癌。

本发明提供了linc02422在制备治疗乳腺癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述乳腺癌为luminalb型乳腺癌。

进一步，所述药物组合物包括linc02422的抑制剂，所述抑制剂可以降低linc02422的表达水平。所述抑制剂以linc02422其为靶序列、且能够抑制linc02422表达水平的试剂，包括：shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna、反义核酸，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物等。

进一步，所述抑制剂为sirna。

在本发明的具体实施方式中，所述sirna的序列如seqidno.5-10所示，作为更为优选的一种实施方式，所述sirna的序列如seqidno.7-8所示。

附图说明

图1是利用qpcr检测linc02422基因在乳腺癌组织中的表达情况图。

图2是利用qpcr检测sirna沉默linc02422的情况图。

图3是利用cck-8检测linc02422对乳腺癌bt474细胞的增殖影响图。

图4是利用transwell小室检测linc02422对乳腺癌bt474细胞迁移侵袭能力的影响图。

具体的实施方式

本发明通过高通量方法，检测乳腺癌标本中lncrna在肿瘤组织和正常组织的表达，发现其中具有明显表达差异的lncrna，从而为乳腺癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了乳腺癌中linc02422显著性上调，并通过qpcr进一步验证了linc02422的上调，差异具有统计学意义。

linc02422基因位于12号染色体上，基因id为105369723，包括linc02422基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的linc02422，以及源自细胞中加工的任何形式的linc02422。该术语涵盖linc02422的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。该术语涵盖例如linc02422基因，人linc02422的基因序列(nr_135029.1)，以及来自任何其它脊椎动物来源。

本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。

本文所用术语“差异表达”表示与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较，经测定lncrna的量或水平，在一个样品中本发明的一种或多种生物标志物的rna和/或所述生物标志物lncrna的一种或多种剪接变体表达水平的差异。差异表达可以如本文所述和本领域技术人员理解的方法确定。术语“差异表达”或“表达水平的变化”表示与第二种样品中给定生物标志物的可测定表达水平比较，经测定rna的量，样品中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。术语“差异表达”或“表达水平的变化”还可以表示与第二个样品群中生物标志物的可测定表达水平比较，样品群中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。本文所用“差异表达”可以用给定生物标志物的表达水平相对于对照中给定生物标志物的平均表达水平的比率进行测定，其中比率不等于1.0。还可以用p值测定差异表达。当使用p值时，当p值小于0.1时生物标志物被鉴定为在第一和第二群体之间差异表达。更优选p值小于0.05。甚至更优选p值小于0.01。还更优选p值小于0.005。最优选p值小于0.001。当基于比率确定差异表达时，如果第一种和第二种样品中表达水平的比率大于或小于1.0，则rna是差异表达的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中，如果第一群体的平均表达水平与第二群体的平均表达水平的比率大于或小于1.0，则核酸转录本是差异表达的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中，如果第一个样品中表达水平与第二个群体中平均表达水平的比率大于或小于1.0，例如包括比率大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20，或比率小于1，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05，则核酸转录本是差异表达的。

“表达差异增加”或“上调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以rna表达)显示增加至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。

“表达差异降低”或“下调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以rna表达测定)显示降低至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或少于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少的基因。例如，上调基因包括与从正常个体分离的rna的表达相比，从以患有乳腺癌为特征的个体分离的样本中rna表达水平增加的基因。例如，下调基因包括与从正常个体分离的样本相比，从以患有乳腺癌为特征的个体分离的样本中rna表达水平降低的基因。

检测技术

本发明的lncrna使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于rna在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将rna逆转录成dna。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的dna的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些dna片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板dna进行测序。

核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ish)、微阵列和southern或northern印迹。原位杂交(ish)是一种使用标记的互补dna或rna链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ish)中的特异性dna或rna序列的杂交。dnaish可用于确定染色体的结构。rnaish用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mrna和其他转录本(例如，ncrna)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ish也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

将southern和northern印迹分别用于检测特异性dna或rna序列。使从样本中提取的dna或rna断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的dna或rna与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的dna片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的rna。

本发明可在检测前或同时地对核酸(例如，ncrna)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(pcr)、逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、转录介导的扩增(tma)、连接酶链式反应(lcr)、链置换扩增(sda)和基于核酸序列的扩增(nasba)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，pcr)需要在扩增前将rna逆转录成dna(例如，rt-pcr)，而其他扩增技术则直接扩增rna(例如，tma和nasba)。

通常称为pcr的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；tma的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和ph的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个rna拷贝自身催化地生成另外的拷贝；lcr的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补dna寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为nasba的基于核酸序列的扩增；使用rna复制酶(通常称为qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

芯片、核酸膜条、试剂盒

本发明提供了检测样本中linc02422基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片、核酸膜条或试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于linc02422所示的部分或全部序列。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

本发明提供了核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的针对linc02422的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测linc02422的表达。所述试剂盒还包括选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

本发明提供了linc02422在制备预测乳腺癌的计算模型中的应用。正如熟练技术人员可以领会的，可以使用两种或更多种标志物的测量来改进调查中的诊断问题。生化标志物可以个别测定，或者在本发明的一个实施方案中，它们可以同时测定，例如使用芯片或基于珠的阵列技术。然后独立解读生物标志物的浓度，例如使用每种标志物的个别截留，或者它们组合进行解读。

在本发明中，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合基因和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于乳腺癌的风险或与有助于评估乳腺癌松患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有乳腺癌风险的个体、具有乳腺癌的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(da)(即线性、二次、规则da)、kernel方法(即svm)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、pls(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、cart、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即simca)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估乳腺癌中使用的数学算法的统计方法选自da(即线性、二次、规则判别分析)、kernel方法(即svm)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、pls(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、cart、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与乳腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

分别收集4例luminalb型乳腺癌的癌组织及相对应的正常组织样本(距离肿瘤边缘5公分)，进行高通量测序，所有患者术前未进行化疗、放疗以及内分泌治疗，所有患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意，病人信息如表1所示。

表1样本信息

2、rna样品的制备及质量分析

使用trizol法提取组织总rna

1)用剪刀组织剪碎，加入1mltrizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解。

2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min。

3)4℃，11000rpm离心15min。

4)将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min。

5)4℃，11000rpm离心15min。

6)用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次。

7)4℃，8000rpm离心5min。

8)将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min。

9)检测rna浓度，鉴定rna的产量和纯度。

3、cdna文库的构建及测序

1)总rnadnasei消化：利用dnasei消化totalrna样品中存在的dna片段，磁珠纯化回收反应产物，最后溶解于depc水；

2)去除rrna：取消化好的totalrna样品，使用epicentre的ribo-zero试剂盒去除rrna，去除之后进行agilent2100检测，验证rrna去除效果；

3)rna打断：取上一步样品，加入打断buffer，置于pcr仪中进行热打断，打断到140-160nt；

4)反转录一链的合成：向打断后的样品中加入适量引物，充分混匀后在thermomixer适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系mix，在pcr仪上按相应程序合成一链cdna；

5)反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在thermomixer上适温反应一定时间，合成带有dutp的二链cdna，反应产物用磁珠进行纯化回收；

6)末端修复：配制末端修复反应体系，在thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cdna双链的粘性末端进行修复，末端修复产物用磁珠进行纯化回收，最后将样品溶于ebsolution；

7)cdna3’末端加“a”：配制加“a”反应体系，在thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物cdna的3’末端加上a碱基；

8)cdna5’adapter的连接：配制接头连接反应体系，在thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与a碱基连接，产物用磁珠进行纯化回收；

9)ung消化cdna二链：配制ung消化反应体系，通过ung酶消化掉双链dna中的二链，并用磁珠对产物进行纯化回收；

10)pcr反应及产物回收：配制pcr反应体系，选择适当的pcr反应程序，对上步骤得到的产物进行扩增，对pcr产物进行磁珠纯化回收，回收产物溶于eb溶液中，贴上标签。

11)文库质量检测：使用agilent2100bioanalyzer和abisteponeplusreal-timepcrsystem对文库质量进行检测；

12)上机测序：检测合格的文库，加入naoh变性成单链，按照预期上机数据量，稀释至一定的上机浓度。变性稀释后的文库加入到flowcell内，与flowcell上的接头杂交，在cbot上完成桥式pcr扩增，最后使用illuminahiseqx-ten平台进行测序。

4、生物信息学分析

1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉n大于10％的reads；

2)hisat2比对到参考基因组上。参考基因组来自于ensembl数据库，基因组版本grch38，基因注释信息为ensemble92；

3)stringtie定量lncrna的表达量并标准化输出；

4)edger包比较对照组跟疾病组lncrna的表达差异，差异变动lncrna的筛选标准是|log2fc|>1且pvalue<0.05。

5、结果

测序数据如表2所示，生物信息学分析发现，linc02422在乳腺癌患者中表达显著上调，提示linc02422可以作为可能的检测靶标应用于乳腺癌的早期诊断。

表2测序数据

实施例2qpcr测序验证linc02422基因的差异表达

1、按照实施例1的收集方式收集的25例luminalb型乳腺癌患者癌组织样本和正常组织样本对linc02422基因差异表达进行大样本qpcr验证。

2、rna提取

利用trizol法提取组织rna，具体步骤参见实施例1。

3、逆转录：使用takara公司的反转录试剂盒(takaracode：drr047a)进行操作。

1)去除基因组dna

在试管中加入5×gdnaeraserbμffer2.0μl，gdnaeraser1.0μl，总rna1μg，加rnasefreeddh2o使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热2min。

2)反转录反应

将buffer24.0μl，rtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，rnasefreeddh2o4.0μl加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中37℃15min，85℃5s。

4、qpcr扩增

1)引物设计

根据linc02422和gadph的基因序列设计引物，具体引物序列如下：

linc02422基因：

正向引物为5’-aatagattcattggagagt-3’(seqidno.1)；

反向引物为5’-cctaagtctactggtaac-3’(seqidno.2)。

gapdh基因：

正向引物为5’-aatcccatcaccatcttccag-3’(seqidno.3)；

反向引物为5’-gagccccagccttctccat-3’(seqidno.4)。

2)qpcr扩增检验

用premixextaq^tmii(takaracode:drr081)试剂盒配置pcr反应体系，在thermalcyclerrealtimesystem扩增仪上进行pcr扩增，反应结束后确认realtimepcr的扩增曲线和溶解曲线，δδct法进行相对定量。

配置25μl反应体系：

premixextaqtmii(2×)12.5μl，正(反)向引物各1μl，dna模板2μl，灭菌蒸馏水8.5μl。

反应条件：95℃30s，(95℃5s，60℃30s)×40

5、结果

qpcr结果如图1所示，与正常组织相比，linc02422在乳腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)，同高通量测序结果一致，提示linc02422可作为生物标志物应用于乳腺癌的诊断和治疗。

其中，linc02422在25例样本中表达上调，在25例样本中无显著性差异，25例上调样本中有23例为癌组织样本，2例为癌旁组织样本具体情况如表3所示。

表3基因在疾病中的阳性情况表

实施例3linc02422在乳腺癌细胞系中的表达情况

1、细胞培养

培养luminalb型乳腺癌的bt474细胞系，细胞在含10％胎牛血清(gibco公司)的dmem培养液中，于5％co2，37℃的恒温培养箱中进行培养。

2、转染

本申请所用的通用sirna-nc、sirna-linc02422购自上海吉码制药技术有限公司，沉默linc02422的sirna1-3序列如下所示。

sirna1的序列：

正义链为5’-aaaacacgaccuuccuuucua-3’(seqidno.5)

反义链为5’-gaaaggaaggucguguuuuca-3’(seqidno.6)

sirna2的序列：

正义链为5’-uagguuuaacuauuugcucaa-3’(seqidno.7)

反义链为5’-gagcaaauaguuaaaccuagg-3’(seqidno.8)

sirna3的序列：

正义链为5’-ucuaagucggauuaagcugug-3’(seqidno.9)

反义链为5’-cagcuuaauccgacuuagaaa-3’(seqidno.10)

使用invitrogen公司的lipofectamin^tm2000试剂盒提供的方法，将linc02422的sirna转染至生长对数期的乳腺癌bt474细胞，细胞转染前准备取培养箱中提前种植在6孔板中的细胞，转染后24h，对6孔板中细胞进行换液并继续培养。将实验分为3组，对照组(bt474)、阴性对照组(sirna-nc)和实验组(sirna1-3)。

4、qpcr检测linc02422的表达水平

1)rna的提取

在细胞转染后48h，使用trizol法提取细胞rna。

2)qpcr检测步骤同实施例2

5、结果

实验结果如图2所示，对照组(bt474)和阴性对照组(sirna-nc)之间，linc02422的表达水平无显著性差异(p>0.05)，相比对照组和阴性对照组，实验组能够显著降低linc02422的表达水平，差异具有统计学意义(p<0.05)，其中sirna2的效果最为显著，因此选择sirna2进行后续的实验。

实施例4cck-8法检测linc02422基因对乳腺癌细胞增殖的影响

将转染sirna2的乳腺癌细胞作为实验组，转染sirna-nc的细胞作为对照组，加入到96孔板中，每孔加入的细胞数量为5000个，每组设置5个复孔。分别用于24h、48h、72h、96h检测时间点检测。

检测时，细胞孔中加入10μl的cck-8检测液，将96孔板继续放入细胞培养箱中孵育4h左右，用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度值并记录数据，根据检测的od值的平均值，绘制生长曲线。

生长曲线结果显示，实验组在转染sirna后，细胞的增殖能力明显低于对照组(图3)，说明linc02422影响乳腺癌细胞的增殖，通过改变linc02422的表达水平可以改变乳腺癌细胞的增殖能力。

实施例5transwell小室检测linc02422对细胞迁移及侵袭的影响

1、transwell小室制备

无菌条件下matrigel冰浴融化后按1:8比例稀释matrigel胶，在transwell上室内部缓慢加入上室底部，铺胶后迅速移入37℃的细胞培养箱中温育至其凝固成胶状。

2、上室加入数量为1×10⁵的100μl细胞悬液，下室加入600μl含10％胎牛血清培养基，每组设置3个复孔，37℃下恒温培养箱内培养24h。

3、染色

取出transwell用pbs洗2遍，使用多聚甲醛进行固定，加入结晶紫染色，室温染色20min，用pbs漂洗2遍，放入荧光显微镜下观察并计数。

4、结果

transwell实验结果如图4所示，转染sirna的实验组细胞迁移和侵袭数目相比对照组都显著降低(p<0.05)，说明linc02422的表达水平与乳腺癌细胞的迁移和侵袭相关，linc02422有望成为治疗乳腺癌的靶标。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>德阳市人民医院

<120>与乳腺癌相关的lncrna标志物及其检测引物和应用

<150>2019102989088

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