一种转化合成左旋多巴效率提高的大肠杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种转化合成左旋多巴效率提高的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术：

酪氨酸酚裂解酶(tyrosinephenol-lyase，tpl，ec4.1.99.2)能够以丙酮酸钠、铵盐、邻苯二酚为底物合成左旋多巴，反应具有可逆性，需要plp为辅因子。该酶广泛存在于假单胞菌属、真菌、链霉菌等微生物中，其中草生欧文氏菌(erwiniaherbicola)、弗氏柠檬酸菌(citrobacterfreundii)中的酪氨酸酚裂解酶活性较高。5-磷酸吡哆醛(plp)不仅作为辅因子与酶形成复合物进行催化反应，而且在维持菌体的正常生长中起到了重要作用。在酪氨酸酚裂解酶(tpl)催化合成左旋多巴的反应中，plp与四聚体tpl活性中心的氨基酸arg100、phe123、asp214、arg217、lys257结合形成具有催化活性的tpl-plp复合物。左旋多巴产量并非与plp浓度呈正相关，plp浓度在30μm-90μm范围内最佳，而且过多地积累plp与l-dopa形成复合物，因此如何避免外源添加辅因子plp，如何调控胞内辅因子plp的合成水平是目前存在的问题。

技术实现要素：

要解决的问题上如何通过胞内辅因子plp合成途径避免外源添加辅因子plp，并实现对胞内辅因子plp的合成水平的调控。目标是获得既能够表达酪氨酸酚裂解酶又能够提高胞内辅因子plp积累水平的用于转化合成左旋多巴的重组大肠杆菌，并且实现了对胞内辅因子plp合成量在翻译水平的自反馈调控，利用获得的重组菌全细胞转化生产左旋多巴。

本发明的第一个目的是提供一种转化合成左旋多巴效率提高的菌株，其特征在于，共表达编码酪氨酸酚裂解酶(tpl)与谷氨酰胺酰胺基转移酶亚基(glutamineamidotransferaseforpyridoxalphosphatesynthesis,pdxst)的基因，加强辅因子5-磷酸吡哆醛(plp)的再生，并在pdxst基因对应的sd区上游引入核糖开关调控辅因子plp的合成量。

在一种实施方式中，编码所述酪氨酸酚解酶的基因geneid为838144，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

在一种实施方式中，编码所述谷氨酰胺酰胺基转移酶亚基的基因pdxst的geneid为kr821087.1，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

在一种实施方式中，编码所述核糖开关的基因thim的核苷酸序列如seqidno.3所示。

在一种实施方式中，编码所述核糖开关的基因thic的核苷酸序列如seqidno.4所示。

在一种实施方式中，所述菌株以大肠杆菌为宿主。

本发明的第二个目的是提供一种构建所述菌株的方法，其特征在于，pcr扩增编码pdxst酶的基因pdxst的基因，克隆到质粒pet-28-tpl(e313m)(质粒的构建方法记载于公开号为cn109897845a的专利申请文件中)，构建重组质粒pet-tplst，并引入核糖开关构建重组质粒pet-tplst-ribo1转化大肠杆菌bl21(de3)，得到重组菌。

本发明的第三个目的是提供一种制备左旋多巴的方法，是以上述任一所述的菌株作为细胞催化剂，以15-20g/l丙酮酸、8-12g/l邻苯二酚、20-35g/l铵盐为底物，以na2so32-4g/l与edta1-2g/l作为抗氧化剂进行转化反应。

在一种实施方式中，所述细胞催化剂的添加量为9-10菌体干重/l反应液。

在一种实施方式中，所述细胞催化剂按下述方式制备：将上述任一所述的菌株在36-37℃下发酵2-3h，再加入诱导剂0.3-0.4mm的iptg并降温至20-25℃，继续发酵10-11h，离心，收集菌体细胞。

在一种实施方式中，所述发酵用的发酵培养基组成为：蛋白胨10-20g/l，酵母提取物20-30g/l，甘油2-8ml/l，配制900ml；各组分溶解后高压灭菌，冷却到60-80℃，再加100ml灭菌的10-20mmol/lkh2po4和50-100mmol/lk2hpo4的溶液。

在一种实施方式中，所述收集菌体的条件为：4-10℃条件下4000-6000rpm离心10-15min收集菌体。

在一种实施方式中，所述转化反应体系用氨水调节ph为8.0-8.5。

在一种实施方式中，所述反应过程还补加丙酮酸和邻苯二酚；配制的丙酮酸母液和邻苯二酚母液均为200g/l，丙酮酸母液和邻苯二酚母液补加速率相同，在反应1-2h为40-50ml/h，在反应2-4h为10-30ml/h，在反应4-5h为10-20ml/h，在反应过程中维持丙酮酸和邻苯二酚浓度均不超过10g/l，于15-18℃、180-200rpm转化4-6h。

本发明还要求保护所述菌株或菌株的固定化制剂在制备左旋多巴或含左旋多巴的产品中的应用。

有益效果：本发明构建了一株共表达酪氨酸酚裂解酶和pdxst酶的重组菌，并提供了利用该重组菌全细胞转化生产左旋多巴，其中重组菌bl21-tplst-ribo1生产左旋多巴产量达到106.1g/l，相比对照菌株提高了2.3倍，而且l-dopa的生产强度提高到21.2g/l/h，对底物邻苯二酚的转化率高达98.7％，为代谢工程改造大肠杆菌生产左旋多巴奠定了基础。

附图说明

图1(a)为构建重组质粒示意图；图1(b)为核糖开关调控机理图。

图2为plp浓度对左旋多巴产量的影响。

图3为不同菌株胞内蛋白表达情况；其中，泳道1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11分别表示bl21-tpl(e313m)，bl21-st1，bl21-st2，bl21-st3，bl21-st4，bl21-tplst1,bl21-tplst2，bl21-tplst3,bl21-tplst4，bl21-tplst-ribo1,bl21-tplst-ribo2的胞内蛋白表达。

图4(a)为不同菌株的辅因子plp合成量；(b)为不同菌株转化的左旋多巴产量。

具体实施方式

表1pcr引物

注：粗体碱基表示酶切位点，下划线碱基表示同源臂。

表2构建表达蛋白的菌株

胞内的plp合成量的测定方法：将细胞悬浮于pb(ph8.0)缓冲液，稀释到适宜浓度，置于冰水混合物，超声破碎。待细胞完全破碎后，12000rpm，4℃，离心10min去除沉淀，取上清液使用安捷伦hplc检测plp。收集上清后用0.22μm滤膜过滤，稀释至适宜浓度，荧光检测器，激发姑光300nm，吸收光400nm，c18柱(4.6×250mm)，流动相为0.1m的高氯酸钾、0.5g/l的亚硫酸钠、0.1m的磷酸二氢钾，磷酸调ph至3，0.8ml/min流速，柱温30℃，检测时间15min。

左旋多巴含量的测定方法：反应液离心收集上清后用0.22μm滤膜过滤，过滤后的样品利用安捷伦hplc系统进行检测，色谱柱为c18柱(4.6×250mm)，流动相为蒸馏水和甲醇，280nm紫外检测。检测条件为：0.8ml/min流速，甲醇：水＝1:4(v:v)，柱温40℃，检测时间25min。

生产强度的计算方法：生产强度＝产物产量(g/l)/生产时间(h)。

底物邻苯二酚的转化率计算方法：底物邻苯二酚的转化率＝[l-dopa产量(g/l)/197]/[邻苯二酚的消耗量(g/l)/110]，其中197和110分别为l-dopa和邻苯二酚的摩尔分子量。(计算示例：反应5h后底物邻苯二酚无残余，共消耗邻苯二酚60g/l，获得l-dopa106.1g/l，邻苯二酚和l-dopa的分子量分别为110，197，经计算对底物邻苯二酚的转化率为98.7％。)实施例1不同plp浓度对l-dopa合成量的影响

菌株bl21-tpl(e313m)在36-37℃下发酵2-3h，再加入诱导剂0.3-0.4mm的iptg并降温至20℃，继续发酵10h后，4℃条件下5000rpm离心10-15min收集菌体。以18g/l丙酮酸、10g/l邻苯二酚、30g/l铵盐为底物，na2so34g/l与edta2g/l作为抗氧化剂，氨水调节ph为8.5，全细胞催化剂菌体干重浓度为9g/l。分别向反应液中加入0μm，30μm，60μm，90μm，150μm的辅因子plp，在反应1h，3h，5h分别取样检测l-dopa合成量。结果如图2所示，在未辅因子plp的反应中，l-dopa合成量很低，反应1h为5.2+0.9g/l，而且随着反应时间的延长l-dopa合成量并没有明显提高，而在添加30μmplp的反应中,反应1h，3h，5h时l-dopa合成量分别为13.2±1.0g/l，23.6±0.9g/l，31.1±1.0g/l。

实施例2构建plp合成途径

将含有质粒pcdfduet-1、petduet-1、prsfduet-1的bacillussubtilis168，含有质粒pet28-tpl(e313m)的菌株jm109，于37℃，220rpm培养10h左右，按照上海生工sanprep质粒提取试剂盒、基因组试剂盒操作，构建不同的重组质粒(图1所示)。

将质粒pcdfduet-1的第二个t7启动子替换为trc启动子，改造获得质粒pcdfduet-1’。以b.subtilis168基因组为模板，使用带有酶切位点的引物(pdxst-f1/r1)pcr扩增pdxst基因。使用内切酶ndei-xhoi分别对柱回收的pdxst基因片段以及提取的质粒pcdfduet-1’、pcdfduet-1、petduet-1、prsfduet-1进行双酶切。将双酶切柱回收的pdxst基因片段分别与同样双酶切柱回收的pcdfduet-1’、pcdfduet-1、petduet-1、prsfduet-1使用solutioni连接8-10小时。转化，菌落pcr，将阳性菌株进行基因测序，将正确序列的质粒pcdfduet-pdxst’，pcdfduet-pdxst，petduet-pdxst，prsfduet-pdxst分别转化到e.colibl21感受态细胞，获得菌株bl21-st1，bl21-st2，bl21-st3，bl21-st4，其中pdxst基因均位于四个质粒pcdfduet-pdxst’，pcdfduet-pdxst，petduet-pdxst，prsfduet-pdxst的第二个启动子下游，pcdfduet-pdxst’的启动子为trc，pcdfduet-pdxst，petduet-pdxst，prsfduet-pdxst的启动子均为t7(图1所示)。

实施例3构建tpl-pdxst共表达质粒

将带有质粒pet28-tpl(e313m)的菌株bl21-tpl(e313m)制备感受态细胞，将测序正确的质粒pcdfduet-pdxst，petduet-pdxst分别转化到bl21-tpl(e313m)感受态细胞中，构建双质粒大肠杆菌bl21-tplst1,bl21-tplst2。分别以测序验证正确的pcdfduet-pdxst’，petduet-pdxst为模板，分别使用带有同源臂的引物trc-pdxstf2/r2,t7-pdxstf3/r3pcr扩增带有trc启动子的pdxst基因和带有t7启动子的pdxst基因。使用hindiii单酶切质粒pet28-tpl(e313m)使其线性化，通过同源臂组装法获得tpl-pdxst融合表达的单质粒pet28-tplst-1和pet28-tplst-2，将测序正确的质粒转化到到e.colibl21感受态细胞，获得菌株bl21-tplst3,bl21-tplst4。由于菌株bl21-tplst4合成的plp过量，将合成的核糖开关基因thim，thic分别插入到质粒pet28-tplst-2的pdxst基因的sd序列上游位置，实现在翻译水平上下调plp合成量。核糖开关基因thim(ccttggtttgctgagccccacgggaagacgcacttccgactctttatgggcatagtggactagacctattacggtcgcatcccttcagtgc)，thic(ccttacggggtaaacgccccgattaaagaacagcctcacggaattgaccgactctggcaaataagccctaggcgccttggactagtccgattatggacgcttcccttgttc)由南京金唯智公司合成并克隆，构建质粒pet28-tplst-ribo1，pet28-tplst-ribo2，并分别转化到e.colibl21感受态细胞，获得菌株bl21-tplst-ribo1,bl21-tplst-ribo2。图1a为所有构建的质粒示意图，图1b为核糖开关机理解析图。

实施例4重组大肠杆菌的tpl与pdxst酶的表达情况

将构建的所有菌株发酵液8000rpm离心3min收集菌体，使用pb缓冲液(ph8.5，50mmkh2po4-k2hpo4)洗涤细胞2-3次，超声破碎至菌液完全破碎呈透明状，9000rpm离心3min收集上清。采用enhancedbcaproteinassaykit蛋白定量试剂盒(购于碧云天，货号：p0009)检测蛋白浓度，通过sds-page分析胞内蛋白表达情况(图3)，泳道1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11分别表示bl21-tpl(e313m)，bl21-st1，bl21-st2，bl21-st3，bl21-st4，bl21-tplst1,bl21-tplst2，bl21-tplst3,bl21-tplst4，bl21-tplst-ribo1,bl21-tplst-ribo2的胞内蛋白表达，tpl的蛋白分子大小为51kd，pdxst酶的两个亚基pdxs与pdxt蛋白分子量分别为35.3kd，23.4kd，在蛋白共表达的菌株中，tpl与pdxst均得到正常表达。

实施例5不同菌株胞内的辅因子plp的代谢水平

将培养的菌株发酵液8000rpm离心3min收集菌体，使用pb缓冲液(ph8.5，50mmkh2po4-k2hpo4)洗涤细胞2-3次，超声破碎至菌液完全破碎呈透明状，9000rpm离心3min收集上清。结果如图4a所示，bl21-tpl(e313m)，bl21-st1，bl21-st2，bl21-st3，bl21-st4，bl21-tplst1,bl21-tplst2，bl21-tplst3,bl21-tplst4，bl21-tplst-ribo1,bl21-tplst-ribo2胞内的plp合成量分别为2.0±0.2μm，18.2±1.1μm，36.7±2.2μm，79.6±2.5μm，69.1±2.5μm，6.1±0.3μm，14.1±0.59μm，16.9±2.5μm，31.5±1.2μm，24.7±2.8μm，20.9±2.0μm。

实施例6重组大肠杆菌全细胞转化法生产左旋多巴

将构建的bl21-tpl(e313m)，bl21-st1，bl21-st2，bl21-st3，bl21-st4，bl21-tplst1,bl21-tplst2，bl21-tplst3,bl21-tplst4，bl21-tplst-ribo1,bl21-tplst-ribo2大肠杆菌菌株分别接种lb平板(添加硫卡那霉素50mg/l)中，划线，37℃倒置培养12h左右长出大量菌落。

接种一环单菌落至lb培养基进行种子培养，37℃下220rpm培养12h，获得种子培养液。

按2％的接种量将种子培养液接种至发酵培养基中，37℃，220rpm培养3h后加入诱导剂0.4mm的iptg并降温至20℃继续发酵10h，不同菌株的细胞生长情况相似，od600均在23-25。

制备获得的发酵液6000rpm离心10min，收集湿菌体。将制备获得的湿菌体加入到转化液中，装液量50ml每500ml三角瓶，全细胞催化剂菌体干重浓度为9g/l，转化液含有丙酮酸钠18g/l，邻苯二酚12g/l，乙酸铵30g/l，na2so34g/l，edta2g/l，氨水调节ph至8.5。反应条件为15℃，180rpm，避光，配制的丙酮酸母液和邻苯二酚母液均为200g/l，丙酮酸母液和邻苯二酚母液补加速率相同，在反应1-2h为50ml/h，在反应2-4h为20ml/h，在反应4-5h为20ml/h，，于15-18℃、180-200rpm转化5-6h。反应5h后，向反应液中按20％体积量加入0.1m的盐酸，制备获得的反应液10000rpm离心3min，收集上清。

以单独表达tpl的bl21-tpl(e313m)重组菌为对照，在相同条件下培养、发酵，分别在全细胞转化反应体系分别中加入30μm的辅因子plp或不添加。

l-dopa合成量如图4b所示，在未添加辅因子plp的反应体系中，反应全程l-dopa合成量均较低，7g/l左右，添加30μm的辅因子plp的对照组中反应4h后l-dopa产量最高为32.8±2.7g/l，而菌株bl21-tplst1,bl21-tplst2，bl21-tplst3,bl21-tplst4，bl21-tplst-ribo1,bl21-tplst-ribo2的l-dopa最高合成量分别为14.7±0.2g/l，66.8±1.2g/l，18.9±0.4g/l，35.6±0.8g/l，104.4±2.3g/l，93.6±1.1g/l。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种转化合成左旋多巴效率提高的大肠杆菌及其应用

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1371

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgaactatccggcagaaccgtttcgcatcaaaagcgtcgaaaccgttagcatgatcccg60

cgcgacgaacgtctgaaaaagatgcaggaagcgggttataacacctttctgctgaacagc120

aaagacatctacatcgacctgctgaccgattctggtaccaacgcgatgtccgataaacag180

tgggctggtatgatgatgggcgacgaagcatacgcgggtagcgaaaacttttaccacctg240

gaacgtaccgttcaggaactgtttggcttcaaacacattgttccgacccatcaaggtcgc300

ggtgcagaaaatctgctgagtcagctggcaattaaaccgggtcagtacgttgccggtaac360

atgtacttcaccaccacccgctatcatcaggagaaaaacggcgcggtcttcgtcgatatt420

gttcgcgacgaagcacacgacgcaggtctgaatatcgcgttcaaaggcgacatcgacctg480

aaaaaactgcagaaactgatcgacgagaaaggcgcagaaaacattgcgtatatctgcctg540

gcagttaccgttaatctggcaggcggtcaaccggtttctatggcaaatatgcgcgcagtt600

cgcgaactgaccgcagcacacggtattaaagtcttttacgacgctacccgttgcgttgaa660

aacgcgtacttcatcaaagagcaggagcagggcttcgaaaacaaaagcatcgcggagatc720

gtccacgaaatgtttagctacgctgacggttgcaccatgtctggcaaaaaagactgcctg780

gtcaacattggcggctttctgtgcatgaacgacgacgaaatgttcagcagcgcgaaagaa840

ctggtcgttgtttacgaaggtatgccgtcttacggtggtctggctggtcgcgatatggaa900

gcaatggcaattggtctgcgcgaagcaatgcagtacatgtacatcgagcatcgcgtcaaa960

caggttcgctatctgggcgacaaactgaaagcagcaggtgttccgattgttgaaccggta1020

ggcggtcacgcagtttttctggacgcacgtcgtttttgcgaacatctgacccaggacgaa1080

tttccggcacaaagtctggcagcaagcatttacgttgaaaccggcgtccgtagtatggaa1140

cgcggtattattagcgcgggtcgtaataacgttaccggcgaacatcatcgtccgaaactg1200

gaaaccgttcgtctgaccattccgcgtcgcgtttatacctacgcgcacatggacgttgtc1260

gcggacggtatcatcaaactgtaccagcataaagaggacatccgcggcctgaaattcatc1320

tacgagccgaaacagctgcgctttttcaccgcgcgcttcgactatatctaa1371

<210>2

<211>1497

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atggctcaaacaggtactgaacgtgtaaaacgcggaatggcagaaatgcaaaaaggcggc60

gttatcatggacgtcatcaatgcggaacaagcgaaaattgctgaagaggctggagctgta120

gctgtaatggcgctagagcgtgtaccagctgatattcgcgcggctggaggagttgcccgt180

atggctgaccctacaatcgtggaagaagtaatgaatgcagtatctatcccagtaatggca240

aaagcgcgtatcggacatattgttgaagcgcgtgtgcttgaagctatgggtgttgactat300

attgatgaaagtgaagttctgactccggctgacgaagaatttcatttgaataaaaatgaa360

tacacagttcctttcgtttgcggctgccgtgatcttggtgaagcaacacgccgtattgct420

gaaggcgcttctatgcttcgtacgaaaggtgagcctggaacagggaatatcgttgaggct480

gttcgccatatgcgcaaagtaaacgctcaagtgcgcaaagtagttgcgatgagtgaggat540

gaactcatgacagaagcgaaaaacttaggtgctccttacgaacttcttcttcaaattaaa600

aaagatggcaagcttcctgtcgttaactttgccgctggcggtgtagccactcctgctgat660

gctgctctcatgatgcagcttggtgctgacggagtatttgttggttctggtattttcaaa720

tcagacaaccctgctaagtttgcgaaagcaattgtggaagctacaactcactacactgat780

tacaaattgatcgctgagctttcaaaagagcttggtactgcaatgaaagggattgaaatc840

tcaaacttacttccagaacagcgtatgcaagaacgcggctggtaagaatataggagcgct900

gctgacatgttaacaataggagtactaggacttcaaggagcagttagagagcatatccat960

gcaattgaagcatgcggtgcggctggtcttgtcgttaaacgccctgagcagctgaacgaa1020

attgacggactgattttacctggcggtgagagcacgacgatgcgccgtttgattgatacg1080

tatcaattcatggagccgcttcgtaattttgctgctcagggaaaaccgatgttcgggaca1140

tgcgccggattaattatattagcaaaagaaattgctggttcagataatcctcatttaggt1200

ctgctgaatgtggttgttgagcgtaattcgtttggccggcaggttgacagctttgaagct1260

gatttaacaatcaaaggcctggacgagccttttacaggggtattcatccgcgcgccgcat1320

attttagaagctggtgaaaatgtggaggttctttcggagcataatggtcgtattgtagct1380

gctaaacaggatcaattcctgggctgctcgttccatccggagctgacagaagatcaccga1440

gtgacacagctgtttgttcaaatggttgaggaatataagcaaaaggcacttgtataa1497

<210>3

<211>91

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ccttggtttgctgagccccacgggaagacgcacttccgactctttatgggcatagtggac60

tagacctattacggtcgcatcccttcagtgc91

<210>4

<211>111

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ccttacggggtaaacgccccgattaaagaacagcctcacggaattgaccgactctggcaa60

ataagccctaggcgccttggactagtccgattatggacgcttcccttgttc111