本发明涉及一种利用全细胞转化生产1,2-氨基醇类化合物的方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。
背景技术：
2-氨基-1-苯乙醇是一种重要的医药中间体，可用作治疗心血管疾病的美托洛尔(metoprolol)及奈必洛尔(nebivolol)的合成原料。因此，2-氨基-1-苯乙醇在医药、化学合成等领域均具有重要的应用。
目前，2-氨基-1-苯乙醇的制备主要通过化学合成法和生物转化法。其中，化学合成法虽然工艺成熟，但反应条件剧烈，且会生成许多副产物，有时还需要利用一些会对环境造成污染的有机溶剂；相比之下，生物转化法的条件相对温和，安全且成本低，另外，生物转化法生成的2-氨基-1-苯乙醇具有光学纯度高、特异性强、副产物少等优点，因此，近年来生物法制备2-氨基-1-苯乙醇得到了广泛关注。
在2-氨基-1-苯乙醇的生物合成方面，国外起步较早。2006年，iwasaki等利用产(r)-转氨酶的节杆菌(arthrobactersp.)，结合全细胞转化的方法，以3,4-二甲氧基苯丙酮作为底物，(r)-1-苯乙胺作为氨基供体，成功地合成了(r)-3,4-二甲氧基安非他命[(r)-dma]，且转化率达到82％，ee值大于99％，但是，此方法存在底物价格高、转化时间长(20h以上)、有副产物生成等的缺陷；2016年，韩国的shukewu利用共表达恶臭假单孢菌gpo1来源醇脱氢酶和紫色色杆菌来源ω-转氨酶的大肠杆菌，结合全细胞转化的方法，以苯基-1,2-乙二醇作为底物，成功催化得到了2-氨基-1-苯乙醇，且转化率达到65％以上，但是，此方法也存在底物价格高、摩尔转化率低、中间产物易积累等的缺陷，这些缺陷均大大限制了2-氨基-1-苯乙醇的应用。
在其他1,2-氨基醇类化合物的生物合成方面，目前报道的多是化学法合成2-氨基1-丙醇和2-氨基1-丁醇，生物法合成此类氨基醇的研究较少。
因此，有必要寻找一种稳定高效且成本低廉的制备1,2-氨基醇类化合物的方法。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种共表达醇脱氢酶(mnadh)和ω-转氨酶(pakω-ta)枯草芽孢杆菌工程菌以及利用此枯草芽孢杆菌工程菌全细胞转化生产2-氨基-1-苯乙醇的方法。
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌工程菌，所述枯草芽孢杆菌工程菌共表达醇脱氢酶和ω-转氨酶，所述醇脱氢酶的氨基酸序列如seqidno.7所示，所述ω-转氨酶的氨基酸序列如seqidno.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述醇脱氢酶来源于新金分支杆菌(mycobacteriumneoaurum)。
在本发明的一种实施方式中，编码所述醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，编码所述ω-转氨酶的基因的核苷酸序列如genbank:lr657304.1的第345243-346610位所示。
在本发明的一种实施方式中，所述ω-转氨酶来源于铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)pak。
在本发明的一种实施方式中，所述ω-转氨酶的氨基酸序列如seqidno.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌工程菌以pma5为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌工程菌以枯草芽孢杆菌168为表达宿主。
本发明提供了一种生产2-氨基-1-苯乙醇的方法，所述方法是以苯基-1,2-乙二醇为底物，以上述枯草芽孢杆菌工程菌为全细胞催化剂。
在本发明的一种实施方式中，催化过程中还添加了辅酶nadp+、氨基供体l-glu以及氯化铵。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌工程菌按照0.5-5g菌体细胞/g底物的比例添加至含苯丙氨酸的反应体系中。
在本发明的一种实施方式中，所述转化是在35～39℃，转化10～15h。
在本发明的一种实施方式中，所述全细胞催化剂是：将上述枯草芽孢杆菌工程菌用lb培养基活化后于37℃、160r/min的条件下培养12h，得到种子液；将种子液以1％的接种量转接入100ml的lb液培养基中，继续培养2h至od600为0.8，得到发酵液；发酵液7℃诱导12h后，于4℃，8000r/min的条件下离心10min收集菌体；将菌体用ph7.5的磷酸盐缓冲液清洗两次后获得的。
本发明提供了上述枯草芽孢杆菌工程菌在制备1,2-氨基醇类化合物方面的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明的枯草芽孢杆菌工程菌共表达了醇脱氢酶(mnadh)和ω-转氨酶(pakω-ta)，可一步全细胞催化苯基-1,2-乙二醇合成2-氨基-1-苯乙醇；
(2)本发明的枯草芽孢杆菌工程菌所表达的醇脱氢酶和转氨酶的催化速率达到较好的配比，以去除催化途径中限速步骤带来的影响(将本发明的枯草芽孢杆菌工程菌于培养基中培养至od600为0.8后在培养基中诱导12h，可使发酵液中醇脱氢酶的酶活高达0.78u/ml)；
(3)利用本发明的方法制备1,2-氨基醇类化合物，操作方便、底物廉价，不仅能提高转化效率，同时也降低了反应成本，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的bacillussubtilis168感受态细胞购自上海生工生物工程股份有限公司。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
pakω-ta酶活测定方法：
1ml反应体系包括150μl的10mm环氧苯乙烷以及50μl的酶液；
酶活定义：37℃下，1min转化1μmol羟基苯乙醛生成2-氨基1-苯乙醇的酶量定义为1个酶活力单位(u)。
mnadh酶活力测定方法：
1ml反应体系包括790μl的50mm磷酸盐缓冲液(ph8.0)、150μl的10mm苯基1,2-乙二醇、10μl的1μmolnadp+以及50μl的酶液；
反应结束后，根据反应液在340nm下的nadph吸光值变化测定活力；
酶活力单位定义：1min产生1μmolnadph所需要的酶量。
1,2-氨基醇化合物产量测定方法：
色谱条件：色谱柱：dinosoilc18(5μl，250nm×4.6nm)，流动相：乙腈-水(v/v＝85:15)，柱温：30℃，进样量：10μl，流速：1.0ml/min。
色谱结束后，于220nm紫外波长检测特征吸收峰，其中，产物标准品浓度为0.5g/l。
底物苯基-1,2-乙二醇浓度的测定方法：
色谱条件：色谱柱：sepaxcarbomixh-np(10:8，7.8mm*300mm)，流动相：3mm高氯酸溶液，柱温：50℃，进样量：10μl，流速：1.0ml/min。
色谱结束后，于338nm紫外波长检测特征吸收峰，其中，中间产物标准品浓度为0.5g/l。
下述实施例中涉及的培养基如下：
lb固体培养基：10g/l蛋白胨、5g/l的酵母膏、10g/l的nacl、0.2g/l的琼脂粉。
lb液体培养基：10g/l蛋白胨、5g/l的酵母膏、10g/l的nacl。
实施例1：重组质粒的构建
具体步骤如下：
(1)根据ncbi中mycobacteriumneoaurum的全基因组核酸序列中mnadh基因序列(seqidno.1)，设计醇脱氢酶mnadh的pcr引物p3和p4(seqidno.3和seqidno.4)；
(2)根据ncbi中pseudomonasaeruginosapak的全基因组核酸序列(genbank:lr657304.1)中pakω-ta基因序列(第345243-346610位)(编码的氨基酸序列为seqidno.2)，设计ω-转氨酶pakω-ta的pcr引物p5和p6(seqidno.5和seqidno.6)；
(3)以上述基因组dna为模板，利用上述引物做pcr扩增，扩增条件为：95℃预变性5min，一个循环；95℃变性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃终延伸10min，扩增结束后，采用凝胶回收试剂盒对pcr产物进行纯化和回收；
(4)回收产物mnadh、pakω-ta与pma5分别经bamhi/hindiii和bglii/ecorv酶切后通过pcr连接。
实施例2：重组菌的构建
具体步骤如下：
取100μl的e.colibl21感受态细胞放入1.5ml离心管中，分别加入5μl需要转化的重组质粒pma5-mnadh-pakω-ta，轻轻吹吸，并在冰上放置45min；将离心管放入42℃精确热激90s后再置于冰上5min，然后加入800μllb液体培养基，37℃摇床培养1-1.5h；离心后弃去大部分上清，重新吹吸悬浮，将剩余菌液涂布于含有氨苄抗性的lb平板上，待转化子长出后提质粒验证，得到重组菌b.s168/pma5-mnadh-pakω-ta。
实施例3：重组菌的验证
具体步骤如下：
(1)将实施例2得到的重组菌b.s168/pma5-mnadh-pakω-ta用lb培养基活化后于37℃、160r/min的条件下培养12h，得到种子液；
(2)将种子液以1％的接种量转接入100ml的lb液培养基中，继续培养2h至od600为0.8，得到发酵液；
(3)发酵液7℃诱导12h后，于4℃，8000r/min的条件下离心10min收集菌体；
(4)将菌体用ph7.5的磷酸盐缓冲液清洗两次后，取菌体加入催化体系中于37℃反应10h，得到反应液；其中，菌体在催化体系中的od600＝30，除菌体外，催化体系还含有100mm底物苯基-1,2-乙二醇、5mml-glu、0.02mmnadp+p和275mmnh4cl(ph8.0)；
(5)将反应液稀释并用0.22μm滤膜过滤后经hplc分析。
hplc分析结果显示：重组菌b.s168/pma5-mnadh-pakω-ta全细胞转化100mm苯基-1,2-乙二醇10h后，产物2-氨基1-苯乙醇的量为98.6mm，中间产物羟基苯乙醛无积累；
该结果表明，重组菌b.s168/pma5-mnadh-pakω-ta转化制备2-氨基1-苯乙醇，产物的摩尔转化率能达到98.6％，且无中间产物积累，适用于工业化生产。
实施例4：重组菌的转化其他底物的应用
具体步骤如下：
以1,2-丙二醇为底物：将实施例3获得的重组菌b.s168/pma5-mnadh-pakω-ta用lb培养基活化后于37℃、160r/min的条件下培养12h，得到种子液；将种子液以1％的接种量转接入100ml的lb液培养基中，继续培养2h至od600为0.8，得到发酵液；发酵液37℃培养12h后，于4℃，8000r/min的条件下离心10min收集菌体；将菌体用ph7.5的磷酸盐缓冲液清洗两次后，取菌体加入催化体系中于37℃反应10h，得到反应液；其中，菌体在催化体系中的od600＝30，除菌体外，催化体系还含有100mm底物1,2-丙二醇、5mml-glu、0.02mmnadp+、0.35mmplp和275mmnh4cl(ph8.0)；将反应液稀释并用0.22μm滤膜过滤后经hplc分析。
以1,2-丁二醇为底物：将实施例3获得的重组菌b.s168/pma5-mnadh-pakω-ta用lb培养基活化后于37℃、160r/min的条件下培养12h，得到种子液；将种子液以1％的接种量转接入100ml的lb液培养基中，继续培养2h至od600为0.8，得到发酵液；发酵液37℃培养12h后，于4℃，8000r/min的条件下离心10min收集菌体；将菌体用ph7.5的磷酸盐缓冲液清洗两次后，取菌体加入催化体系中于37℃反应10h，得到反应液；其中，菌体在催化体系中的od600＝30，除菌体外，催化体系还含有100mm底物环氧丁烷、5mml-glu、0.02mmnadp+、0.35mmplp和275mmnh4cl(ph8.0)；将反应液稀释并用0.22μm滤膜过滤后经hplc分析。
hplc分析结果表明：重组菌全细胞转化100mm1,2-丙二醇10h后，产物2-氨基1-丙醇的量为94.3mm，重组菌全细胞转化100mm。1,2-丁二醇10h后，产物2-氨基1-丁醇的量为97.5mm，生成相应的1,2-氨基醇化合物摩尔产率分别达到94.3％和97.5％。
对比例1
将氨基酸序列如seqidno.7所示的醇脱氢酶替换为耻垢分支杆菌(mycolicibacteriumsmegmatis)来源的醇脱氢酶(ncbi：afp38728)，其余条件同实施例中一致。结果显示，利用得到的重组菌b.s168/pma5-msadh-pakω-ta转化制备2-氨基1-苯乙醇，产物的摩尔转化率低于80％。
对比例2
将氨基酸序列如seqidno.2所示的ω-转氨酶替换为紫色色杆菌(chromobacteriumviolaceum)来源的ω-转氨酶(ncbi：kx146841.1)，其余条件同实施例中一致。结果显示，利用得到的重组菌b.s168/pma5-mnadh-cvω-ta转化制备2-氨基1-苯乙醇，产物的摩尔转化率低于80％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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