本发明属于食品生物
技术领域：
，具体涉及一株酪丁酸梭菌及其应用。
背景技术：
：牛乳过敏（cma）是一种最常出现的食物过敏反应，3岁以下的儿童发病约占25%，占所有确诊的食物过敏病例的9%。牛乳过敏主要是牛奶蛋白引起的过敏，牛乳过敏在临床上是对乳蛋白的异常免疫反应，这可能是某种或多种蛋白产生免疫作用，与ige抗体结合并造成迅速的ige参与的反应。婴儿牛奶过敏现象目前已经引起了人们广泛关注，经过研究发现牛乳中主要的致敏蛋白是ɑ-乳白蛋白和β-乳球蛋白。为了降低牛乳蛋白的致敏性，目前已有很多方法，比如热处理、蛋白酶水解、乳酸发酵液降解等等。酪丁酸梭菌是一种人和动物肠道正常分布的革兰氏阳性芽孢杆菌，较非芽胞益生菌制剂具有耐热、耐酸和耐多种抗生素等生物学特性。酪丁酸梭菌能合成丁酸、乙酸等短链脂肪酸，以及多种氨基酸、b族维生素和维生素k，能分解胺类、吲哚类、硫化氢等有害物质，还能促进双歧杆菌、乳酸菌等益生菌的生长；而酪丁酸梭菌用于降解致敏蛋白的研究未见公开报道。技术实现要素：本发明的目的提供一株酪丁酸梭菌及其应用。该菌株可以降解牛奶中的主要致敏蛋白，尤其是过敏原中的β-乳球蛋白。第一方面，本发明提供一株酪丁酸梭菌，其保藏编号为gdmccno：60753。第二方面，本发明提供上述酪丁酸梭菌的培养方法。具体为，将酪丁酸梭菌接种至培养基，在37℃条件下厌氧培养。进一步的，所述培养基为rcm培养基，其成分为：蛋白胨1%(w/v)，牛肉粉1%（w/v），酵母粉0.3%(w/v)，葡萄糖0.5%(w/v)，可溶性淀粉0.1%(w/v)，氯化钠0.5%(w/v)，醋酸钠0.3%(w/v)，l-半胱氨酸盐酸盐0.05%(w/v)，琼脂0.05%(w/v)，ph6.0。进一步的，接种量为5%。第三方面，本发明提供上述酪丁酸梭菌在降解牛奶中致敏蛋白中的应用。所述致敏蛋白包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白。本发明提供了一种具体应用方法，包括：将酪丁酸梭菌接入rcm培养基培养活化，取活化好的酪丁酸梭菌转接到新鲜的rcm培养基中培养，离心去除上清液，用磷酸缓冲液将菌体重悬，形成不再增殖的菌悬液；将菌悬液与分离乳清蛋白混合反应。或将酪丁酸梭菌接入rcm培养基培养活化，取活化好的酪丁酸梭菌转接到新鲜的rcm培养基中培养，离心去除上清液，将离心得到的菌体加入缓冲液后进行细胞破碎得到细胞破碎液；将细胞破碎液与分离乳清蛋白混合反应。进一步的，酪丁酸梭菌培养条件为：37℃厌氧条件下培养24h。进一步的，所述分离乳清蛋白成分包括β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。进一步的，菌悬液/细胞破碎液与分离乳清蛋白混合反应的条件为：20~50℃条件下反应24h；优选37℃。本发明的酪丁酸梭菌是从新疆地区褐牛的粪便中分离得到，通过选择性富集筛选可获得水解牛乳蛋白的菌株。该菌株经过发酵后能有效降解β-乳球蛋白、α-乳白蛋白，因而可用于去除牛乳中的过敏原，降低过敏反应的发病率，还可发酵生产低致敏乳源蛋白基料、制备低致敏性奶制品，降低婴儿乳品过敏的风险。本发明所述的生物材料，其分类命名为酪丁酸梭菌（clostridiumtyrobutyricum）z816，于2019年8月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），保藏编号为gdmccno：60753，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。具体实施方式梭菌增殖培养基（rcm培养基）：蛋白胨1.0%(w/v)，牛肉粉1.0%（w/v），酵母粉0.3%(w/v)，葡萄糖0.5%(w/v)，可溶性淀粉0.1%(w/v)，氯化钠0.5%(w/v)，醋酸钠0.3%(w/v)，l-半胱氨酸盐酸盐0.05%(w/v)，ph6.0。梭菌选择性培养基（tsn培养基）：蛋白胨1.0%(w/v)，酵母粉0.3%(w/v),亚硫酸钠0.1%(w/v)，新生霉素0.003%(w/v)，多粘菌素0.003%(w/v)，ph6.0。实施例1酪丁酸梭菌的筛选方法取新疆褐牛的粪便样品10g，混匀后加入90mlpbs缓冲液中，置于100℃水浴10min，杀死非芽孢菌，转接至rcm培养基中37℃厌氧培养24h；在生长过程的对数期补料分批加入淀粉、木质纤维素等碳源，酪丁酸梭菌可分解利用多种碳源进行富集培养，提升自身活力的同时还可降低粪便中大肠杆菌的数量，培养24h后将上述培养液转接入tsn培养基中，37℃厌氧培养24h；酪丁酸梭菌具有一定的抗逆性，通过选择培养基可以进行二次筛选，将得到的样品分别稀释到10-2、10-4、10-6，取100μl涂布到分离乳清蛋白平板上，37℃培养48h；挑选有水解圈产生的菌落，再次转接到新的分离乳清蛋白平板上，37℃静置培养24h。观察水解圈大小及菌落形态，筛选水解圈最大的单菌落，转接于rcm培养基中活化12h后，再转接于含30%甘油的rcm培养基中藏于-80℃培养。该菌株的16srrna序列如seqidno：1，菌株鉴定结果表明是酪丁酸梭菌。实施例2酪丁酸梭菌菌悬液对α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的降解效果标准曲线的绘制：准确称量β-乳球蛋白标准品、α-乳白蛋白标准品8mg，加入2mlpbs进行溶解，配置成4mg/ml的标准原液，吸取适量原液，加入pbs进行稀释，稀释成4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mg/ml浓度梯度的标准溶液进行测定。色谱柱：bio-c8(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.1%三氟乙酸（tfa）水(a)，0.1%三氟乙酸(tfa)乙腈(b)，梯度洗脱条件：0～17.5min，b70%～50%；17.5~20min，b50%~70%。柱温：35℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长：280nm。根据标准品浓度和峰面积绘制标准曲线。将保藏于-80℃甘油管中的酪丁酸梭菌（clostridiumtyrobutyricum）z816以5%的接种量接入rcm培养基，在37℃厌氧条件下培养24h进行活化，以2%的接种量分别取活化好的酪丁酸梭菌转接到新鲜的rcm培养基中，在37℃厌氧条件下培养24h，8000rpm条件下离心10min，去除含有培养基的上清液，用磷酸缓冲液将菌体重悬，形成不再增殖的菌悬液。将菌悬液与3mg/ml的分离乳清蛋白样品（含有45%β-乳球蛋白和15%α-乳白蛋白）1：1进行混合，在37℃条件下有氧反应24h，8000rpm条件下离心10min，取上清液。以不加菌悬液的样品为对照，利用高效液相色谱法在所述色谱条件下分别检测样品中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的浓度。每个样品重复测定5次。表1.酪丁酸梭菌菌悬液对β-乳球蛋白、α-乳白蛋白的降解效果样品(不添加菌体)样品（添加菌体）去除率β-乳球蛋白浓度（mg/ml）1.350.2085.2%α-乳白蛋白浓度（mg/ml）0.450.2251.1%实施例3酪丁酸梭菌细胞破碎液对α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的降解效果标准曲线的绘制：准确称量β-乳球蛋白标准品、α-乳白蛋白标准品8mg，加入2mlpbs进行溶解，配置成4mg/ml的标准原液，吸取适量原液，加入pbs进行稀释，稀释成4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mg/ml浓度梯度的标准溶液进行测定。色谱柱：bio-c8(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.1%三氟乙酸（tfa）水(a)，0.1%三氟乙酸(tfa)乙腈(b)，梯度洗脱条件：0～17.5min，b70%～50%；17.5~20min，b50%~70%。柱温：35℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长：280nm。根据标准品浓度和峰面积绘制标准曲线。将保藏于-80℃甘油管中的酪丁酸梭菌(clostridiumtyrobutyricum)z816以2%的接种量接入rcm培养基，在37℃厌氧条件下培养24h进行活化，以2%的接种量分别取活化好的酪丁酸梭菌转接到新鲜的rcm培养基中，在37℃厌氧条件下培养24h，8000rpm条件下离心10min，去除含有培养基的上清液，将离心得到的菌体加入pbs后进行细胞破碎20分钟得到细胞破碎液。将细胞破碎液与3mg/ml的分离乳清蛋白样品（主要含有45%β-乳球蛋白和15%α-乳白蛋白）1：1进行混合，在37℃条件下有氧反应24h，8000rpm条件下离心10min，取上清液。以不加细胞破碎液的样品为对照，利用高效液相色谱法在所述色谱条件下分别检测样品中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的浓度。每个样品重复测定5次。表2.酪丁酸梭菌细胞破碎液对β-乳球蛋白、α-乳白蛋白的降解效果样品(不添加菌体)样品（添加菌体）去除率β-乳球蛋白浓度（mg/ml）1.350.1092.6%α-乳白蛋白浓度（mg/ml）0.450.0491.1%实施例4不同温度下酪丁酸梭菌菌悬液对α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的降解效果采用实施例2的方法制备菌悬液。将菌悬液与3mg/ml的分离乳清蛋白样品（含有45%β-乳球蛋白和15%α-乳白蛋白）1：1进行混合，分别在20℃、30℃、37℃、40℃、50℃条件下有氧反应24h，8000rpm条件下离心10min，取上清液。以不加菌悬液的样品为对照，利用高效液相色谱法在所述色谱条件下分别检测样品中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的浓度以计算致敏蛋白的去除率，每个样品重复测定5次。结果如下表3所示。表3不同温度下酪丁酸梭菌菌悬液对α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的降解效果20℃30℃37℃40℃50℃β-乳球蛋白去除率（%）78.683.185.282.177.6α-乳白蛋白去除率（%）48.250.451.149.847.6可以看出，菌悬液在20~50℃下均可稳定去除致敏蛋白。序列表<110>南京工业大学<120>一株酪丁酸梭菌及其应用<130>xb19112601<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1371<212>dna<213>酪丁酸梭菌z816(clostridiumtyrobutyricum)<400>1tgcagtcgagcgatgaaccccttcgggggtggattagcggcggacgggtgagtaacacgt60gggtaacctgcctcaaagtgggggatagccttccgaaaggaagattaataccgcataaag120ccaagtttcacatggaatttggatgaaaggagtaattcgctttgagatggacccgcggcg180cattagttagttggtggggtaatggcctaccaagacagcgatgcgtagccgacctgagag240ggtgatcggccacattggaactgagatacggtccagactcctacgggaggcagcagtggg300gaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcaacgccgcgtgagtgatgaaggtctt360cggattgtaaagctctgtcttttgggacgataatgacggtaccaaaggaggaagccacgg420ctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcgagcgttgtccggatttactg480ggcgtaaagggtgcgtaggcggatgtttaagtgagatgtgaaatacccgggcttaacttg540ggtgctgcatttcaaactggatatctagagtgcaggagaggagaatggaattcctagtgt600agcggtgaaatgcgtagagattaggaagaacaccagtggcgaaggcgattctctggactg660taactgacgctgaggcacgaaagcgtgggtagcaaacaggattagataccctggtagtcc720acgccgtaaacgatgagtactaggtgtaggaggtatcgaccccttctgtgccgcagtaaa780cacattaagtactccgcctgggaagtacgatcgcaagattaaaactcaaagg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