一种阳离子氨基脂质及其合成方法与应用与流程

本发明属于细胞转染领域，具体涉及一种阳离子氨基脂质及其合成方法与应用。

背景技术：

在目前所有类型的非病毒转染试剂中，基于脂质体的转染试剂是公认最为有效的一种。这是因为脂质体转染试剂简单易用，且往往具有很高的效率。脂质体是人工制备的具有双分子层结构的球形囊泡，它可以与其它双分子层，如细胞膜等融合，从而将其包裹的分子从细胞膜外传送至细胞内部。由于其独特的性能，脂质体被广泛用于药物传送。脂质体既可携带亲水分子，也可携带疏水分子，它可以很好的与生物活性分子结合，如各种药物、核酸、多肽等，并且可将这些物质传送至细胞内以调控细胞的状态。这为治疗疾病提供了一种新的方式。

阳离子脂质体可与带负电荷的核酸(dna)结合，并将其从细胞外送入细胞核内，使dna在细胞核内表达，从而调控细胞的生长。这在生命科学相关的研究中具有至关重要的作用，同时也作为“基因治疗”的一种方式，具有广阔的应用前景。迄今为止，存在一些商业化的阳离子脂质体，但高效低毒性的阳离子脂质体数量依然很有限。

目前脂质体转染试剂存在的主要问题如下：

1.适用范围有限。许多细胞系，尤其是初级细胞如干细胞等，绝大部分现有的脂质体试剂都无法有效的转染。

2.合成复杂，价格昂贵。由于目前主流的脂质体转染试剂往往具有极为复杂的结构，其生产和研发成本都较高，导致脂质体转染试剂的价格居高不下，这大大限制了脂质体转染试剂的应用范围。

因此，市场对高效而廉价的脂质体转染试剂具有巨大的需求。

技术实现要素：

解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种阳离子氨基脂质及其合成方法与应用，所述阳离子氨基脂质转染细胞具备低毒高效的特点，可以在血清中达到很好的效果，大大简化了转染的操作步骤。

技术方案：一种阳离子氨基脂质，所述阳离子氨基脂质的结构式如式(i)所示，

合成上述阳离子氨基脂质的方法，包括以下步骤：

步骤一.将炔丙胺和十二烷基硫醇以1:(1.5-2)的摩尔比加入四氢呋喃或二氯甲烷(dcm)溶液中，最终反应物总量的溶液浓度为30～500mg/ml，再加入自由基光引发剂，加入量为反应物总质量的1％～5％，通氮气除氧后置于紫外光下光照1～3h；

步骤二.将丙烯酸二甲氨基乙酯加入步骤一反应完的溶液中，丙烯酸二甲氨基乙酯与炔丙胺的摩尔比为(1～2):1，再加入碱性物质，碱性物质与炔丙胺的摩尔比为1:(10～50)，反应过夜得到最终产物阳离子氨基脂质。

作为优选，所述步骤一中自由基光引发剂为安息香二甲醚。

作为优选，所述步骤一中紫外光波长为250～365nm，强度为0.5～3mw/cm。

作为优选，所述步骤二中碱性物质为三乙胺或1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯。

上述的阳离子氨基脂质在制备脂质颗粒(即脂质体)中的应用。

作为优选，所述脂质颗粒含有生物活性剂sirna、质粒、mirna或mrna。

上述的阳离子氨基脂质在制备细胞转染试剂盒中的应用。

有益效果：(1)本发明所述方法反应条件温和，溶剂选择性大，大大降低了反应的难度，提高了产率，并且原料简单、便宜，大大降低了生成成本；

(2)本发明所述阳离子氨基脂质分子具有高效低毒的特点，可以在血清中达到很好的效果，大大简化了转染的操作步骤。

本发明所述方法是一种高度通用化的方法，可以在很大范围内改变所用原料的结构，合成大的氨基脂质库，并将其用于筛选实验。此类分子一端具有长的疏水链，另一端具有高度亲水的氨基，在水中其可形成双分子层的脂质体，并且具有带正电荷的氨基，可与dna结合，因此可作为转染试剂用于细胞转染。

附图说明

图1为实施例4中四种转染试剂的转染效率测试图。图中(a)为市售的磷酸钙颗粒转染试剂，(b)为先锋纳米技术的纳米粒子转染试剂，(c)为购自invitrogen的lipofectamine2000脂质体转染试剂，(d)是本发明中制备的脂质体；

图2为实施例4中市售产品与本发明所述产品荧光显微镜下观测效果图，图中(a)为本发明的脂质体，(b)为购自invitrogen的lipofectamine2000产品，(c)为购自先锋纳米技术的转染试剂产品。

具体实施方式

以下通过附图及实施例对本发明作进一步的阐述。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的包含范围不限于下述的实施例。

实施例1

一种阳离子氨基脂质，所述阳离子氨基脂质的结构式如式(i)所示，

上述阳离子氨基脂质的合成方法，包括以下步骤：

步骤一.将炔丙胺和十二烷基硫醇以1:1.5的摩尔比加入四氢呋喃溶液中，最终反应物总量的溶液浓度为30mg/ml，再加入自由基光引发剂，所述自由基光引发剂为安息香二甲醚，自由基光引发剂加入量为反应物总质量的1％，通氮气除氧后置于紫外光下光照1h，紫外光波长为250nm，强度为3mw/cm，得到化合物(ii)

步骤二.将丙烯酸二甲氨基乙酯加入步骤一反应完的溶液中，丙烯酸二甲氨基乙酯与炔丙胺的摩尔比为1:1，再加入碱性物质，所述碱性物质为三乙胺，碱性物质与炔丙胺的摩尔比为1：10，反应过夜得到最终产物阳离子氨基脂质，即化合物(i)

实施例2

一种阳离子氨基脂质，所述阳离子氨基脂质的结构式如式(i)所示，

上述阳离子氨基脂质的合成方法，包括以下步骤：

步骤一.将炔丙胺和十二烷基硫醇以1:2的摩尔比加入二氯甲烷(dcm)溶液中，最终反应物总量的溶液浓度为500mg/ml，再加入自由基光引发剂，所述自由基光引发剂为安息香二甲醚，自由基光引发剂加入量为反应物总质量的5％，通氮气除氧后置于紫外光下光照3h，紫外光波长为365nm，强度为0.5mw/cm，得到化合物(ii)

步骤二.将丙烯酸二甲氨基乙酯加入步骤一反应完的溶液中，丙烯酸二甲氨基乙酯与炔丙胺的摩尔比为2:1，再加入碱性物质，所述碱性物质为1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯，碱性物质与炔丙胺的摩尔比为1:50，反应过夜得到最终产物阳离子氨基脂质，即化合物(i)

实施例3

一种阳离子氨基脂质，所述阳离子氨基脂质的结构式如式(i)所示，

上述阳离子氨基脂质的合成方法步骤如下：

步骤一.合成2，3-双(十二烷基硫)-丙胺(化合物(ii))，将0.5mmol炔丙胺和1mmol十二烷基硫醇溶于3mlthf(四氢呋喃)中，再加入5mg自由基光引发剂安息香二甲醚(dmpa)，并转移至20ml玻璃小瓶中，通氮气除氧5min后将玻璃瓶置于365nmuv光下照射1h，反应式如下：

步骤二.向步骤一中反应后的玻璃小瓶中加入1mmol丙烯酸二甲氨基乙酯，搅拌均匀后加入0.1mmol碱性物质1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯，搅拌过夜。随后将溶液倒入25ml单口烧瓶中，将thf(四氢呋喃)蒸发，即得到最终产物阳离子氨基脂质，即化合物(i)反应式如下：此反应为麦克尔加成反应。

实施例4

基于实施例3制备的阳离子氨基脂质在制备转染试剂中的应用。

具体应用过程如下：

(1)将合成的阳离子氨基脂质分子溶于乙醇溶液制备脂质体。具体步骤是取2mg实施例3制备的阳离子氨基脂质加入1mlph为5的醋酸-醋酸钠缓冲液使阳离子氨基脂质分子充分水化，于旋蒸仪上孵育40min后即制得相应脂质体。

(2)取50纳克pbl-egfp溶于100微升pbs缓冲液中并加入50纳克步骤(1)制备的脂质体，并于室温下孵育30min得到脂质体质粒混合物。

(3)将hek293细胞用胰酶消化后用无血清dmem培养基稀释成10⁵个/ml的细胞悬液。

(4)于96孔板中加入100微升步骤(3)得到的细胞悬液后再加入100微升步骤(2)孵育后的脂质体质粒混合物。

(5)然后将96孔板置于细胞培养箱中孵育24小时后用荧光醇标仪检测结果。将步骤一中脂质体换成三种普通市售转染试剂，然后分别重复步骤(2)～(5)，结果如图1所示，由图可见，本发明中的脂质体比市场上主流的产品转染hek293细胞的效率高。

所述脂质体质粒混合物还可用于人骨髓间充质干细胞hbmsc的转染。s1.将hbmsc用胰酶消化后用无血清dmem培养基稀释成10⁵个/ml的细胞悬液；s2.取100微升细胞悬液加入96孔板，然后再加入100微升步骤(2)制得的脂质体质粒混合物；s3.将96孔板置于细胞培养箱中孵育24小时后用荧光醇标仪检测结果，在荧光显微镜下观测效果。将步骤(1)中脂质体换成两种普通市售转染试剂，然后分别重复步骤s1～s3，具体结果图参见图2，由图2可见本发明中的脂质体效果比市售的产品效果好。