本发明涉及一株降低生物胺的肉葡萄球菌及其应用，属于生物发酵技术领域。
背景技术：
肉葡萄球菌(staphylococcuscarnosus)是肉制品发酵行业中形成肉制品风味的关键菌种，在欧洲等地被用作发酵肉产品起始培养物已经超过60年。与其他葡萄球菌相比，它不产生任何毒素、溶血素、凝固酶或聚集因子，是葡萄球菌属中被完全确认的食品级gras(generallyregardedassafe)菌株。肉葡萄球菌具有很低的胞外蛋白水解能力，所以该菌可以作为基因克隆宿主菌用于分子遗传学方面进行葡萄球菌属相关代谢途径的研究，以及安全正常地表达和分泌异源蛋白。
豆酱，通常是以黄豆或蚕豆、面粉、辣椒及盐水为主要原料发酵而成的我国传统豆类调味食品。由于酿造过程中是一个开放式过程，故有多种微生物参与豆酱的发酵。历经复杂的生化反应，形成色香味俱一体的营养丰富的调味品。然而在其发酵过程中，经过微生物的作用往往形成多种多样的物质，其中包含一些有毒物质如生物胺。生物胺是一类含氮有机化合物，食品中常见的主要有以下八种，分别为腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、色胺、苯乙胺、组胺和酪胺。过量摄入生物胺可能会导致许多健康问题，如引发头痛、低血压、恶心、潮热、局部炎症、心悸、高血压和消化问题等，因此，为了保障食品安全，需要采取相关方法控制生物胺的含量。现代工厂可通过将食品进行辐照、气调包装、高静水压处理、添加食品添加剂和防腐剂等手段控制生物胺，但可能对人体有潜在危害。安全环保的生物学方法越来越被现代人们接受，如在食品发酵过程中添加降解生物胺的菌株或不产生生物胺的优势菌株，从而控制生物胺的含量。因此筛选一株既能适应豆酱生产环境又能高效降解生物胺的菌株，对于制备安全健康的豆酱具有重要的应用价值。
在文献《不同发酵剂对发酵香肠中风味物质释放及有害生物胺控制的影响》(公开日2019年7月5日)中，王德宝等将肉葡萄球菌与植物乳杆菌同时接种至发酵香肠中，结果表明，接种肉葡萄杆菌与植物乳杆菌的复合组和单一接种植物乳杆菌相比，在组胺和酪胺的降解中显示出优势：复合组降解率分别为4.8％和66.6％，高于单一组的3.8％和61.7％。由此，可以看出肉葡萄球菌对于生物胺有一定的降解能力。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是筛选得到一株肉葡萄球菌m43，已于2019年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18295，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的第二个目的是提供所述肉葡萄球菌m43的培养方法，所述方法是将肉葡萄球菌m43以10～50ml/l的接种量接种至培养基中，于35～40℃恒温环境中静置培养20～30h。
本发明的第三个目的是提供一种降低生物胺的方法，所述方法是将所述肉葡萄球菌m43以10～50ml/l的接种量接种至含生物胺的液体、半固体或固体中。
本发明的第四个目的是提供一种所述肉葡萄球菌m43的活化方法，所述方法是将肉葡萄球菌m43以10～50ml/l的接种量接种至培养基中。
在本发明的一种实施方式中，所述活化方法的培养条件为30～40℃培养20～30h。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基为改良mrs培养基。
本发明的第五个目的是提供一种降低豆酱中生物胺含量的方法，所述方法是在豆酱发酵第0天接种所述肉葡萄球菌m43，接种量为10～50ml/l，搅拌均匀后30～40℃发酵30～40天。
在本发明的一种实施方式中，肉葡萄球菌m43在豆酱中菌株浓度为103～109cfu/g。
本发明的第六个目的是提供应用所述肉葡萄球菌m43制备的豆酱产品。
在本发明的一种实施方式中，所述调味品包括黄豆酱或豆瓣酱或豆面酱。
本发明还提供所述肉葡萄球菌m43在食品领域降低生物胺含量方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包括需要用黄豆或蚕豆或肉类发酵的食品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包括酱油、香肠、鱼露。
有益效果：本发明提供的肉葡萄球菌m43是豆酱发酵过程中的无害菌，对于酪胺、亚精胺、腐胺和尸胺这4种发酵食品中常见的生物胺具有较明显的降解作用，降解率分别为50.88％、51.83％、31.14％和22.82％，可用于控制豆酱等发酵食品生产过程中的生物胺含量。并且肉葡萄球菌m43发酵豆酱中的风味物质的数量较对照高出了108.3％，风味物质种类更加多样。
生物材料保藏
本发明所提供的肉葡萄球菌(staphylococcuscarnosus)m43，已于2019年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18295，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
配制bas培养基：磷酸二氢钾2g、柠檬酸铵2g、氯化钠50g、七水合硫酸镁0.4g、硫酸锰0.03g、硫酸亚铁0.04g、硫胺素0.01g、葡萄糖2g、腐胺二盐酸盐100mg、尸胺二盐酸盐100mg、亚精胺100mg、精胺100mg、色胺100mg、苯乙胺100mg、组胺二盐酸盐100mg，酪胺盐酸盐100mg、琼脂20g、去离子水定容至1l。
配制改良mrs培养基：大豆蛋白胨10g，葡萄糖20g，氯化钠50g，柠檬酸氢二铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，腐胺二盐酸盐100mg，尸胺二盐酸盐100mg，亚精胺100mg，精胺100mg，色胺100mg，苯乙胺100mg，组胺二盐酸盐100mg，酪胺盐酸盐100mg，去离子水定容至1l。
生物胺含量测定：使用液相色谱法方法测定，具体步骤参见朱天傲等《国产酱类产品中的生物胺》。
菌株的活化方法：将菌株以20ml/l的接种量接种至培养基中，37℃恒温培养箱静置培养24h。
实施例1生物按降解菌株的筛选及鉴定
(1)生物胺降解菌株的初筛：
取5g酱醅于100ml锥形瓶中，加入50ml生理盐水，于摇床上充分振荡混匀，取悬浮液进行梯度稀释至10-5，每个梯度取100μl悬浮液于bas固体培养基和改良mrs固体培养基进行涂布，并于37℃培养箱进行培养，待菌落生长良好，方可分离。
生物胺降解率测定：将从bas固体培养基和改良mrs固体培养基分离的单菌落分别在lb和改良mrs培养基进行活化，调节初始od值在含有100mg/l生物胺的磷酸盐缓冲液中为0.6，并在37℃培养箱中静置培养24h。通过4000×g离心5min得到上清液经过0.22μm滤膜过滤，并取2ml放入10ml离心管中，加入1ml2mol/lnaoh溶液和20μl苯甲酰氯溶液，立即将离心管放入水浴恒温振荡器，30℃、200r/min振荡20min。振荡结束后加入2ml饱和nacl溶液停止衍生化反应，再加入3ml无水乙醚进行生物胺的萃取，使用涡旋震荡仪萃取1min，小心吸取上清液置于5ml离心管中，使用氮吹仪吹干。用1ml乙腈溶解管中残留物，0.22μm有机滤膜过滤后上机检测，然后利用液相色谱法测定生物胺含量，与空白组对比，测定生物胺的降解率。如表1所示，生物胺降解率较高的菌株即为初筛菌株(l与m开头的编号分别为从bas固体培养基和改良mrs固体培养基筛选出的菌株，由bas固体培养基筛出的菌株均为芽孢杆菌，改良mrs固体培养基中筛出的菌株种类丰富，包括芽孢杆菌葡萄球菌、乳酸菌等多种微生物)。
表1缓冲液中不同菌株对八种生物胺降解能力的比较
注：nd表示未检测到
(2)生物胺降解菌株的复筛：
发酵液中生物胺降解率的测定：使用bas培养基和改良mrs培养基对初筛菌株进行活化，并调节初始od值使其在含100mg/l生物胺的bas培养基和改良mrs培养基中为0.1，并在37℃培养箱中静置培养24h，随后4000×g离心5min。上清液经过0.22μm滤膜过滤后，将2ml滤液与同体积6g/l三氯乙酸溶液，在30℃、200r/min的水浴恒温振荡1h，取上清液进行衍生反应，步骤同上，最终通过液相色谱方法测定生物胺含量，并与空白组对比，测定生物胺的降解率，筛选生物胺降解率较高的复筛菌株。如表2所示，肉葡萄球菌m43对腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、组胺、酪胺的降解率分别为12.34±0.66％、8.17±0.35％、1.51±0.81％、17.88±1.70％、50.69±4.27％和40.77±0.73％。
表2发酵液中不同菌株对八种生物胺降解能力的比较
注：nd表示未检测到
提取肉葡萄球菌m43菌株基因组dna，使用引物：
27f：5’agagtttgatcctggctcag3’
1492r:5’tacggctaccttgttacgactt3’
进行16srdnapcr扩增。pcr反应条件为：94℃预变性5min、94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸90s，共34个循环；最后在72℃延伸10min。对得到的pcr产物进行纯化和测序，将所得序列在ncbi数据库中进行blast序列比对，经鉴定为肉葡萄球菌，并命名为m43。
实施例2利用肉葡萄球菌的豆酱制备
首先以黄豆、盐水和面粉为原料，加入量分别为38g/100g、50g/100g、12g/100g。以米曲霉3.042为发酵菌种加入大豆中使得其终浓度为107cfu/g，30℃恒温培养24h制曲，制曲完成后入缸拌20％(w/v)盐水使其终浓度为10g/100g，在入缸时接种10-50ml/l的肉葡萄球菌m43，使得酱中菌株浓度为107cfu/g，以没有接入肉葡萄球菌的酱醅作为对照，于对照组和实验组分别加入5g/l的腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、色胺、苯乙胺、组胺和酪胺混合溶液5ml，并于37℃恒温培养箱静置发酵35天。测定发酵35天后豆酱样品中的生物胺含量，生物胺含量测定参照实施例1生物胺降解菌株的复筛中的测定方法，并以如下公式计算生物胺降解率：
x:生物胺降解率；
c1:未接种菌株样品生物胺浓度；
c2:接种肉葡萄球菌菌株样品生物胺浓度。
如表3所示，肉葡萄球菌m43在豆酱发酵过程中进行接种可以有效降低豆酱中八种主要生物胺的含量，其对于腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、苯乙胺、组胺和酪胺的降解率分别为31.14％、22.82％、51.83％、25.43％、8.69％、11.79％和50.88％，对色胺没有降解能力，上述结果显示出肉葡萄球菌m43具有良好的生物胺降解效果。
表3肉葡萄球菌m43对八种生物胺降解能力
注：nd表示未检测到
实施例3肉葡萄球菌的耐盐性
(1)使用改良mrs培养基对肉葡萄球菌m43和来源于该黄豆酱的另一株肉葡萄球菌m30进行活化，并调节初始od值使其在改良mrs培养基中为0.1；
(2)向100g培养基中分别加入0g、3g、6g、9g、12g、15g、18g的nacl，使nacl终浓度分别为0％、3％、6％、9％、12％、15％、18％；
(3)并在37℃培养箱中静置培养24h；
(4)分别计算其活菌数，菌株m43与m30的活菌数见表4。
表4肉葡萄球菌在不同浓度nacl中的活菌数(logcfu/ml)
实施例4肉葡萄球菌的耐热性
(1)使用改良mrs培养基对肉葡萄球菌m43和来源于黄豆酱的肉葡萄球菌进行活化，并调节初始od值使其在改良mrs培养基中为0.1；
(2)在不同温度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃静置培养24h；
(3)分别计算其活菌数，菌株m43与m30的活菌数见表5。
表5肉葡萄球菌在不同温度下的活菌数(logcfu/ml)
实施例5肉葡萄球菌对豆酱风味的影响
豆酱风味物质测定方法：准确称取2g左右酱醅于15ml固相微萃取瓶中，分别先后加入2g固体nacl，6ml脱二氧化碳的水，并加入20μl25mg/l2-辛醇内标，放入转子后拧紧盖子并放入55℃带有磁力搅拌器的恒温水浴锅中，磁力搅拌速度为400r/min。将萃取头通过固相微萃取瓶盖插入到瓶中的空气部分后推出纤维头，开启磁力搅拌器，顶空吸附40min后抽回纤维头。
色谱条件：
db-wax毛细管色谱柱，柱长30mm，内径0.32mm，液膜厚度0.25μm；载气：he；流速：10ml/min，不分流；柱温：进样口温度保持在250℃；升温程序设置为：起始气相色谱柱温度40℃，保持3.5min，以5℃/min升温至90℃，再以12℃/min升温至230℃，保持10min。
质谱条件：
电离模式：ei+；发射电流(μa)：200；驱电压(v)：0.5；电子能量(ev)：70；镜片1(v)：4，镜片2(v)：35；离子能量(ev)：1.8；离子能量斜坡(mv·amu-1)：0.0；界面温度(℃)：250；离子源温度(℃)：200；低质量分辨率：18.0；高质量分辨率：12.6；探测器电压(v)：350；扫描质量范围：33～450amu。
(1)以黄豆、盐水和面粉为原料，加入量分别为38g/100g、50g/100g、12g/100g，以米曲霉3.042为发酵菌种加入大豆中使得其终浓度为107cfu/g，30℃、24h制曲，制曲完成后入缸拌入20％(w/v)盐水使其终浓度为10g/100g；
(2)实验组：在入缸时接种10-50ml/l的肉葡萄球菌m43；对照组：在入缸时接种相同量的肉葡萄球菌m30，所述肉葡萄球菌来源于黄豆酱；
(3)于37℃恒温培养箱静置发酵35天；
(4)发酵结束后，对豆酱挥发性风味物质进行分析，菌株m43与m30的风味物质统计见表6和表7。
在表7中，肉葡萄球菌m43的风味物质共有50种，比肉葡萄球菌m30的24种风味物质种类高出了26种，可见肉葡萄球菌m43的风味物质种类更加多样。
表6接种不同菌株的豆酱中挥发性风味物质含量分析(mg/kg干基)
表7接种不同菌株的豆酱中挥发性风味物质种类及含量(mg/kg干基)
对比例1
具体实施方式参见实施例2，不同点在于，在入缸时接种来自于同样的黄豆酱的另一株肉葡萄球菌m30，结果如表8。可见，肉葡萄球菌m30对于生物胺的降解能力比较差，对于尸胺、苯乙胺、组胺和酪胺都无法降解。
表8肉葡萄球菌m30对八种生物胺降解能力
注：nd表示未检测到
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。