本发明涉及微生物发酵技术领域，具体为vc二步发酵的营养优化方法。
背景技术：
目前，vc工业化生产多采用我国自主研发的“二步发酵法”生产工艺。这一技术的关键步骤在于其第二步发酵过程：即普通生酮基古龙酸杆菌(俗称小菌，ketogulonogeniumvulgare)和伴生菌(俗称大菌，包括巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、内生芽孢杆菌(bacillusendophyticus)中的一种)组成的两菌混合发酵将l-山梨糖转化为2-酮基-l-古龙酸。
混菌生长受营养和环境的影响较大，培养基的碳源、氮源、生长因子以及环境因子均可影响菌系生长代谢的进行。现有vc工业化生产过程中培养基营养成分未得到很好优化致混菌生长不稳定，影响发酵效率。业界对此进行了广泛的研究，有向培养基内补加适量氨基酸可优化二步发酵过程中大小菌比例和活力，提高二步发酵的糖酸转化速率。也有报道硒土元素、b族维生素均可显著促进二步发酵效率，但因其添加物价格昂贵且缺少机理方面的阐述，迄今未获得生产企业的认可。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种优化的vc二步发酵液体培养基，以提高2-酮基-l-古龙酸的发酵生产效率。
为实现上目的，本发明采用技术方案为：
一种vc二步发酵的营养优化方法，在vc二步发酵液体培养基中加入非植物性氮源；其添加量为液体培养基总体积的0.2～0.5％(w/v)。
所述非植物性氮源为鱼粉、蛹粉、蛋白胨中的一种或几种。
在vc二步发酵液体培养基中加入非植物性氮源，调节发酵中期大小菌比例，提高生物合成2-酮基-l-古龙酸的速率；其中，发酵中期大小菌比例的个数比为大菌数：小菌数＝1:60～80。
所述大小菌为生酮基古龙酸杆菌(ketogulonogeniumvulgare)和伴生菌；其中，伴生菌为巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)或内生芽孢杆菌(bacillusendophyticus)。
所述优化的液体培养基为(w/v)：山梨糖初始含量2～3％，玉米浆0.8～1.1％，非植物性氮源0.2～0.5％，尿素0.1～0.2％，mgso4·7h2o0.02～0.04％，kh2po40.05～0.10％，其余成分为自来水；发酵液ph为6.7～7.0，发酵过程中流加山梨糖溶液(25％，w/v)至发酵液中累计山梨糖浓度为9～11％(w/v)。
一种vc二步发酵的优化培养基，优化培养基为(w/v),山梨糖含量2～3％，玉米浆0.8～1.1％，非植物性氮源0.2～0.5％，尿素0.1～0.2％，mgso4·7h2o0.02～0.04％，kh2po40.05～0.10％，其余成分为自来水，ph6.7～7.0。
所述非植物性氮源为鱼粉、蛹粉、蛋白胨中的一种或几种。
本发明具有如下优点：
1.本发明通过补加相对廉价的非植物性氮源，调整大小菌的生理活性与比例，最大程度满足大、小菌生长过程中对不同来源氮源的需求，从而有效提高2-酮基-l-古龙酸的合成速率，提高二步发酵糖酸转化速率15～20％，缩短发酵周期10～20％。
2.本发明只是在原液体发酵培养基基础上添加少量氮源，不影响培养基配制、灭菌及整个发酵控制过程。无额外工序，易于操作。
3.本发明添加非植物性氮源，协调了大小菌的比例，使发酵过程更平稳，降低了发酵控制难度，生产更稳定、高效。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明在优化工艺过程中向培养基中添加非植物性氮源的营养成分，使其与现行培养基中的碳、氮源形成优势互补，进而使培养体系内富含b族维生素、矿物质和生长因子。本发明向培养基中适量补加非植物性氮源可有效提高大小菌生理活性，调节发酵中期发酵液中大小菌数量至适当比例，进而提高vc发酵效率。
实施例1：
对照组：将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌的混合菌液(其中普通生酮基古龙酸菌浓度为1.1×109cfu/ml,巨大芽孢杆菌浓度为3.2×107cfu/ml)1l，接入到3.5l含有3％(w/v)山梨糖的液体发酵培养基(玉米浆0.8％，尿素0.15％，mgso4·7h2o0.02％，kh2po40.05％，均为质量体积比)中，采用10l自动发酵罐进行发酵，搅拌转速200rpm，通气比1:1vvm，培养基初始ph为6.7，培养4h后用25％碳酸钠溶液控制发酵液ph至7.0，培养7h后流加浓度为25％(w/v)的山梨糖溶液，控制发酵最终总糖浓度9.5％(w/v)，温度29℃。发酵中期(发酵培养28h时)，测定巨大芽孢杆菌和普通生酮基古龙酸菌的数量分别为6.3×107cfu/ml和1.0×109cfu/ml，大小菌数量比为1：15。发酵液终点2-酮基-l-古龙酸含量93.17mg/ml，发酵周期为48h，产酸速率1.94mg/ml·h。
实验组：将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌的混合菌液(其中普通生酮基古龙酸菌浓度为1.1×109cfu/ml,巨大芽孢杆菌浓度为3.2×107cfu/ml)1l，接入到3.5l含有3％(w/v)山梨糖的液体发酵培养基(玉米浆0.8％，尿素0.15％，mgso4·7h2o0.02％，kh2po40.05％，均为质量体积比)中，另向液体发酵培养基中添加0.4％(w/v)的鱼粉。发酵容器采用10l自动发酵罐，搅拌转速200rpm，通气比1:1vvm，培养基初始ph为6.7，培养4h开始用25％碳酸钠溶液控制发酵液ph至7.0，培养7h开始流加浓度为25％(w/v)的山梨糖溶液，控制发酵最终总糖浓度9.5％(w/v)，温度29℃。发酵中期(发酵培养28h时)，测定巨大芽孢杆菌和普通生酮基古龙酸菌的数量分别为2.5×107cfu/ml和2.0×109cfu/ml，大小菌数量比为1：80。发酵液终点2-酮基-l-古龙酸含量95.20mg/ml，发酵周期42h，产酸速率2.27mg/ml·h，产酸速率较对照提高17.01％，周期缩短6h。
实施例2：
对照组：将培养好的普通生酮基古龙酸菌和内生芽孢杆菌的混合菌液(其中普通生酮基古龙酸菌浓度为1.8×109cfu/ml,内生芽孢杆菌浓度为5.9×107cfu/ml)1l，接入到3.5l含有3％(w/v)山梨糖的液体发酵培养基(玉米浆1.00％，尿素0.10％，mgso4·7h2o0.02％，kh2po40.05％，均为质量体积比)中，采用10l自动发酵罐进行发酵，搅拌转速300rpm，通气比1:1vvm，培养基初始ph为6.7，培养4h后用25％碳酸钠溶液控制发酵液ph至7.0，培养7h开始流加浓度为25％的山梨糖溶液，控制发酵最终总糖浓度10.2％(w/v)，温度29℃。发酵中期(发酵培养28h时)，测定内生芽孢杆菌和普通生酮基古龙酸菌的数量分别为8.0×107cfu/ml和1.4×109cfu/ml，大小菌数量比为1：17。发酵液终点2-酮基-l-古龙酸含量101.12mg/ml，发酵周期52h，产酸速率1.94mg/ml·h。
实验组：将培养好的普通生酮基古龙酸菌和内生芽孢杆菌的混合菌液(其中普通生酮基古龙酸菌浓度为1.8×109cfu/ml,内生芽孢杆菌浓度为5.9×107cfu/ml)1l，接入到3.5l含有2％(w/v)山梨糖的液体发酵培养基(玉米浆1.00％，尿素0.10％，mgso4·7h2o0.02％，kh2po40.05％，均为质量体积比)中，另添加0.2％(w/v)的蛋白胨。采用10l自动发酵罐进行发酵，搅拌转速300rpm，通气比1:1vvm，培养基初始ph为6.7，培养4h后用25％碳酸钠溶液控制发酵液ph至7.0，培养7h后流加浓度为25％的山梨糖溶液，控制发酵最终总糖浓度10.2％(w/v)，温度29℃。发酵中期(发酵培养28h时)，测定内生芽孢杆菌和普通生酮基古龙酸菌的数量分别为3.4×107cfu/ml和2.6×109cfu/ml，大小菌数量比为1：76。发酵液终点2-酮基-l-古龙酸含量102.77mg/ml，发酵周期44h，产酸速率2.34mg/ml·h，产酸速率较对照提高20.62％，周期缩短8h。
实施例3：
对照组：将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌的混合菌液(其中普通生酮基古龙酸菌浓度为1.6×109cfu/ml,巨大芽孢杆菌浓度为4.5×107cfu/ml)1.5l，接入到5.5l含有2％(w/v)山梨糖的液体发酵培养基(玉米浆1.10％，尿素0.20％，mgso4·7h2o0.04％，kh2po40.10％，均为质量体积比)中，采用20l自动发酵罐进行发酵，搅拌转速300rpm，通气比1:1vvm，培养基初始ph为6.7，培养4h开始用25％(w/v)碳酸钠溶液控制发酵液ph至7.0，培养7h开始流加浓度为25％(w/v)的山梨糖溶液，控制发酵最终总糖浓度10.5％(w/v)，温度29℃；。发酵中期(发酵培养28h时)，测定巨大芽孢杆菌和普通生酮基古龙酸菌的数量分别为1.1×108cfu/ml和1.5×109cfu/ml，大小菌数量比为1：13。发酵液终点2-酮基-l-古龙酸含量103.53mg/ml，发酵周期50h，产酸速率2.07mg/ml·h。
实验组：将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌的混合菌液(其中普通生酮基古龙酸菌浓度为1.6×109cfu/ml,巨大芽孢杆菌浓度为4.5×107cfu/ml)1.5l，接入到5.5l含有2％(w/v)山梨糖的发酵培养基(玉米浆1.10％，尿素0.20％，mgso4·7h2o0.04％，kh2po40.10％，均为质量体积比)中，另添加0.5％(w/v)的蛹粉。采用20l自动发酵罐进行发酵，搅拌转速300rpm，通气比1:1vvm，培养基初始ph为6.7，培养4h后用25％(w/v)碳酸钠溶液控制发酵液ph至7.0，培养7h后流加浓度为25％(w/v)的山梨糖溶液，控制发酵最终总糖浓度10.5％(w/v)，温度29℃。发酵中期(发酵培养28h时)，测定巨大芽孢杆菌和普通生酮基古龙酸菌的数量分别为4.7×107cfu/ml和3.2×109cfu/ml，大小菌数量比为1：68。发酵液终点2-酮基-l-古龙酸含量106.36mg/ml，发酵周期43h，产酸速率2.47mg/ml·h，产酸速率较对照提高19.32％，周期缩短7h。
实施例结果表明，本发明通过在vc二步发酵培养基中添加非植物性氮源，为二步发酵过程提供多样的氮源，满足大小菌生长和代谢对氮源的需求，从而大幅度提高哦二步发酵效率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些也应视为本发明的保护范围。