寡肽γ‑Glu‑γ‑Glu‑γ‑Glu‑Ile、浓厚味赋予剂、调味料及其制备方法与流程

本发明涉及具有呈味效果的肽，具体涉及具有厚味的γ-谷氨酰肽及其应用。

背景技术：

γ-谷氨酰肽广泛存与多种动植物和发酵食品中，是一种安全天然、安全的食品成分。常见的谷胱甘肽其一级结构是γ-glu-cys-gly，是一种典型的γ-谷氨酰肽。现代研究表明γ-谷氨酰肽与生物体的代谢活动和生理功能有关，此外大部分γ-谷氨酰肽具有镇定减压、舒缓疲劳、抗癌解毒、络合重金属离子、维持细胞金属离子平衡等生理功能。

近年来，人们发现γ-谷氨酰肽还具有较强的呈味特性。2002年日本味之素株式会社公开了通过探索具有casr激动剂活性的多种多样的化合物，发现具有更优异的浓味赋予作用，特别是具有前味型的浓味赋予作用，且具有优异的稳定性，可以简便而低成本地生产的能够赋予浓味的物质，提供包含该物质的浓味赋予剂，以及将该物质与其他具有casr激动剂活性的物质组合使用而成的复合浓味赋予剂。包含γ-glu-abu(l-γ-谷氨酰-l-2-氨基丁酸)的浓味赋予剂，以及该物质与其他具有casr激动剂活性的物质组合使用而成的复合浓味赋予剂(专利申请号201080024054.1)。

在低浓度条件下的大部分γ-谷氨酰肽具有轻微涩味，随着浓度的提高，γ-谷氨酰肽开始呈现基本味道。例如γ-glu-glu在浓度为10mmol/l时有鲜味，γ-glu-tyr的苦味阈值是其涩味阈值的两倍。在鲜味溶液中，γ-谷氨酰肽具有厚味，阈值也在明显下降。随着人们对呈味肽的进一步了解，学者发现γ-谷氨酰肽具有厚味物质的特征：1.在水溶液中基本没有味道或只有轻微的味道(涩味或酸味)；2.能够与体系中的其他呈味物质发生协同增效作用，添加到含有鲜味物质的溶液体系中，不会改变溶液的基本味觉强度，但是能协调各种味道，显著增加浓厚感(kokumi)；3.与纯水溶液相比，在鲜味溶液中阈值明显下降。

表1已报道γ-谷氨酰肽呈味特性和阈值一览表

迄今为止，尚未见γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile具有浓厚味的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种利用谷氨酰胺酶合成γ-谷氨酰肽的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

一种寡肽，其氨基酸序列为γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile。

本发明提供的浓厚味赋予剂，由所述寡肽和如下一种以上的肽组合而成：γ-glu-x-gly(x表示氨基酸或氨基酸衍生物)、γ-glu-val-y(y表示氨基酸或氨基酸衍生物)、γ-glu-abu、γ-glu-ala、γ-glu-gly、γ-glu-cys、γ-glu-met、γ-glu-thr、γ-glu-val、γ-glu-orn、asp-gly、cys-gly、cys-met、glu-cys、gly-cys、leu-asp、d-cys、γ-glu-met(o)、γ-glu-γ-glu-val、γ-glu-val-nh2、γ-glu-val-ol、γ-glu-ser、γ-glu-tau、γ-glu-cys(s-me)(o)、γ-glu-leu、γ-glu-ile、γ-glu-t-leu和γ-glu-cys(s-me)。

一种含有所述寡肽的调味料，其含有300mg/kg以上的γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile。

一种含有所述寡肽的调味料，含有1000mg/kg以上的γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile。

所述寡肽的制备方法，具体是：谷氨酰胺与游离异亮氨酸，摩尔比为1-2:1，溶于水中得溶液，调节反应ph为7.0-10.0，添加谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺转肽酶0.02-1％(w/w)，在25-50℃反应3-12小时，后用4mol/l盐酸回调ph至7～8之间，90℃灭酶10min，得到含γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile的反应液。采用xselecthsst35μm4.6x250mm分析柱，流动相a液为0.1％(v/v)甲酸-水溶液；流动相b液为0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液，柱温为40℃，流速为1ml/min，反应液的进样量10μl，采用高效液相色谱对反应液进行梯度洗脱，9.671min出的峰即为寡肽γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile。

进一步地，所述溶液中谷氨酰胺的浓度为400-1000mmol/l。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1)本发明首次公开了γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile具有厚味特性。

2)首次公开了利用谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺转肽酶催化制备γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile。

附图说明

图1为酶促反应后混合物的液相色谱图；

图2为γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile的二级质谱图。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明的具体是实施作进一步举例，但本发明的实施和保护不限于此。

实施例1

将解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)swjs22(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.8425，已经经在中国专利申请号201510222162.4的申请中提交了保藏证明)以1％的接种量接种于发酵培养基(发酵培养基的组成为：4％豆粕、2％麸皮、2％玉米粉)中，37～39℃发酵培养30h。将发酵液于4℃，10000r/min条件下高速离心10min，过滤得上清液，即谷氨酰胺酶粗酶液。

将400mm谷氨酰胺和600mm异亮氨酸于100g水中，分别调节溶液的ph值至9.5，加入1g粗酶液，在40℃分别反应12h后，用4mol/l盐酸回调ph至7.0后，90℃灭酶10min，得到含有γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile的反应液。

采用xselecthsst35μm4.6x250mm分析柱，流动相a液为0.1％(v/v)甲酸-水溶液；流动相b液为0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液，柱温为40℃，流速为1ml/min，反应液的进样量10μl，采用高效液相色谱对反应液进行梯度洗脱(条件：0min时90％的a液和10％的b液梯度5min内降低到85％的a液和15％的b液，下一个5min内降低到20％a液和80％的b液)。9.671min的峰即为寡肽γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile。收集9.671min的寡肽峰，进行感官评价和uplc-ms/ms分析。

uplc-ms/ms对反应产物进行定性分析：包括：anagilent1290seriesuplcsystem(agilenttechnologies)用于分离各γ-glu-peptides,带有anelec-trosprayionization(esi)的质谱系统(q-tofms/ms，brukerdaltonics)进行定性分析。色谱柱为：agilentzorbaxrrhdsb-c18(2.1x50mm,1.8μm)。进样量为5μl。液相条件为：溶液a为0.1％甲酸-水溶液，和溶液b为0.1％甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱程序为：0–10％b,0-5.0min；10-15％b,5.0-10.0min；然后100％b,10.0-12.0min。ms条件：ionization(离子化)：正离子模式；dryinggas(干燥气体)：350℃下10l/min；nebulizer(喷雾器压力)：25psig；fragmentor(毛细管电压)：30v。对收集物进行uplc-ms/ms分析，其检测结果如图2。由图2可知，其一级结构为γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile。

实施例2

将枯草芽胞杆菌atcc6633以1％的接种量接种于发酵培养基(发酵培养基的组成为：4％豆粕、2％麸皮、2％玉米粉)中，37～39℃发酵培养48h。将发酵液于4℃，10000r/min条件下高速离心10min，过滤得上清液，即γ-谷氨酰胺转肽酶粗酶液。

将600mm谷氨酰胺和400mm异亮氨酸溶于100g水中，分别调节溶液的ph值至8.0，加入1gγ-谷氨酰胺转肽酶粗酶液，在40℃分别反应6h后，用4mol/l盐酸回调ph至7.0后，90℃灭酶10min，得到富含γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile的反应液。采用xselecthsst35μm4.6x250mm分析柱，流动相a液为0.1％(v/v)甲酸-水溶液；流动相b液为0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液，柱温为40℃，流速为1ml/min，反应液的进样量10μl，采用高效液相色谱对反应液进行梯度洗脱，9.671min的寡肽峰即为寡肽γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile。

实施例3

添加0.04％(g/g)γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile酱油中，评价其呈味特性变化。其中，酱油为市售海天金标酱油。感官评价实验由30-41岁有感官评价经验的7位男性和9位女性组成。感官评价结果表明，添加0.04g％γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile的酱油，其厚味均具有明显提高。

实施例4

称取0.04g和0.08gγ-glu-γ-glu-γ-glu-ile，以及0.5g食盐和0.3g味精，溶解于100g水中，并和空白样(0.5g食盐溶于100g水中)进行感官评价。感官评价实验由30-41岁有感官评价经验的7位男性和9位女性组成，感官评价结果见表1。

由表1可见，γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile在食盐水中的阈值为0.08g/100g，添加味精可明显降低这两种γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile的刺激呈味阈值，为0.04g/100g。

表1

16位感官评价小组中有13人发现0.5％食盐和0.3％味精溶液中添加γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile的样品具有显著的厚味增强效果，3人认为厚味略有增强。

实施例5

将牛肉与9倍重量去离子水混合，100℃煮沸60min后，过滤去除不溶性物质和油脂，加入牛肉汤重量0.3％的食盐后，分别添加牛肉汤重量0.04％和0.05％的γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile，并交由感官评价小组对鸡汤的厚味进行评价，结果见表2。感官评价实验由30-41岁有感官评价经验的11位男性和9位女性组成，

表2

由表2可见，牛肉汤中添加0.04-0.05％的γ-glu-γ-glu-γ-glu-ile，超过90％以上的感官评价小组认为厚味有显著或略有增加。