构建侧翼已知序列的测序文库的引物组和方法与流程

1.本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及构建侧翼已知序列的测序文库的引物和方法。


背景技术：

2.已知侧翼序列获取未知序列的方法通常采用pcr扩增，通过侧翼序列扩增未知序列然后进行测序。如采用16s进行物种鉴定或进行菌种鉴定，都是在基因两端的保守区域设计通用引物，扩增中间的未知可变区域，然后扩增子进行测序，从而对物种进行鉴别。但是，该方法受限于未知可变的长度，当长度大于1kb时，不能对产物进行有效的测序。对于这种情况，现在常用的方法是通过长片段扩增后进行鸟枪法打断进行高通量测序，构建二代测序文库的策略通常是将扩增的长片段打断、tn5转座或者通过多重pcr获得长度合适的小片段。
3.将长片段打断后建库是常用的建库方法，实验流程包括目的片段的扩增、扩增产物的纯化、纯化产物的片段化、末端修复、3端加a和连接接头，整个建库流程比较繁琐且成本相对比较高。tn5转座法，如illumina公司的nextera技术，是通过包埋有通用序列的tn5转座复合物将扩增产物片段化并加上通用序列，在通过通用引物扩增加上测序接头，该方法成本也相对比较高。
4.因此，目前针对侧翼已知序列构建测序文库的方法仍有待研究。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
6.为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种引物组。根据本发明的实施例，所述引物组包括：第一组引物和第二组引物，所述第一组引物包括第一引物和第二引物，沿5’端到3’端方向，所述第一引物包括第一特异性序列、第一间隔固定序列以及第一随机序列，所述第二引物包括第二特异性序列、第二间隔固定序列以及第二随机序列，所述第一特异性序列与双链dna中第1链上5’端已知序列匹配，所述第二特异性序列与所述双链dna中第2链上5’端已知序列匹配，所述第一间隔固定序列与所述双链dna中第1链不匹配，所述第二间隔固定序列与所述双链dna中第2链不匹配；所述第二组引物包括第三引物和第四引物，所述第三引物的3’端为所述第一间隔固定序列，所述第四引物的3’端为所述第二间隔固定序列。
7.根据本发明实施例的引物组包括两组引物组，第一组引物组中的两种引物均包含三段序列，包括特异性序列、间隔固定序列和随机序列。具体地，第一特异性序列和第二特异性序列能够分别锚定到侧翼已知序列5’端的已知序列上，基于dna链在三维空间上的可折叠性，第一随机序列与第二随机序列分别与侧翼已知序列种的未知序列的任意位置碱基互补配对并延伸，得到不均等片段大小的产物。然后，采用第二组引物，其中包含两种引物，每种引物的3’端为间隔固定序列，由此，可以通过扩增产物中的间隔固定序列的反向链进
行锚定互补，从而得到高通量测序文库。由此，利用根据本发明实施例的引物组可以获得具有不同长度的测序文库，尤其适用于侧翼已知序列，获得的文库可直接用于二代测序，操作简便快速，成本低廉，适于规模化应用。
8.根据本发明的实施例，上述引物组还可以具有下列附加技术特征：
9.根据本发明的实施例，所述第一间隔固定序列和第二间隔固定序列为接头序列。该接头序列为测序平台所固有的接头序列，由此，以便在扩增过程中连接上测序接头，便于实现后续测序。
10.根据本发明的实施例，所述第三引物和第四引物的5’端包括文库标签序列和文库标签测序引物结合序列。由此，以便于后续识别和测序。
11.根据本发明的实施例，所述已知序列的长度为18～30nt，所述第一间隔固定序列和第二间隔固定序列的长度分别为18～30nt，所述第一随机序列和第二随机序列的长度分别为6～15nt。设置上述侧翼序列和间隔固定序列的长度以保证引物的特异性，另外间隔固定序列可以使3’端随机序列在空间上具有延展性，结合模板的位置不固定，从而可以获得具有不同长度的目标片段。随机序列的长度一般设置在6～15nt，可以保证一定的退火温度。
12.在本发明的另一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒中含有容器以及位于所述容器中的前面所述的引物组。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒可以获得具有不同长度的测序文库，尤其适用于侧翼已知序列，获得的文库可直接用于二代测序，操作简便快速，成本低廉，适于规模化应用。
13.在本发明的又一方面，本发明提出了一种构建侧翼已知序列的测序文库的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用第一组引物对侧翼已知序列进行第一轮pcr扩增，以便得到第一扩增产物；利用第二组引物对所述第一扩增产物进行第二轮pcr扩增，以便得到侧翼已知序列测序文库，其中，所述第一组引物与第二组引物是如前面所述引物组中所限定的。
14.本发明通过二轮pcr扩增构建文库，第一轮主要是特异性扩增，第二轮主要是通用扩增。具体地，参见图1，第一轮采用的第一引物组中的第一特异性序列和第二特异性序列可以锚定侧翼已知序列的两条dna链的5’端的已知序列，基于dna链在三维空间上的可折叠性，第一引物和第二引物3’端的第一随机序列与第二随机序列能够分别与目标侧翼已知序列两条dna链中的未知序列区域内的碱基互补配对并延伸得到大小不一的产物，对该产物进行片段筛选，选择需要大小的目标产物。采用第二组引物用于第二轮pcr扩增，第二轮引物中的两种引物的3’端与第一/第二间隔固定序列一致，通过第一轮产物中的间隔固定序列的反向链进行锚定互补，通过扩增以便连接上接头序列、文库标签序列和文库标签测序引物结合序列，最终得到高通量测序文库。由此，利用根据本发明实施例的方法可以对侧翼已知序列进行测序建库以获得具有不同长度的文库，获得的文库可直接用于二代测序，操作简便快速，成本低廉，适于规模化应用。
15.在本发明的又一方面，本发明提出了一种测序文库。根据本发明的实施例，所述测序文库是利用前面所述的构建侧翼已知序列的测序文库的方法制备的。由此，根据本发明实施例的测序文库具有不同长度，可直接用于二代测序。
16.在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述测序文库的用途。根据本发明的实
施例，所述测序文库用作高通量测序平台的文库。如前所述，根据本发明实施例的测序文库具有不同长度，可直接用于高通量测序。
17.根据本发明的实施例，所述高通量测序平台选自mgi测序平台、illumina测序平台或proton测序平台。由此，以便进一步提高测序结果的准确性。
18.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
19.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
20.图1显示了根据本发明一个实施例的构建侧翼已知序列文库的方法流程示意图；
21.图2显示了根据本发明一个实施例的agilent 2100检测产物片段分布结果分析示意图；
22.图3显示了根据本发明另一个实施例的agilent 2100检测产物片段分布结果分析示意图。
具体实施方式
23.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
24.实施例1植物物种its2序列鉴定
25.引物设计：its 2是鉴别植物常用的dna barcoding序列，具有种水平上的差异，its 2两侧翼分别是5.8s rrna和28s rrna保守区域，针对保守区域，按照本发明方法设计第一轮引物扩增its 2片段；第二轮引物序列与第1轮引物的间隔序列相同，并在通用引物的反向引物序列5端加上文库标签序列和文库标签测序引物结合序列，如表6所示。
26.实验流程：用上述引物对青蒿、人参、西洋参、三七等植物的全基因组dna进行文库制备，每个重复3次，文库制备完成后进行高通量测序，得到的测序数据进行组装和比对，对物种进行鉴定。具体步骤如下：
27.1、样本准备
28.采集人参、西洋参、三七的中药饮片和青蒿原植物叶片，各取40mg样本用qiagen公司tissuelyser ii仪器(cat no./id:85300)对药用植物样本进行粉碎处理，再采用美基植物样品dna快速提取试剂(cat no./id:md5118)提取各植物样本的全基因组dna。
29.2、第一轮pcr，采用kapa 2g multiplex pcr kit，货号cat no./id：kk5802，进行pcr。
30.表1在200μlpcr管中配置的试剂
31.全基因组dna5μl2x pcr反应酶25μl10μm第一轮引物5μl
分子级水15μl共50μl
32.表2第一轮pcr扩增程序
[0033][0034][0035]
对得到的pcr产物进行片段筛选，向pcr产物中加入50μl te buffer，再加60μl的xp beads(beckman公司agencourt ampure xp磁珠，货号a63881)，充分混匀，静置5分钟，将上清液转移至新的干净的1.5ml离心管中，加入30μl的xp beads进行纯化，得到的产物溶解于20μl te中。
[0036]
第二轮pcr，采用kapa 2g multiplex pcr kit，货号cat no./id：kk5802，进行pcr。
[0037]
表3在200μl pcr管中配置的试剂
[0038]
上一步反应物20μl2x pcr反应酶25μl通用引物12.5μl通用引物22.5μl共50μl
[0039]
表4第二轮pcr扩增程序
[0040][0041]
将得到的pcr产物加入75μl的xp beads(beckman公司agencourt ampure xp磁珠，货号a63881)，进行纯化，得到的产物溶解于20μl te中。采用agilent2100对产物的大小进行检测，采用qubit 2.0对浓度进行文库质检。结果如图2所示。
[0042]
3、上机测序
[0043]
将得到的所有产物进行标准化，进行等量混合，混合得到的文库进行平行测序，测序平台mgiseq-2000，测序类型pe100。
[0044]
4、数据分析
[0045]
分析步骤包括过滤接头引物序列、组装、比对等基本的步骤。
[0046]
结果：该方法能够制备长短不一的扩增子文库，该文库可以直接上机测序，该构建的文库进行数据分析后鉴定物种正确率100％，组装序列与目标物种相似度100％，目标区域reads占比在95％以上，特异性好。
[0047]
表5测序数据分析
[0048][0049]
表6引物设计
[0050][0051]
结论：该方法可以通过两组引物扩增较长目标区域得到不同大小的dna片段用于高通量测序，不同大小dna片段覆盖整个目标区域，可以反应该目标的整个序列情况。
[0052]
实施例2通过16s rdna基因序列进行微生物菌种鉴定
[0053]
引物设计：针对16s rdna的两端的保守区域，按照本发明方法设计第一轮引物扩增16s rdna全长区域。第二轮引物序列与第1轮引物的间隔序列相同，并在通用引物的反向引物序列5端加上文库标签序列和测序引物结合序列。如表12所示。
[0054]
实验流程：用上述引物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等的16s rdna进行文库制备，重复4次，文库制备完成后进行高通量测序，得到的测序数据进行组装和比对，对菌种进行鉴定。具体步骤如下：
[0055]
1、第一轮pcr，采用kapa 2g multiplex pcr kit，货号cat no./id：kk5802，进行pcr。
[0056]
表7在200μl pcr管中配置的试剂
[0057]
全基因组dna5μl2x pcr反应酶25μl10μm第一轮引物5μl分子级水15μl共50μl
[0058]
按照以下程序进行第一轮pcr。
[0059]
表8第一轮pcr扩增程序
[0060][0061]
对得到的pcr产物进行片段筛选，向pcr产物中加入50μl te buffer，再加60μl的xp beads(beckman公司agencourt ampure xp磁珠，货号a63881)，充分混匀，静置5分钟，将上清液转移至新的干净的1.5ml离心管中，加入30μl的xp beads进行纯化，得到的产物溶解
于20μl te中。
[0062]
第二轮pcr，采用kapa 2g multiplex pcr kit，货号cat no./id：kk5802，进行pcr。
[0063]
表9在200μl pcr管中配置的试剂
[0064][0065][0066]
按照以下程序进行第二轮pcr。
[0067]
表10第二轮pcr扩增程序
[0068][0069]
将得到的pcr产物中加入75μl的xp beads进行纯化(beckman公司agencourt ampure xp磁珠，货号a63881)，得到的产物溶解于20μl te中。采用agilent2100对产物的大小进行检测，采用qubit 2.0对浓度进行文库质检。结果如图3所示。
[0070]
2、上机测序
[0071]
将得到的所有产物进行标准化，进行等量混合，混合得到的文库进行平行测序，测序平台mgiseq-2000，测序类型pe100。
[0072]
3、数据分析
[0073]
分析步骤包括过滤接头引物序列、组装、比对等基本的步骤。
[0074]
结果：该方法能够制备长短不一的扩增子文库，该文库可以直接上机测序，该构建的文库进行数据分析后鉴定物种正确率100％，组装序列与目标物种相似度100％，目标物种区域reads占比在95％以上，特异性好。
[0075]
表11测序数据分析
[0076][0077][0078]
表12引物设计
[0079][0080]
结论：该方法可以通过一对引物扩增较长目标区域得到不同大小的dna片段用于高通量测序，不同大小dna片段覆盖整个目标区域，可以反应该目标的整个序列情况
[0081]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0082]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。