1.本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种通用基因检测方法。
背景技术：
2.基因是遗传的基本单元，是携带有遗传信息的dna或rna序列，通过复制，把遗传信息传递给下一代，指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表达。基因检测是通过血液、其他体液、或细胞对dna进行检测的技术，是取被检测者外周静脉血或其他组织细胞，通过特定设备对被检测者细胞中的dna分子信息作检测，分析其所含有的基因类型和基因缺陷及其表达功能是否正常的一种方法，从而使人们能了解自己的基因信息，明确病因或预知身体患某种疾病的风险。基因检测常用的技术包括qpcr技术和基因芯片技术。其中qpcr技术包括：sybrgreen染料法和taqman探针法。基因芯片技术的一般策略是将捕获探针（capture probe）固定在固相载体（芯片）表面，然后将待检测的核酸加入到芯片上，通过变性和退火使要检测的靶基因与捕获探针进行特异性杂交，使捕获探针特异性的捕获到靶基因。然后在体系中加入检测探针（detection probe），检测探针与靶基因进行杂交。一般检测探针是一端被标记了的寡核苷酸序列，标记的方式可以有很多种，可以用酶标记，可以用金标记然后硝酸银染色，也可以用荧光素标记。由于基因芯片技术本身的灵敏度比较低，在大多数情况下需要首先对样品中的靶基因进行扩增，扩增的手段可以选择pcr，nasba，lamp等核酸扩增技术。扩增完成之后再进行基因芯片的杂交检测。
3.pcr的过程中会产生大量的靶基因扩增产物。这些产物没有被固定在固相载体上，很容易形成气溶胶。对整个检测的操作环境构成污染。所以进行临床样品的pcr检测必须在标准的pcr检测实验室中方可进行。标准的pcr检测实验室建设有强制性的要求，投资成本大，不适合基层医疗单位。并且这两种方法的具体实施过程比较复杂，需要较多的实验步骤和专业的技术人员进行操作，整个检测的耗时也比较长，不利于设计成poct的检测方式。
4.此外，qpcr技术和基因芯片技术的信号显示策略都是间接的，对于pcr技术及来说，信号显示的方式有两种，一种是sybrgreen染料，这是一种与dna双链的小沟结合的荧光染料，pcr扩增过程中形成的双链会结合sybrgreen染料，从而发出荧光用于检测。对于基因芯片检测技术来说，信号的采集一般是通过检测探针上的标记来进行，就像上文提到的，对检测探针上标记的金颗粒进行银染，或者加入标记在检测探针上的酶的底物进行显色反应，或者检测连接在检测探针上的荧光素。所有这些检测手段在实际操作过程中都会导致检测步骤的繁琐，同时可能会导致灵敏度降低，或者出现假阳性以及假阴性的现象，不会准确的反应目的基因或扩增产物的真实情况。
技术实现要素：
5.针对现有技术存在的问题，本发明提供一种通用基因检测方法和基因检测试剂盒，以及所述基因检测试剂盒在耳聋基因1555位点检测中的应用。
6.为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种通用基因检测方法，所述方法包括以下步骤：配制pcr反应体系，执行pcr反应程序，pcr反应结束后，处理反应产物，检测荧光信号，结果判定；其中，所述pcr反应体系包括固定引物、dntp，pcr缓冲液、extaq酶、dna样本和去离子水；所述固定引物包含固定相和固定在所述固定相上的引物，所述dntp经过荧光素标记。
7.本发明固定在固相相上的引物是序列特异性的arms引物，在合适的pcr反应条件下，只有特异性的靶基因能够得到扩增，其他基因型的序列都不能得到扩增，由于引物固定在固定相上，反应体系中的dntp是经过荧光素标记的，扩增产物就会固定在固定相上，并且是含有荧光素的。这样进行数轮pcr反应之后，吸去反应体系，经过漂洗后直接检测固定相上是否有荧光即可进行阴阳性的判定。
8.优选地，所述引物由通用核苷酸序列和特异性核苷酸序列杂合而成。
9.优选地，所述引物的5’端添加有标签序列。
10.优选地，所述引物的5’端进经过胺基修饰。
11.优选地，所述固定相选自磁性颗粒或基因芯片。
12.优选地，所述固定相表面标记有羧基或醛基。所述引物通过酰胺缩合反应固定在所述固定相上。
13.优选地，所述dntp包括datp、dctp、dgtp、dutp和dttp；其中，datp、dctp、dgtp、dutp和dttp中的一种或多种经过荧光素标记。
14.优选地，按照体积份数，所述pcr反应体系包括：固定引物5份、pcr缓冲液2份、datp 0.5份、dctp 0.5份、dgtp 0.5份和dttp 0.5份、extaq酶0.5份、浓度为50ng/ul 的dna样本1份和去离子水9.5份。
15.相对于现有技术，本发明的有益效果在于：本发明采用的引物固定在固定相上，因此，扩增过程中产生的扩增产物也全部固定在固定相上，不会对检测环境造成污染，不会出现气溶胶，对检测环境的要求大大降低了，本发明提供的通用基因检测方法不需要在标准的pcr检测实验室中就可以进行，节省了标准的pcr检测实验室的建设成本，适合在基层医疗单位进行推广，并且本发明的具体实施过程比较简单，有利于设计成poct的检测方式。
16.本发明所述的dntp经过荧光素标记，在固定引物的pcr单链扩增过程中，延伸的序列中都会掺入带有荧光素标记的dntp，这一过程使单链扩增产物的信号被极大的增强。这样整个反应过程所需要的循环数就会很少，一般进行1-5个循环就能产生十分强烈的信号，这就大大减少了检测反应所需要的时间。本发明提供的通用基因检测方法或基因检测试剂盒在操作时不需要再另外加入捕获探针，也不需要对捕获探针上标记的金颗粒进行银染，或对加入标记在捕获探针上的酶的底物进行显色反应，或者检测连接在捕获探针上的荧光素，省略的这些检测手段在实际操作过程中会大大简化检测步骤，同时能提高灵敏度，避免出现假阳性以及假阴性的现象，能够准确的反应靶基因或扩增产物的真实情况。
具体实施例
17.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
18.试剂耗材：
pcr缓冲液，采购自康为世纪生物科技有限公司，产品编号为：cw0680m。
19.extaq酶，采购自康为世纪生物科技有限公司，产品编号为：cw0680m。
20.羧基磁性颗粒，采购自普瑞迈格生物科技有限公司，产品编号为：pb0001。
21.datp，采购自北京索莱宝科技有限公司，产品编号为：pc2301。
22.dctp，采购自北京索莱宝科技有限公司，产品编号为：pc2303。
23.dgtp，采购自北京索莱宝科技有限公司，产品编号为：pc2304。
24.dttp，采购自北京索莱宝科技有限公司，产品编号为：pc2302。
25.偶联缓冲液，采购自普瑞迈格生物科技有限公司，产品编号为：pb0001。
26.淬灭缓冲液，采购自普瑞迈格生物科技有限公司，产品编号为：pb0001。
27.储存缓冲液，采购自普瑞迈格生物科技有限公司，产品编号为：pb0001。
28.本实施例提供一种通用基因检测方法，所述方法包括以下步骤：配制pcr反应体系，执行pcr反应程序，pcr反应结束后，处理反应产物，检测荧光信号，结果判定；其中，所述pcr反应体系包括固定引物、dntp，pcr缓冲液、extaq酶、dna样本和去离子水；所述固定引物包含固定相和固定在所述固定相上的引物，所述dntp经过荧光素标记。
29.本实施例固定在固相相上的引物是序列特异性的arms引物，在合适的pcr反应条件下，只有特异性的靶基因能够得到扩增，其他基因型的序列都不能得到扩增，由于引物固定在固定相上，反应体系中的dntp是经过荧光素标记的，扩增产物就会固定在固定相上，并且是含有荧光素的。这样进行数轮pcr反应之后，吸去反应体系，经过漂洗后直接检测固定相上是否有荧光即可进行阴阳性的判定。
30.本实施例提供一种通用基因检测方法，所述方法包括以下步骤：配制pcr反应体系，执行pcr反应程序，pcr反应结束后，处理反应产物，检测荧光信号，结果判定；其中，所述pcr反应体系包括固定引物、dntp，pcr缓冲液、extaq酶、dna样本和去离子水；所述固定引物包含固定相和固定在所述固定相上的引物，所述dntp经过荧光素标记。
31.在一些实施例中，所述引物的5’端添加有标签序列，所述引物的5’端进经过胺基修饰，所述固定相选自磁性颗粒。
32.在一些实施例中，所述固定相选自基因芯片。
33.在一些实施例中，所述磁性颗粒表面标记有羧基或醛基，所述引物通过酰胺缩合反应固定在所述固磁性颗粒表面。
34.优选地，所述固定引物的制备方法包括以下步骤：（1）取羧基磁性颗粒0.5mg，用pbs缓冲液洗涤2次，加入1mlpbs缓冲液振荡重悬后，加入10mg edc和10mg nhs活化羧基，30min后，磁吸附，去上清，使用pbs缓冲液洗涤3次，获得活化羧基磁性颗粒；（2）向所述活化羧基磁性颗粒中加入偶联缓冲液80ul，浓度为50nmol/ml的arms引物pna缓冲溶液20ul，引物100ul，在室温下震荡孵育2小时，获得产物；（3）向所述产物中加入500ul淬灭缓冲液，涡旋20秒，磁分离，弃上清；（4）重复步骤（3）三次；（5）加入100ul储存缓冲液，获得固定引物，4℃保存备用。
35.在一些实施例中，所述dntp包括datp、dctp、dgtp、dutp和dttp；其中，datp、dctp、dgtp、dutp和dttp中的一种或多种经过荧光素标记。
36.在一些实施例中，所述荧光素选自异硫氰酸荧光素荧光素、藻红蛋白、多甲藻黄素叶绿素蛋白、碘化丙啶或别藻青蛋白中的一种或多种。
37.在一些实施例中，所述荧光素选自异硫氰酸荧光素。
38.在一些实施例中，按照体积份数，所述pcr反应体系包括：固定引物5份、pcr缓冲液2份、datp 0.5份、dctp 0.5份、dgtp 0.5份和dttp 0.5份、extaq酶0.5份、浓度为50ng/ul 的dna样本1份和去离子水9.5份。
39.在一些实施例中，所述pcr反应程序包含以下步骤：取两个pcr反应管，分别将所述pcr反应体系加入所述pcr反应管，在pcr仪上于95℃预加热3分钟，使dna样本充分变性，然后进入扩增循环，在每一个循环中，先于95℃保持15s，使dna样本变性，然后将温度降到56℃，保持30s，使引物与dna样本充分退火；在72℃保持30s，完成5个循环后，在72℃在保持60s，获得反应产物。
40.在一些实施例中，所述处理反应产物的过程包括：1）将反应产物置于磁力架上吸附3min，收集磁性颗粒，弃去上清液；2）加入500ul去离子水，轻轻震荡，漂洗磁性颗粒，然后置于磁力架上吸附3min，收集磁性颗粒，弃去上清液，重复本步骤三次，将磁性颗粒悬浮在20ul去离子水中。
41.关于磁力架的具体结构，参见：李兴旺等“具有吸液功能的磁力架”，cn206232701u；魏宏泉等“磁力架”， cn206244805u；武彦峰等“磁力架”， cn206345848u；孙相鑫等“生物分子提取装置”， cn206477001u。这些出版物各自的全部内容以引用的方式并入本文。
42.在一些实施例中，所述荧光素选自fitc荧光素。
43.本实施例还提供一种基因检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包含固定引物、pcr缓冲液、dntp、extaq酶和去离子水。
44.在一些实施例中，所述固定引物包含固定相和固定在所述固定相上的引物，所述dntp经过荧光素标记。
45.在一些实施例中，所述荧光素选自异硫氰酸荧光素荧光素、藻红蛋白、多甲藻黄素叶绿素蛋白、碘化丙啶或别藻青蛋白中的一种或多种。
46.在一些实施例中，所述荧光素选自异硫氰酸荧光素。
47.在一些实施例中，所述引物的核苷酸序列为：5
’-
gccgaccgccgattctgc gcatttatatagaggaga-3’或5
’-
gccgaccgccgattctgcgcatttatatagaggagg-3’。
48.在一些实施例中，所述引物的5’端添加有标签序列。
49.在一些实施例中，所述引物的5’端进经过胺基修饰。
50.本实施例中，所述引物的5’端添加有标签序列，所述引物的5’端进经过胺基修饰，所述固定相选自磁性颗粒。
51.在一些实施例中，所述固定相选自基因芯片。
52.本实施例中，所述固定相表面标记有羧基或醛基。
53.本实施例中，所述引物通过酰胺缩合反应固定在所述磁性颗粒上。
54.优选地，所述固定引物的制备方法包括以下步骤：（1）取羧基磁性颗粒0.5mg，用pbs缓冲液洗涤2次，加入1mlpbs缓冲液振荡重悬后，加入
10mg edc和10mg nhs活化羧基，30min后，磁吸附，去上清，使用pbs缓冲液洗涤3次，获得活化羧基磁性颗粒；（2）向所述活化羧基磁性颗粒中加入偶联缓冲液80ul，浓度为50nmol/ml的pna缓冲液20ul，引物100ul，在室温下震荡孵育2小时，获得产物；（3）向所述产物中加入500ul淬灭缓冲液，涡旋20秒，磁分离，弃上清；（4）重复步骤（3）三次；（5）加入100ul储存缓冲液，获得固定引物，4℃保存备用。
55.优选地，所述dntp包括datp、dctp、dgtp、dutp和dttp；其中，datp、dctp、dgtp、dutp和dttp中的一种或多种经过荧光素标记。
56.本发明固定在固相相上的引物是序列特异性的arms引物，在调整到合适的pcr反应条件下，只有特异性的靶基因能够得到扩增，其他基因型的序列都不能得到扩增，由于引物固定在固定相上，反应体系中的dntp是经过荧光素标记的，单链的扩增产物就会固定在固定相上，并且是含有荧光素的。这样进行数轮pcr反应之后，吸去反应体系，经过漂洗后直接检测固定相上是否有荧光即可进行阴阳性的判定。
57.实施例1本实施例以耳聋基因1555位点检测为例，对本发明所述的通用通用基因检测方法进行进一步详细说明。
58.本实施例提供一种耳聋基因1555位点检测方法，包括以下步骤：1）取固定引物5ul、pcr缓冲液2 ul、datp 0.5ul、dctp 0.5 ul、dgtp 0.5 ul和dttp 0.5 ul、extaq酶0.5 ul和去离子水9.5 ul，加入pcr反应管中，获得pcr反应体系；所述固定引物由羧基磁性颗粒与引物结合而成；2）取浓度为50ng/ul 的dna样本1 ul，加入所述pcr反应体系中，将所述pcr反应体系在pcr仪上于95℃预加热1-3分钟，执行单链pcr过程，使固定引物与dna样本特异性结合，退火，使引物沿dna 模板延伸，漂洗，去除dna 模板，获得反应产物；3）检测反应产物的荧光值，判定检测结果。
59.本实施例所述引物的序列为：1555-w：5
’-
gccgaccgccgattctgc gcatttatatagaggaga-3’或1555-m：5
’-
gccgaccgccgattctgc gcatttatatagaggagg-3’。
60.序列gccgaccgccgattctgc为通用核苷酸序列；序列gcatttatatagaggaga或gcatttatatagaggagg为特异性核苷酸序列，所述通用核苷酸序列不与所述dna样品特异性结合，所述特异性核苷酸序列与所述dna样品特异性结合，所述引物中加入通用核苷酸序列，可以使特异性核苷酸序列有充分的空间与dna样品结合。本实施例所述引物的5’端经过氨基修饰，修饰后的引物通过氨基可以结合在固相载体上。
61.本实施例所述固定引物的制备方法，包括以下步骤：（1）取羧基磁性颗粒0.5mg，用pbs缓冲液洗涤2次，加入1mlpbs缓冲液振荡重悬后，加入10mg edc和10mg nhs活化羧基，30min后，磁吸附，去上清，使用pbs缓冲液洗涤3次，获得活化羧基磁性颗粒；（2）向所述活化羧基磁性颗粒中加入偶联缓冲液80ul，浓度为50nmol/ml的的pna缓冲液20ul，引物100ul，在室温下震荡孵育2小时，获得产物；
（3）向所述产物中加入500ul淬灭缓冲液，涡旋20秒，磁分离，弃上清；（4）重复步骤（3）三次；（5）加入100ul储存缓冲液，获得固定引物，4℃保存备用。
62.本实施例处理反应产物的步骤包括：1）将所述反应产物置于磁力架上吸附3min，收集磁性颗粒，弃去上清液；2）加入500ul去离子水，轻轻震荡，漂洗磁性颗粒，然后置于磁力架上吸附3min，收集磁性颗粒，弃去上清液，重复本步骤三次，将磁性颗粒悬浮在20ul去离子水中。
63.尽管以上对本发明的实施方案进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施 方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领 域的普通技术人员在说明书的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还 可以做出多种形式的变化，这些均属于本发明保护之列。