一种用于检测黑色素瘤的长非编码RNA及其应用的制作方法

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种用于检测黑色素瘤的长非编码rna及其应用。

背景技术：

黑色素瘤是皮肤中恶性度最高的原发性皮肤肿瘤，其起源于黑色素瘤细胞，是所有皮肤肿瘤中最具有侵袭性的一种恶性肿瘤。黑色素瘤患者的预后效果较差，患者的生存期短。尽管相较于其他的皮肤癌症，如鳞状细胞癌和基底细胞癌，黑色素瘤较为少见，但是在皮肤恶性肿瘤所引起死亡的病例中，黑色素瘤所引起的死亡约占75％。由于黑色素瘤患者的早期症状不明显，因此患者被诊断时通常已经处于中晚期。因此，研究黑色素瘤的发生发展的具体机制对于提高患者的早期诊断以及提高患者的预后具有十分重要的价值。面前，对于黑色素瘤的研究多集中于传统的蛋白编码基因以及蛋白信号传导等方面，而对于非编码rna的研究则较少。

长非编码rna是一类长度大于200碱基的非编码rna。根据长非编码rna与蛋白编码基因的位置关系，长非编码rna被分为五类：正义长非编码rna，反义长非编码rna,双向长非编码rna，内含子长非编码rna，基因间长非编码rna。长非编码rna广泛存在于多种组织中，并且长非编码rna的表达具有特异性和时空特异性。长非编码rna具有多种重要的细胞调控功能，能够参与到细胞发育和代谢等多种生命功能调控途径中，包括基因重组、基因印记、细胞周期调控、染色质修饰、转录、翻译、mrna降解等。大量的研究表明，长非编码rna与疾病的发病机制有关。现有的研究表明，长非编码rna在多种肿瘤中出现显著差异，如肝癌、乳腺癌、结直肠癌等。因此，长非编码rna的不同表达水平可以作为肿瘤发生以及预后的生物标志物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种与黑色素瘤发生发展相关的lncrna-fa2h-2，通过检测lncrna-fa2h-2的表达水平以及改变其相关水平来实现黑色素瘤的早期诊断与靶向治疗。

为实现上述目的，本发明提供了一种检测长非编码rna表达的试剂在制备诊断黑色素瘤产品中的应用，所述长非编码rna为lncrna-fa2h-2。

优选地，所述lncrna-fa2h-2在黑色素瘤患者中表达上调。

优选地，所述试剂包括利用分子信标、sybrgreen、taqman探针、双杂交探针检测lncrna-fa2h-2所使用的特异性引物对或探针。

优选地，所述特异性引物对的序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

试剂中还含有：

(1)内参基因gapdh特异性引物，引物序列如seqidno.5-6和seqidno.7-8；

(2)从黑色素瘤组织和癌旁组织中提取总rna所需的试剂；

(3)以总rna为模板将lncrna-fa2h-2逆转录为cdna所需的试剂；

(4)将cdna实时定量pcr所用试剂。

此外，本发明提供了一种用于治疗黑色素瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物所述lncrna-fa2h-2的sirna。

优选地，所述sirna序列为seqidno.5-6和seqidno.7-8。

优选地，所述药物组合物还包括与所述sirna相配伍的其他药学上可接受的载体和/或辅料，所述药学上可接受的载体和/或包括但不限于粘合剂、稀释剂、表面活性剂、填充剂。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种诊断黑色素瘤的分子标志物lncrna-fa2h-2，lncrna-fa2h-2在黑色素瘤患者肿瘤中高表达，因此通过检测黑色素瘤患者中的lncrna-fa2h-2表达能够实现黑色素瘤的早期诊断从而提高黑色素瘤患者生存率。

其次，本发明提供一种lncrna-fa2h-2的sirna在制备黑色素瘤药物组合物中应用，具有重要的临床价值和应用前景。

附图说明

图1lncrna-fa2h-2在黑色素瘤癌组织和癌旁组织中的表达情况。

图2转染lncrna-fa2h-2的sirna对于黑色素瘤细胞a357细胞中lncrna-fa2h-2的表达影响情况。

图3敲减lncrna-fa2h-2对于黑色素瘤细胞a357细胞增殖的影响情况。

具体实施方式

实施例1

检测lncrna-fa2h-2在黑色素瘤癌组织和癌旁组织中的表达情况

1.研究对象

选取20例黑色素瘤癌组织以及相应的癌旁组织进行实验。

2.组织rna提取

(1)取约50mg组织放入到研钵中，加入少量的液氮，迅速的进行研磨，待组织变软后，再次加入少量液氮进行研磨，重复三次；

(2)加入1mltrizol，使用电动匀浆器匀浆2分钟，匀浆后转移至离心管中，室温放置5分钟；

(3)12000rpm离心5分钟，取上清，去除沉淀；

(4)加入200ul氯仿，震荡混匀后，室温放置15分钟；

(5)4℃12000rpm离心15min；

(6)取上清(需要注意不能吸到中间层)，转移至另一个离心管中，加入0.5ml预冷的异丙醇混匀，混匀后冰上静置8分钟；

(7)4℃12000rpm离心10分钟，去除上清，留沉淀；

(8)加入1ml75％乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀；

(9)4℃8000rpm离心5分钟，使用移液器小心的去除上清；

(10)室温静置10分钟干燥rna，之后使用50uldepc水溶解沉淀。

(11)使用nanodrop2000微量紫外分光光度计测定组织总rna的纯度和浓度。

3.逆转录反应得cdna

(1)去除基因组dna

反应试剂

反应条件

42℃2分钟

4℃

(2)逆转录反应

反应条件

37℃15分钟

85℃5秒

4℃。

4.荧光定量pcr检测

反应条件

采用δδct方法处理实时定量pcr数据，计算lncrna-fa2h-2的表达变化。

5.引物序列

lncrna-fa2h-2引物为

forward5’-ccccaatatgatgagctctgca-3’

reverse5’-ggtttggtagcccctgagg-3’

gapdh引物为

forward5’-caatgaccccttcattgacc-3’

reverse5’-gacaagcttcccgttctcag-3’

4.结果

荧光定量pcr的结果表明，lncrna-fa2h-2在癌旁组织中的表达水平为4.48±0.238，在黑色素瘤组织中的表达水平为12.33±0.178，和癌旁组织相比，lncrna-fa2h-2在黑色素瘤组织中的表达水平上调(图1)，且差异具有统计学意义(p<0.05)，说明lncrna-fa2h-2能够作为黑色素瘤的诊断指标。

实施例2

lncrna-fa2h-2基因的敲减

1.sirna设计

si-rna-1

5’-auucuucugacauguuuccug-3’

5’-ggaaacaugucagaagaaugc-3’

si-rna-2

5’-ucacauucaauauguacagcu-3’

5’-cuguacauauugaaugugaau-3’

si-nc

5'-acagagccucgccuuugccgau-3'

5'-cuugcacaugccggagccguu-3'

2.细胞培养

人黑色素瘤细胞株a357采用高糖dmem培养液培养(10％胎牛血清)，培养条件37℃，5％co2。

3.sirna转染

(1)转染前一天将2×10⁵的a357细胞接种到6孔培养板上，于37℃，5％co2培养箱中培养24小时后，按照lipofectamine2000说明书进行转染；

(2)实验分组为si-nc组，si-rna-1和si-rna-2。

4.荧光定量pcr检测敲减后的lncrna-fa2h-2基因表达情况

(1)细胞总rna提取

6孔板每孔中，加入500μltrizol，室温放置5分钟，充分裂解后，转移至离心管中；

其余步骤类似实施例1组织rna提取。

(2)逆转录反应同实施例1。

(3)荧光定量pcr检测同实施例1。

5.结果

通过图2可以看出，与对照组si-nc相比，si-rna-1组和si-rna-2组的lncrna-fa2h-2表达水平显著降低(p<0.05)，说明si-rna-1和si-rna-2能够抑制lncrna-fa2h-2的表达，因此si-rna-1和si-rna-2可以作为lncrna-fa2h-2的抑制剂来制备治疗黑色素瘤的药物组合物。

实施例3

1.细胞增殖实验

(1)按照5000个/ml的细胞密度将a357接种于96孔板中，每孔200μl，每组设置3个复孔，置于37℃，5％co2培养箱中静置培养；

(2)a357细胞分别转染si-nc，si-rna-1,si-rna-2，培养结束前4h，每孔加入5mg/ml的mtt溶液20μl，继续置于37℃，5％co2培养箱中静置培养至结束；

(3)吸弃孔中的培养液，每孔加入150μldmso，水平震荡10min，酶标仪492nm处检测吸光值，绘制生长曲线。

(4)应用spss19.0统计软件建立数据库并进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，两组均数的比较采用独立样本的t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

通过图3可以看出，与空白对照组相比，si-rna-1和si-rna-2组的a357细胞增殖受到抑制，说明lncrna-fa2h-2与黑色素瘤细胞的增殖有关，通过sirna敲减lncrna-fa2h-2可以有效的抑制黑色素瘤细胞的增殖。

序列表

<110>刘秀玲

<120>一种用于检测黑色素瘤的长非编码rna及其应用

<130>2019.12.31

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccccaatatgatgagctctgca22

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggtttggtagcccctgagg19

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

caatgaccccttcattgacc20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gacaagcttcccgttctcag20

<210>5

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

auucuucugacauguuuccug21

<210>6

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ggaaacaugucagaagaaugc21

<210>7

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ucacauucaauauguacagcu21

<210>8

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

cuguacauauugaaugugaau21

<210>9

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

acagagccucgccuuugccgau22

<210>10

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

cuugcacaugccggagccguu21