专利名称：红茂草醇提取物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药提取物的新用途，具体涉及红茂草醇提取物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用。
背景技术：
据世界卫生组织(WHO)统计，20世纪80年代全世界每年新患癌症的病人约700 万，每年死于癌症者约500万人。50年代初，我国癌症死亡占全部死因的第9位或第10位， 70年代我国癌症死亡已跃居第3位。1991年统计资料，我国一些大中城市居民的癌症死亡已占据全部死因的第1位。我国每年新患癌症约160万人、死于癌症者约130万人。上述资料表明全世界和我国的癌症发病率在逐年明显增加。此外，我国癌症病人就诊时晚期病人仍占多数，具有已失去了手术等根治机会、治疗效果较差的特点。广大医务工作者加强肿瘤治疗的研究，掌握和提高现有各种治疗手段的治疗效果，对降低癌症死亡率，减少复发率，提高癌症病人的生活质量具有重要意义。按现在我国癌症死亡的水平，全国每1分钟就有2个人死于癌症，每天将有2800多人被癌症夺走生命，1年将相当于一个有百万人口的城市被毁灭。可见，癌症是常见病、多发病，对人们生命和健康有者严重威胁，对国民经济建设的影响也是巨大的。在美国，每年癌症治疗费用830亿美元，占全国医疗费用的14%。几乎每个人都感受到癌症的威胁。因为全世界每年因癌症死亡的人数高达630万人，而我国每年因癌症死亡的人数已达130万人，并且癌症病人每年以3%的速度递增，相当于每200个家庭中就有1个家庭受到癌症的威胁。化疗是目前治疗癌症的一个重要手段，化疗药物在杀死癌细胞的同时，对机体正常细胞也存在毒性。近年来，随着抗癌新药的不断涌现，联合化疗方案的合理应用，化疗的疗效有了较大的提高，但这些药物同时对正常组织器官有损害或毒性作用，从而降低机体免疫功能，出现骨髓抑制等一系列毒副反应，影响化疗的疗效，甚至迫使化疗终止。临床研究表明，在化疗时根据患者的体质、癌症分期以及出现的毒副反应症状，辅以中药治疗，可有效地增强化疗的效果，又能在一定程度上避免或减轻放化疗的毒副反应，延长患者的生存期和提高患者的生存质量。而中药作为我国得天独厚的资源，有些药物具有明显的抗肿瘤作用，因此从我国传统的天然药物中筛选高效低毒、靶向性强的抗肿瘤药物具有十分重要的意义。王光凤等采用多种肿瘤模型，研究橘皮中提取的黄酮化合物川陈皮素的抗肿瘤作用。结果显示，川陈皮素8 32mg/kg小鼠黑色素瘤B16的抑瘤率为42. 24% 65. 95%， 对小鼠Lewis肺癌的抑瘤率为38. 84% 59. 09%;对小鼠S180肉瘤的抑瘤率为36. 02% 45. 98%。川陈皮素与小剂量的紫杉醇、丝裂霉素、52氟尿嘧啶、顺钼和阿霉素联用时，表现明显的协同效应。川陈皮素对小鼠Lewis肺癌腋皮下接种肺转移的抑制率为33. 63% 38. 94% ；对小鼠Colon26结肠癌腹腔接种腹膜转移的抑制率为37. 74% 43. 40%。(王光凤，王小晨，肖璘，等.柑橘黄酮川陈皮素的抗肿瘤作用研究，中草药，2007,38(11) 1694-1697)，但以上研究都只能对某种肿瘤细胞发挥作用，研究还不够深入。
红茂草主要化学成分为多种异喹啉类生物碱。全草含异紫堇碱、原阿片碱、紫堇碱、异紫堇啡碱、木兰碱、血根碱、别隐品碱、海罂粟碱。根含原阿片碱、白屈菜红碱、血根碱、别隐品碱、隐品碱，但没有报道过红茂草醇提取物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用。
发明内容
发明目的为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种红茂草醇提取物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用。技术方案本发明的目的是通过如下的方案实现的红茂草醇提物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用。上述红茂草醇提物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用，所述的红茂草醇提物按如下方法制备而成取红茂草药材，加入6-10倍药材重量的体积浓度为60% -75%乙醇进行加热回流，回流0. 2-0. 8小时，重复一次，合并乙醇提取液，浓缩至95°C时相对密度为 1. 20 1. 25的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。上述红茂草醇提物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用，所述的红茂草醇提物按如下方法制备而成取红茂草药材，加入8倍药材重量的体积浓度为70%乙醇进行加热回流，回流0. 5小时，重复一次，合并乙醇提取液，浓缩至95°C时相对密度为1. 20的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。红茂草为罂粟科秃疮花属植物秃疮花Dicranostigma leptopodum(Maxim.) Fedde,以全草入药。有益效果为了更好地理解本发明的实质，下面将红茂草醇提取物的药理试验及实验结果来说明其在制药领域中的新用途。以下是红茂草醇提取物抗肿瘤转移作用的研究，实验方法及结果如下一、红茂草醇提取物的制备取50克红茂草药材，加入8倍药材重量的体积浓度为70%乙醇进行加热回流，回流0. 5小时，重复一次，合并乙醇提取液，浓缩至95°C时相对密度为1. 20的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。二、红茂草醇提取物对自发性B16F10黑色素瘤转移模型的影响1.实验材料1.1实验动物与细胞清洁级C57BL/6小鼠(雌性，6_8周龄，16_20g)，上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK (沪)2007-0005 ；B16F10黑色素瘤细胞株。1. 2实验药物红茂草醇提取物按照上述方法制备而成。1. 3实验试剂DMEM (美国GIBCO公司批号1340114)，PBS (实验室自制)，小牛血清(天津市洋生物制品科技有限公司批号:QWTC0701), Trypsin(AMRESC0公司批号=2009/08) EDTA(AMRESC0公司批号0105)，甲醛(上海久亿化学试剂有限公司批号20070610)，生理盐水(上海华源长富药业有限公司批号070405045)，NaHC03(南京化学试剂有限公司批号050480039)，液体石蜡(上海久亿化学试剂有限公司批号20040701)。1. 4实验器材莱卡倒置荧光显微镜(德国莱卡公司型号DM1L)，精密移液器(法国吉尔森公司型号P2)，全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号MLS-3020)，超净工作台(苏净集团安泰公司制造型号SW-CJ-ZFD)，超低温冰箱(美国纽艾尔公司型号Nu-6511)，C02培养箱 (FORMA型号3111)，纯水仪(美国Spring公司型号S/N020579)，电子天平(德国赛多利斯有限公司型号BT323S)，台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号DHG9123A)， 冰箱(西门子公司型号KG18V21TI)，液氮罐(CBS型号2001)，离心机(上海安亭科学仪器厂型号=KA-IOOO)，PH计(HANNA公司型号HI_221)，注射器。2.实验方法2. 1制备B16F10细胞悬液常规培养B16F10肿瘤细胞，实验前4-5天，按1 10细胞传代于细胞培养瓶中， 以免细胞生长过度而出现不完全融合。每个培养瓶大约含6-8 X 106细胞，取对数生长期的细胞，弃去培养液，用PBS洗净，加入ImL 0. 25%胰酶+0. 02% EDTA消化液，放入细胞培养箱中，l-3min后，轻敲培养瓶使细胞脱落。加IOmL DMEM，用移液管吹打细胞，获得单细胞悬液，转入50mL聚丙烯离心管。离心细胞(1200rpmX10min)，然后用PBS洗两遍。用苔盼蓝计数细胞，调整细胞浓度为lX107/mL。2. 3复制B16F10自发性肿瘤转移模型每只C57BL/6小鼠左后肢足垫皮下注射含5 X IO5个B16F10细胞的悬液0. 05mL, 这些小鼠每五天称一次体重。于接种后第八天按照左足垫上原发瘤的大小将小鼠随机分为四组模型组对照组(生理盐水组)、红茂草醇提取物低剂量组(2g/kg小鼠体重)、红茂草醇提取物中剂量组(4mg/kg小鼠体重)、红茂草醇提取物高剂量组(6g/kg小鼠体重)，每组动物数为10只。从接种的第九天开始各组灌胃给予相应剂量的药物，模型组给予相应的生理盐水，每日一次，直至处死动物，采集标本。在接种后第23天，麻醉小鼠，截除荷瘤下肢，10% PBS-福尔马林固定原发瘤组织，称取原发肿瘤重量以及用直尺测量原发瘤的长轴 (Li)和纵轴(L2)，按照以下公式计算原发瘤的体积0. 5236XL1X (L2)2。切除原发灶后22 天处死小鼠，取出肺，避免镊子触及脏器表面损伤组织，用PBS洗净组织。10% PBS-福尔马林固定肺组织，称取肺重，拍照并且在解剖显微镜下计算肺肿瘤结节数。3.实验结果3. 1红茂草醇提取物对B16F10黑色素瘤自发性转移模型肺转移的影响实验结果采用Excel统计软件学生t检验进行检验，由实验数据可以看出，红茂草醇提取物各剂量组与对照组相比对黑色素瘤自发性转移模型的肺转移结节数均有抑制作用，且呈现剂量相关性红茂草醇提取物2g/kg剂量组(P < 0. 05)、红茂草醇提取物4g/kg 剂量组(P <0.01)、红茂草醇提取物6g/kg剂量组(P <0.01)。对于肺重的影响，红茂草醇提取物6g/kg剂量组的肺重量明显低于对照组的肺重(P <0.01)，其他两组无明显作用。3. 2红茂草醇提取物对B16F10黑色素瘤原发位肿瘤体积和重量的影响与生理盐水组相比，红茂草醇提取物对于接种B16F10黑色素瘤细胞后的小鼠足垫部的原发位肿瘤无论是体积以及重量都没有明显的影响作用。
4.结论红茂草醇提取物能够抑制B16F10黑色素瘤肺转移，而且也抑制转移灶的生长，但是对原发肿瘤细胞增殖没有影响，从小鼠体重变化可以看出，红茂草醇提取物的毒副作用很小，为今后体内安全用药提供基础。三、红茂草醇提取物对B16F10黑色素瘤细胞实验性肺转移影响1.实验材料同前2.实验方法2.1制备细胞悬液同前2. 2复制B16F10实验性肿瘤转移模型取C57BL/6小鼠置于小鼠注射固定器，尾静脉注射0. 2mL细胞悬液(含5X IO5肿瘤细胞)。接种过肿瘤细胞的小鼠随机分为4组模型组对照组(生理盐水组)、红茂草醇提取物低剂量组(2g/kg小鼠体重)、红茂草醇提取物中剂量组(4mg/kg小鼠体重)、红茂草醇提取物高剂量组(6g/kg小鼠体重)，每组动物数为10只，从接种后开始各组灌胃给予相应剂量的药物，模型组给予相应的生理盐水，每日一次，给药23天，处死小鼠，取肺脏。避免镊子触及脏器表面，防止损伤组织，用PBS洗净组织。10% PBS-福尔马林固定肺组织，称取肺重，拍照，评价红茂草醇提取物对B16F10肿瘤血行肺转移的影响。3.实验结果实验结果采用Excel统计软件学生t检验，从各组取出的肺组织可以看出，模型组的肺组织转移肿瘤结节数目显著多于给药组，由于肺结节太多，无法计数统计，对肺重的统计分析表明，红茂草醇提取物高剂量组(6g/kg)和红茂草醇提取物中剂量组(4g/kg)均能抑制小鼠肺组织重量，P值分别为P < 0. 01和P < 0. 05。红茂草醇提取物给药前后小鼠体重差异不大，且与对照组相比，小鼠体重未发现有大幅度减少，各组的死亡率显示，红茂草醇提取物药物对于小鼠的体内毒性较小。4.结论红茂草醇提取物给药组小鼠的死亡率与对照组相当，而且体重与给药前也没有明显的减少，说明红茂草醇提取物的毒副作用很小，红茂草醇提取物可以很好的抑制实验性 B16F10黑色素瘤肺转移，红茂草醇提取物对于B16F10细胞直接入血之后的血行过程，黏附过程以及穿出血管过程有一定的抑制作用。
具体实施例方式以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。制备实施例1 取50克红茂草药材，加入8倍药材重量的体积浓度为70%乙醇进行加热回流，回流0. 5小时，重复一次，合并乙醇提取液，浓缩至95°C时相对密度为1. 20的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。制备实施例2:取50克红茂草药材，加入6倍药材重量的体积浓度为70%乙醇进行加热回流，回流0. 5小时，重复一次，合并乙醇提取液，浓缩至95°C时相对密度为1. 25的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。制备实施例3 取50克红茂草药材，加入10倍药材重量的体积浓度为70 %乙醇进行加热回流，回流0. 6小时，重复一次，合并乙醇提取液，浓缩至90°C时相对密度为1. 20的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。制备实施例4 取50克红茂草药材，加入8倍药材重量的体积浓度为60%乙醇进行加热回流，回流0. 5小时，重复一次，合并乙醇提取液，浓缩至95°C时相对密度为1. 20的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。制备实施例5 取50克红茂草药材，加入6倍药材重量的体积浓度为75%乙醇进行加热回流，回流0. 5小时，重复一次，合并乙醇提取液，浓缩至95°C时相对密度为1. 25的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。制备实施例6 取50克红茂草药材，加入10倍药材重量的体积浓度为60 %乙醇进行加热回流，回流0. 6小时，重复一次，合并乙醇提取液，浓缩至90°C时相对密度为1. 20的浸膏，干燥，粉碎
成干浸膏粉。
权利要求
1.红茂草醇提物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用。
2.如权利要求1所述红茂草醇提物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用，其特征在于所述的红茂草醇提物按如下方法制备而成取红茂草药材，加入6-10倍药材重量的体积浓度为60% -75%乙醇进行加热回流，回流0. 2-0. 8小时，重复一次，合并乙醇提取液，浓缩至95°C时相对密度为1. 20 1. 25的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。
3.如权利要求2所述红茂草醇提物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用，其特征在于所述的红茂草醇提物按如下方法制备而成取红茂草药材，加入8倍药材重量的体积浓度为70%乙醇进行加热回流，回流0.5小时，重复一次，合并乙醇提取液，浓缩至95°C时相对密度为1. 20的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。
全文摘要
本发明公开了一种从红茂草醇提物在抗肿瘤药物中的新用途，该提取物具有抗肿瘤转移作用，具体表现为抑制黑色素瘤自发性肿瘤转移和实验性肿瘤转移，可用于制备抗黑色素肿瘤转移药物。
文档编号A61K36/66GK102357123SQ20111029960
公开日2012年2月22日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者不公告发明人 申请人:南京正宽医药科技有限公司