专利名称：用于促进热休克蛋白合成的一种含有以富含羽扇醇的提取物为活性成分的化妆品或药学 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于生产治疗和/或预防连接组织退化的药物或化妆品组合物的富含羽扇醇的提取物的用途。
背景技术：
羽扇豆是一种分布相当广泛的植物，它发现于欧洲、亚洲和南北美洲。此植物与豌豆、蚕豆、大豆和法国豆具有很近的亲缘关系。可以提及几种最公知的羽扇豆白羽扇豆(白羽扇豆)、狭叶羽扇豆(蓝羽扇豆)、黄叶羽扇豆(黄羽扇豆)、南美羽扇豆(珠羽扇豆)、graecus羽扇豆、micranthus Guss羽扇豆、hispanicus羽扇豆、皮洛苏羽扇豆、cosentinii羽扇豆、atlanticus羽扇豆、princei羽扇豆和somaliensis羽扇豆。在欧洲，最常见的一种是甜白羽扇豆，特别是携带pauper基因的Arès变种。
羽扇醇(I)属于三萜烯族，并且更具体地是属于三萜烯醇族。
羽扇醇依靠其许多生物活性而具有明确的价值。特别是已知它的抗炎(Singh S.等人，Filoterapia，1997，68，No.1，9)和止痛(De Miranda A.L.等人，Planta Med，2000，66(3)，284)性能，它关于重金属的肾保护作用(Nagaraj M.等人，J.Appl.Toxicol，2000，20(5)，413)，它的抗组胺作用(DeMedrano Villar M.J.等人，Methods Find Exp.Clin.Pharmacol.1997，19，No.8,515)，以及它的抗有丝分裂活性(Zachariah R.等人，Indian J.Pharm.Sci.，1994，56，No.4,129)和抗病毒活性(Kahlos K.，Filoterapia，1996，67，No.4,344)。
也已知羽扇醇的抗氧化性能。特别是，羽扇醇激活已受环境毒素伤害的皮肤中的抗氧化酶的再生。此外，它是一种皮肤的化学防护剂，并且它有可能抑制皮肤中由过氧化苯甲酰引起的毒性(Saleem M，etal.，2001，Lupeol，a triterpene，inhibits early responses of tumor preventioninduced by benzoyl peroxide in murine skin，Pharmacol Res，43(2)127-134)。
羽扇醇使控制角化细胞增殖成为可能，并因此可以被用在抗炎组合物中。
也已经发现羽扇醇有可能有效地降低肾结石形成的风险，并因此被用于治疗泌尿疾病(Malini MM，et al.(2000)Protevtive effect oftriterpenes on calcium oxalate crystal induced peroxidative changes inexperimental urolithiasis.Pharmacol Res.41(4)413-418)。
羽扇醇也可以被用作合成中间体，特别是用于制备植物激素和类固醇类似物。
羽扇醇在许多植物如库拉索芦荟或沙梨木(Crataeva nurvala)的树皮中存在。在几种情况下，它已经从多种植物如“Bresk”中分离。
它已经被从羽扇豆豆荚中提取。专利申请FR2822821描述了包含羽扇醇的羽扇豆种子豆荚提取物；有利地是，该提取物的羽扇醇含量大于30重量％，优选大于50重量％。甚至更有利的是，羽扇豆种子豆荚提取物的羽扇醇含量为70-100重量％。
专利申请FR2822821也描述了获得羽扇豆种子豆荚提取物的方法，其至少包括以下的一系列步骤研磨羽扇豆豆荚，使用选自脂肪族烷烃、芳香族烷烃、脂肪族醇或其卤代衍生物的有机溶剂，提取包含在研磨的羽扇豆豆荚中的总脂质，纯化获得的脂质以获得富含羽扇醇的提取物。
热休克蛋白(HSP，热压迫或休克蛋白族)，在本文中指热休克蛋白，并将其缩写为HSP，存在于从细菌到人的所有生物中。存在五个主要的HSP类群，特征在于其分子量20-30kDa；50-60kDa；70kDa；90kDa；以及100-110kDa。
泛素和血红素加氧酶也属于主要的HSP族。
HSP本质上在生理条件下进行表达，并具有蛋白质合成必需的基本活性，同时保护细胞不受多种攻击，如温度增加、紫外线辐射、局部缺血多次灌注液和凋亡。
HSP的伴侣功能是发现的一种主要的蛋白质功能。最初在热休克的情况下得以证实，在所有的细胞无休克时，存在大量的这些蛋白质暗示它们有助于蛋白质的正常折叠。这些伴侣能够抑制部分变性蛋白的聚集并利用ATP使它们折叠。它们预防了不正当的蛋白质结合，并且参与了蛋白质在细胞内的运输和蛋白分泌。
HSP47是一种位于细胞内质网(蛋白质合成区室)的蛋白质，并且特异性地结合到多种胶原和前胶原上，特别是I、II、III、IV和V型。
HSP47在细胞的“质量控制系统”中，防止后者分泌具有不当结构的前胶原。已在人类中证实了胶原的过量表达和HSP47之间有关联。
胶原约占总蛋白的30％，并且为连接组织如真皮(70％的细胞外基质蛋白)、软骨或齿龈连接组织(60-65％的蛋白质)的细胞外基质的主要组分。迄今，已经描述了19种不同类型的胶原。在定义上，它们具有不同比例的三个螺旋结构域，并在细胞外基质内形成有组织的结构，如纤丝、细丝或网络。胶原通过连接细胞如真皮和齿龈纤维原细胞而从前胶原中合成，并且也通过关节软骨的软骨细胞合成。合成的胶原纤维变强并组装成束，其组成有限的并且不溶解的胶原纤维，其将能够在以后对张应力作出响应。
连接组织发挥的主要作用是作为组成器官的其它元素的载体和支撑体，以及作为减震器。例如，齿龈连接组织为牙齿提供支撑。在皮肤中，真皮特别对皮肤的硬度起主要作用。
与胶原网络损伤有关的连接组织退化，如胶原和/或前胶原合成的抑制，胶原和/或前胶原的合成不当，胶原纤维退化或纤维原细胞数量及其新陈代谢减少，可能具有重要的后果。
发明内容
本申请人发现，富含羽扇醇的提取物也可以用于刺激热休克蛋白的合成，并且特别是用于刺激HSP47(热休克蛋白47)的合成，以便治疗和/或预防与内部过程和/或外部攻击有关的连接组织的退化。
因此，本申请人发现当皮肤和/或关节和/或齿龈连接组织遭受诱导休克环境时，富含羽扇醇的提取物有可能通过刺激HSP47的合成而控制胶原的正常结构。这种诱导休克环境可以是例如通过体重增加所诱导的身体受限制(phydical constraint)，其尤其可能引起表型和纤维原细胞新陈代谢的改变，暴露于辐射中，尤其是紫外辐射、衰老或发炎。
为了实现本发明的目的，术语“富含羽扇醇的提取物”指一种提取物，其具有的羽扇醇含量大于30重量％，优选大于50重量％，甚至更有利的是70-100重量％。
本发明的主题是利用富含羽扇醇的提取物生产化妆品或药学组合物，该化妆品或药学组合物用于治疗和/或预防与胶原生产异常有关的真皮和/或关节和/或齿龈连接组织中的连接组织的退化。
因此，根据本发明的富含羽扇醇的提取物可以在用于治疗和/或预防真皮和/或关节和/或齿龈连接组织中的连接组织退化的化装品组合物中使用。
富含羽扇醇的提取物也可以在生产用于治疗和/或预防真皮和/或关节和/或齿龈连接组织中的连接组织退化的药品中使用。
在本文中进行的引用未区分药学组合物或药物。
为了实现本发明的目的，词语“胶原生产异常”指纤维原细胞或软骨细胞的合成的胶原和/或前胶原不充分、胶原和/或前胶原的合成不当、胶原纤维退化，或者纤维原细胞或软骨细胞的数量及其新陈代谢减少。
为了实现本发明的目的，术语胶原“合成不当”指任何表现结构异常的胶原或前胶原的合成，其可能不再专门发挥对皮肤和/或关节和/或齿龈连接组织的机械支撑功能。
胶原生产异常可能是由内部或外部的休克因素所诱导的。例如，在身体受限制的条件下，如体重增加、超重，或者尤其是在怀孕时的组织膨胀，并发的(subsequent)辐射特别是紫外线、并发的发炎或衰老状态，遭受这些外部限制的纤维原细胞或软骨细胞，可能合成结构异常的胶原。
胶原生产异常可能尤其是前胶原和胶原的合成受抑制或者合成不当，尤其是前胶原和/或胶原I、II、III、IV或V型。
根据本发明的富含羽扇醇的提取物发挥着启动热休克蛋白合成的作用，尤其是HSP47的合成。热休克蛋白的活化，有利地是HSP47，有可能刺激纤维原细胞或软骨细胞的新陈代谢和增殖，并因此抗击和/或预防胶原网络的退化。
根据本发明的化妆品组合物用于刺激热休克蛋白HSPs的合成，尤其是HSP47的合成，并由此刺激纤维原细胞或软骨细胞的活性。
根据本发明的药学组合物或药物用于刺激热休克蛋白HSPs的合成，尤其是HSP47的合成，并由此刺激纤维原细胞或软骨细胞的活性。
根据本发明的一种有利的实施方案，药学组合物或药物用于治疗和/或预防关节病理，尤其是非炎症的关节病理。
关节病的特征在于围绕软骨细胞的细胞外基质的合成和退化不平衡，其主要包括胶原纤维网络、亲水性蛋白多糖胶体和软骨细胞和关节软骨，发挥着对于保护软骨下骨(subchondral bone)所必不可少的双重机械作用。首先，它减少了骨骼段移动时的摩擦力，并且其次，它确保了关节所遭受的应力的传输、分配和吸收。
一旦已经成年，在关节软骨中的胶原网络再生量非常小。因此，能够刺激胶原和前胶原的合成和/或减轻为软骨的主要组分的胶原网络的损伤是非常重要的。根据本发明的药学组合物有可能刺激HSP47的合成，其因此有可能抗击和/或预防关节软骨的连接组织的退化。
有利地，根据本发明的药物用于预防和/或治疗关节病，其可能是主要由于，连接组织结构的改变以及蛋白多糖减少的软骨的损伤而引起。
根据本发明的药物或药学组合物也用于预防和/或治疗牙周病。特别是，根据本发明的药学组合物用于预防和/或治疗齿龈炎和牙周炎。
牙周病，其最终结果是丧失牙齿，尤其反映在齿龈连接组织的退化。齿龈连接组织由60-65％的胶原组成。根据本发明的药学组合物使之有可能通过刺激有可能促进胶原表达的HSP47的合成而抗击和/或预防齿龈连接组织的退化。
根据本发明的另一有利实施方案，根据本发明的药物用于预防和/或治疗萎缩纹(stretch mark)。
萎缩纹可视为对纤维原细胞的一种影响，其特征尤其在于抑制编码粘连蛋白、I型胶原和II型胶原的基因表达，以及纤维原细胞在机械膨胀的影响下转化为肌纤维原细胞。这种胶原组织退化引起形成萎缩的真皮疤痕。主要的起始原因之一就是机械应力。
有利地是，根据本发明的药学组合物用于局部应用。术语“局部应用”指将该组合物应用到皮肤和口腔区域，特别是齿龈。
根据本发明的药学组合物的特征在于富含羽扇醇的提取物的含量为0.001-10重量％，优选为0.1-10重量％，特别是1-5重量％，与药学组合物的总重量有关。
根据本发明的化妆品组合物有可能促进对休克和对皮肤和/或关节和/或齿龈连接组织的机械应力的抵抗。
所述化妆品组合物允许连接组织在身体受限制时经得起应力，如体重增加、超重，或者组织膨胀，尤其是怀孕或辐射特别是紫外辐射的情况下。
根据本发明的一种有利实施方案，化妆品组合物有效地用作皮肤和/或关节和/或齿龈连接组织和/或黏膜的愈合剂。这是由于根据本发明的化妆品组合物有可能刺激纤维原细胞和软骨细胞的活性，其合成胶原，必要地用新组织补偿丧失的物质。
有利地是，化妆品组合物特别用于预防和/或预防萎缩纹及其出现。
根据本发明的另一有利实施方案，化妆品组合物用作皮肤和/或黏膜的重组剂。
化妆品组合物也有利地用作皮肤和/或黏膜的抗松垂剂。皮肤老化的特征尤其在于纤维原细胞的数量减少及其活性降低。根据本发明的化妆品组合物有可能刺激纤维原细胞的新陈代谢和增殖。因此，它有利地用于预防和/或延缓随时间的皮肤老化、外在的皮肤老化，特别是由于阳光、香烟、污染或应力所引起，以及绝经期的皮肤老化。
根据本发明的化妆品组合物作用于皮肤的真皮。
根据本发明的有利变形例，化妆品组合物特别用于怀孕的妇女。
化妆品组合物也可以用作漱口药或牙膏。
为了实现本发明的目的，术语“牙膏”包括所有常见的牙膏制剂，无论特别是以牙齿胶体的形式、还是牙膏或者牙膏和胶体组合的形式。
有利地，化妆品组合物用于局部应用。术语“局部应用”指将组合物应用到皮肤和口腔区域，特别是牙床。
根据本发明的化妆品组合物的特征在于，相对于化妆品组合物的总重量富含羽扇醇的提取物的含量为0.001-10重量％，优选为0.1-10重量％，特别是1-5重量％。
富含羽扇醇的提取物的羽扇醇含量大于30重量％，优选大于50重量％，甚至更优选70-100重量％。
因此，根据本发明的化妆品组合物的特征在于羽扇醇的含量为0.0003-10重量％，优选为0.007-10重量％，与化妆品组合物的总重量有关。
使之有可能实施本发明的组合物包括一种化妆品可接受的载体，即一种与皮肤兼容的载体，并可以为常用于局部应用的任何药学形式，特别是以水溶性、醇溶性或油性溶液的形式、水包油或油包水或多重乳状液的形式、水溶性或油性胶体或液态、糊状的或固态的无水产品的形式、通过小球体的油在水相的分散形式，对于这些小球体，有可能为聚合的纳米颗粒，如纳米小球和纳米胶囊，或者更好是离子或非离子类型的脂质泡囊，或者是跨真皮设备，或者以用于局部应用的其它形式。
所述组合物可以或多或少为液体，并可能具有白色或有色膏体、药膏、牛奶、洗液、浆液、浆糊、泡沫或胶体的外形。
任选地，它可以以气溶胶的形式用于皮肤。它也可以为固态形式，例如为棍的形式。它也可以通过小块应用。
有利地，化妆品可接受的介质为油性溶液、油包水乳状液、水包油乳状液、微乳状液、油性胶体、非水胶体、泡囊分散物、微胶囊或微粒或跨真皮设备。
根据本发明的组合物也可以含有常见的化妆品佐剂，如亲水的或亲脂的胶凝剂、亲水的或亲脂的活性剂、增稠剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、香味剂、螯合剂、气味吸收剂、化学的或矿物的掩蔽剂、矿物染料、表面活性剂、聚合物、硅油和染料。这些不同佐剂的量为所研究领域的常用量，并且例如为组合物总重量的0.01-20％。根据其本性，这些佐剂可以被导入脂肪相、水相、脂质泡囊或纳米微粒中。
当本发明的组合物为乳状液时，脂肪相的比例可以为组合物总重量的5-80重量％，并优选为5-50重量％。在乳状液形式的组合物中使用的油、乳化剂和辅助乳化剂选自在所研究的领域中常用的那些。乳化剂和辅助乳化剂存在于组合物中，其比例为组合物总重量的0.3-30重量％，并优选0.5-20重量％。
作为可以在有可能实施本发明的组合物中使用的油，可以是矿物油、植物油(杏仁油、葵花油、李子油)、动物油、合成油、硅油和氟代油(全氟聚醚)。脂肪醇(十六醇)、脂肪酸和石蜡(蜂蜡)也可以被用作脂肪物质。
作为可以在有可能实施本发明的组合物中使用的乳化剂和辅助乳化剂，例如可以由聚乙二醇的脂肪酸酯制得，如PEG-40硬脂酸盐或PEG-100硬脂酸盐，以及多元醇的脂肪酸酯，如丙三基硬脂酸盐和山梨糖醇酐三脂肪酸酯。
作为亲水的胶凝剂，可以特别由羧基乙烯基聚合物(carbomer，卡波姆)、丙烯酸共聚物，如丙烯酸/烷基-丙烯酸共聚物、聚丙烯酰胺、聚糖、天然胶体和粘土制得，并且，作为亲脂的胶凝剂，可以提到改性粘土如有机皂土、脂肪酸的金属盐、疏水的二氧化硅和聚乙烯。
根据本发明的化合物和组合物的给药方法、剂量和优选的药学形式可以根据在制备化妆品时经常考虑的标准，优选适用于治疗患者的皮肤病学的化妆品的标准而确定例如病人的体重、观察到的过多脂肪、出现脂肪团组织、对治疗的容忍度或皮肤类型。
根据本发明的化合物可以包含其它的活性剂，如大豆肽、由氨基酸甘氨酸、组氨酸和赖氨酸组成的三肽、这些肽和三肽的混合物、和/或至少一种乳酸类型的α-含氧酸，特别是用于治疗和/或预防萎缩纹，或者当该组合物作为抗松垂剂，用于皮肤和/或黏膜，或者用于经受住身体受限制如体重增加或连接组织膨胀时的应力，特别是在怀孕的情况下。
在本发明的一种特定实施方案中，相应于组合物的总重量，化妆品或药学组合物含有介于0.1-10重量％的富含羽扇醇的提取物，优选介于0.1-5重量％，特别介于1-5重量％，，以及水解的大豆蛋白类型的大豆肽、或由氨基酸甘氨酸、组氨酸和赖氨酸组成的三肽。大豆肽或三肽在组合物中存在的量相应于组合物的总重量，优选介于0.1-10重量％，甚至更优选介于1-5重量％，甚至更优选介于2-4重量％。有利地，组合物也含有α-含氧酸，如乳酸。α-含氧酸在组合物中存在的量，相应于组合物的总重量，优选介于0.1-20重量％，甚至更优选介于10-15重量％。
在本发明中，优选添加到组合物中的大豆肽可以为根据本领域技术人员公知的操作条件通过水解从大豆提取的蛋白质而获得的任何肽，换句话说，可以为任何大豆蛋白的水解产物。优选地，这些大豆肽为那些已经用微生物菌株发酵过的肽。通常情况下，通过在控制温度、pH、氧化和持续时间等条件下，将大豆肽放在含有葡萄糖、无机盐和一定的微生物菌株的发酵罐中而获得发酵的大豆肽。发酵后，通过常规的分离和过滤操作而获得发酵的大豆肽。该技术尤其是由Coletica公司实施，其因而出售多种发酵的植物蛋白水解产物。优选地，在根据本发明的组合物中使用的发酵和未发酵的大豆肽具有的分子量约为200-20000道尔顿之间，例如通过电泳所测量的。
用于根据本发明的组合物的特别优选的大豆肽为称作“Phytokine”的发酵肽，由Coletica公司所出售。
这种特定的发酵大豆肽，其平均分子量约为800道尔顿，是通过将用乳酸菌微生物菌株发酵大豆肽而获得的，并且其氨基酸的克数(aminogram)如下残基数/100Hyp 0.39Asp 12.64
Thr2.93Ser4.29Glu20.08Pro7.31Gly7.95Ala7.76CysND*Val5.59Met0.96Ile4.46Leu7.42Tyr1.38Phe3.39His2.12Hyl0.09Lys5.73TrpND*Art5.53β-Ala ND(ND*未测)术语“由氨基酸甘氨酸、组氨酸和赖氨酸组成的三肽”尤其是指Gly-His-Lys序列的三肽，其中的氨基酸可以为D、L或DL形式，优选以与金属如锌或铜形成复合物的形式结合到羧酸如乙酸上。
在由氨基酸甘氨酸、组氨酸和赖氨酸组成的三肽中，优选使用三肽“Kollaren-CPP”，其INCI名称为“三肽-1”的，如Seporga公司所出售的。“Kollaren-CPP”为一种Gly-His-Lys序列的三肽，以与锌形成复合物的形式结合到乙酸(醋酸盐)。
α-含氧酸可以为有可能在皮肤上获得脱落和增湿作用的α-含氧酸，例如柠檬酸、丙酮酸、羟基乙酸或乳酸。
用于根据本发明的组合物的α-含氧酸特别优选乳酸。
根据本发明使用的组合物也优选包括一种化合物，其用于调节根据本发明的组合物的pH，数值为约2-约4，并优选数值为约3.5，特别是用于局部中和α-含氧酸。特别是，可以使用精氨酸或链烷醇胺，例如可以使用三乙醇胺。
在本发明的一特定实施例中，羽扇醇从羽扇豆豆荚中获得，其优选选自狭叶羽扇豆、白羽扇豆、黄叶羽扇豆、南美羽扇豆、graecus羽扇豆、micranthus Guss羽扇豆、hispanicus羽扇豆、皮洛苏羽扇豆、cosentinii羽扇豆、atlanticus羽扇豆、princei羽扇豆和somaliensis羽扇豆。根据本发明的一种优选实施方案，羽扇醇从白羽扇豆豆荚中获得，优选携带pauper基因的白羽扇豆变种。
以下实施例对本发明作了说明，而不限制其范围。
具体实施例方式
实施例1富含羽扇醇的提取物的组合物下表1给出了在本发明的上下文中使用的富含羽扇醇的提取物的一种特定组合物以及规格，即羽扇醇的提取物必须满足的，以能够视为根据本发明的富含羽扇醇的提取物。
表1
(1)在105℃下1小时实施例2羽扇醇对编码HSP47热休克蛋白的基因表达的影响我们利用“cDNA微阵列”方法研究产物对基因表达的影响，所述基因编码了皮肤病中具有潜在兴趣的结构和调节蛋白质。这种方法使得有可能在一个单一的步骤中筛选一种产品或治疗对于给定的生物系统中的基因表达的影响，并获得这种治疗效果的一个信号。
培养条件和检测产品将产品应用到培养在MEM/M199中的人皮肤纤维原细胞18小时。检测含量为4.5μg的乙醇溶液中的羽扇醇，该浓度与无细胞毒害的剂量一致。
分析有差别的基因表达采用的方法为Clontech(Palo Alto，USA)所推荐的，并包括提取和纯化总的RNA；根据AtlasPure方法(Clontech)纯化信使RNAs；通过反转录，用P32标记DNA探针；通过排阻柱色谱纯化标记探针，并通过液体闪烁计数器检验质量和当量，并且用放射标记的探针杂交膜(由Custom Atlas BIOAlternative公司提供)。
结果分析利用Cyclone PhosphorImager(由Packard仪器公司提供)，通过直接定量斑点的放射性而分析膜。
结果用相对单位(RU，与每个基因相应的双斑点的点的平均放射性，用于背景噪音和探针标记强度差别的校正)表示。在本次试验中，任意地(arbitraryly)认为当RU大于或等于2时，基因表达明显。
对每种情况、每次标记逐一分析结果。任意地，对于刺激影响显著性限制固定在约为控制组的+30％，，即大于130％的影响。
结果在我们的试验条件下，在4.5μg/ml羽扇醇存在的情况下培养18小时，诱导出编码HSP47的基因表达的正调节(参见表2)。
表2
结论实施例2的结果暗示出羽扇醇能够完全出乎意料地刺激所培养的人皮肤纤维原细胞中编码HSP47热休克蛋白的基因。
实施例3羽扇醇对所培养的人皮肤纤维原细胞模型中的HSP47热休克蛋白表达的影响为了证实通过筛选显示的HSP47的这种潜在刺激，我们通过Western blot技术研究了HSP47蛋白的表达。
该技术包括在变性条件下，于聚丙烯酰胺凝胶上分离不同的蛋白质；将蛋白质转移到特定的膜(PVDF膜，由Biorad公司出售)上；用特异性抗体(HSP47，Stressgen)标记感兴趣的蛋白质；用显色法观测(Sigma Fast，BCPIP/NBT)。
检测了多种无毒浓度(5，10和20μg/ml)和几种培养时间(24和48小时)。
在我们的试验条件下，我们纪录了剂量为20μg/ml，并且培养时间为48小时的HSP47产物的刺激，。
采用微阵列技术和Western blot技术本发明人完全出乎意料地显示出，羽扇醇在转录(mRNA)和翻译水平上即蛋白质水平上刺激HSP47的生产。
实施例4羽扇醇对正常纤维原细胞和萎缩纹纤维原细胞的影响a)细胞在本次研究中，使用了正常的纤维原细胞(FS)、来自红色或最近的萎缩纹纤维原细胞(FVr)和来自年长的白色萎缩纹纤维原细胞(FVb)。
b)处理在不存在或存在浓度为7μg/ml的羽扇醇的情况下培养纤维原细胞。
c)羽扇醇对培养在自由格中的纤维原细胞收缩容量的影响原理收缩机理包括通过纤维原细胞而聚集和重新排列胶原。胶原聚合为细胞附着的纤丝。后者通过其移动而拉纤丝，并因此重组基质。随后，晶格的直径减小。
方法将用于产生晶格的混合物倒入直径为50mm的Petri盘中。于37℃下几分钟后形成胶体。在有或无羽扇醇的情况下培养晶格。通过测定晶格的直径而测量收缩度。
结果在起初的几天，胶体的直径大大减小。FS比FVr和FVb使基质收缩更快。在FVr和FVb之间未观察到显著区别。
下表3给出了结果。例如，在D1相对于FV的29％，FS使晶格收缩到其原始直径的40％。羽扇醇的加入减慢了收缩。例如，在D2对于FS，羽扇醇使收缩减慢了20％，对于FVr减慢了20％，对于FVb减慢了10％。
表3
因此，羽扇醇降低了在胶原晶格中培养的纤维原细胞的收缩容量。
d)羽扇醇对培养在自由格中通过纤维原细胞发展的等长收缩力的影响原理于其中包埋纤维原细胞的胶原胶体收缩的机械抑制反映为力的生成，其称为“收缩力”或“等长收缩力”。
晶格在包括8个矩形池的培养盘中发育。于每个池中放入2个弹性硅载玻片，其下部包括栅格，当晶格聚合时附着于此。晶格在2个载玻片间发育以生成中心稍微缩小的矩形形状。在常规的结构中，这种形状被称为“对三角形(diabolo)”形状。这些载玻片在其上部具有由金沉积在其表面制成的应变测量系统。在由于纤维原细胞而产生的收缩力的影响下，硅载玻片变形。这反映为应变量规的电阻值发生变化，通过惠斯通电桥进行测量。这种变化表示晶格内生成的力，实时通过PC获取卡和适当的软件测量。
方法将用于产生晶格的混合物倒入培养盘的矩形池中。于37℃下几分钟后形成胶体。加入含有或不含7μg/ml羽扇醇的DMEMC培养基。测量等长收缩力48小时。
结果
图1给出了作为培养时间函数的等长收缩力的测量结果，。在培养的最初8小时，等长收缩力增加。在FS和FVb之间未观察到显著性差异。培养7小时后，FVr生成明显大于FS和FVb所生成的等长收缩力，(FVr5547V±808；FS3583V±1076；FVb3999V±881)。对于3种细胞系中的每一个，羽扇醇的加入大大降低了等长收缩力(在培养时间为7小时时FVr+LU1132488V±1065；FS+LU1131325V±372；FVb+LU1131365V±228)。
因此，羽扇醇降低了在整齐的晶格中培养的正常纤维原细胞和来自萎缩纹(红色和白色)的纤维原细胞的等长收缩力。
e)羽扇醇对培养在自由格中的纤维原细胞的形态学影响原理纤维原细胞为具有纺锤状或星形形态学的大细胞(100μm)。它们的细胞质含有组装的蛋白丝(中间纤维、微管、肌动蛋白丝)，其形成框架或细胞骨架，与质膜密切相关。细胞所有蛋白质的10％由肌动蛋白组成，以丝状体或束的形式聚合，其经常被描述成应力纤维。肌动蛋白丝通过生成等长收缩力而有助于纤维原细胞的收缩活性。存在几种类型的肌动蛋白，包括聚合的纤丝肌动蛋白(F肌动蛋白)和α平滑肌肌动蛋白(αSM肌动蛋白)。
方法1.证实F肌动蛋白将在尼龙环上拉伸的晶格在Petri盘(φ50mm)中培养5天。用在PBS中3％多聚甲醛中固定20分钟，并随后用PBS清洗。接着，用PBS+0.1％Triton X100进行孵育，以便渗透膜。将晶格用闪毒蕈环肽(phalloidin)-FITC(2.5μg/ml)在黑暗中孵育30分钟，并用PBS清洗。并用一滴Vectashield将它们安装在载玻片和盖玻片之间，并随后在UV下在荧光显微镜下观察。
2.证实αSM肌动蛋白将在尼龙环上拉伸的晶格在Petri盘(φ50mm)中培养5天。用在PBS中3％多聚甲醛中固定20分钟，并随后用PBS清洗。接着，用PBS+0.1％Triton X100进行孵育，以便使抗体渗透相应的膜，接着使用3％H2O2以消除内在的过氧化物酶。用在PBS中的3％BSA+10％羊血清封闭非特异性键合。随后，将晶格用稀释到1/100的鼠抗-αSM肌动蛋白一抗孵育过夜，接着用PBS+BSA进行清洗。施加稀释到1/150的过氧化物酶耦合的抗鼠IgG二抗1小时，并随后用PBS+BSA进行清洗。标记的位置用DAB溶液显示，其引起过氧化物酶变黑。晶格用Harris苏木精复染色1-2分钟。将它们安装在载玻片和盖玻片，随后，在光学显微镜下进行观察。
结果1.证实F肌动蛋白(参见图2)将FS、FVr和FVb纤维原细胞伸长并成为纺锤状。它们的细胞质具有F肌动蛋白应力纤维。
因此，在羽扇醇存在的情况下，FS、FVr和FVb纤维原细胞丧失了其F肌动蛋白应力纤维并向星形形状发展。
2.证实αSM肌动蛋白(参见图3)αSM肌动蛋白，由棕色显色而显示，以颗粒状存在于FVr纤维原细胞的细胞质中。FS和FVb纤维原细胞含有少量的颗粒状αSM肌动蛋白。
在羽扇醇存在的情况下，FS、FVr和FVb纤维原细胞显示出对于αSM肌动蛋白的微弱标记。
因此，在羽扇醇(活性组分LU113)存在的情况下，未保存肌动蛋白网络的细胞质分布。
f)结论总之，这里已表明了羽扇醇改变正常纤维原细胞和来自萎缩纹的纤维原细胞的机械性能收缩容量和等长收缩力，纤维原细胞的形态学，不存在应力纤维。
萎缩纹出现在皮肤遭受过量损伤且真皮脆弱的地方，在本质上或通过新陈代谢、激素或其它紊乱。红色萎缩纹(最近的和演变的萎缩纹)的纤维原细胞具有非常大的收缩容量，也就是说，高等长收缩力和发育好的应力纤维网络。
本研究显示羽扇醇促进了皮肤的去收缩(肌动蛋白纤维和等长收缩力降低)，并因此其作用可以在萎缩纹中是有益的。
在下面的实施例5-10中，以百分比(重量/重量)的形式给出了比例，并且缩写QS指量足够，缩写QSF指用于足量。
实施例5漱口药富含羽扇醇的提取物 0.1-10％乙醇10％丙三醇 10％包含40mol EO(Cremophor co410)的乙氧基化氢化蓖麻油 0.5％聚(甲基乙烯基醚/马来酸)(Gantrez S97BF) 0.2％氢氧化钠0.15％氟化钠 0.05％肉桂-薄荷香味剂 0.1％三氯生(Triclosan) 0.03％氯化锌 0.01％糖精钠 0.01％染料C.I.16255(E124) 0.0025％纯化水 QSF 100％实施例6牙膏富含羽扇醇的提取物 0.1-10％
单氟磷酸钠0.75％氟化钠0.10％70％山梨醇35％具有高研磨力的合成二氧化硅13％具有低研磨力的合成二氧化硅5％羧甲基纤维素钠1.6％十二烷基磺酸钠1％含薄荷醇的香味剂 0.85％氧化钛0.5％氢氧化钠碱液 0.5％环磺酸化钠0.3％薄荷醇0.15％糖精钠0.07％纯化水QSF 100％实施例7抗萎缩纹霜水QSF100％乳酸 10.0％三乙醇胺 7.5％cyclomethicone5.4％乙基己基软脂酸盐 4.5％氢化椰子甘油酯3.0％甲硅醇乳酸钠 3.0％丙二醇2.5％异癸基新戊酸酯2.0％水解的大豆蛋白2.0％甘油基硬脂酸盐1.7％二十烷醇 1.6％十六烷基醇1.3％硬脂酸1.0％富含羽扇醇的提取物0.1-10％
二十二醇 0.9％聚丙烯酰胺0.8％日产槐属树叶提取物0.5％二十烷葡糖甙 0.4％蜂蜡 0.4％C13-14异链烷烃0.4％DEA十六烷基磷酸盐 0.3％葡萄糖酸锌0.2％丙三醇0.1％鲸芳香基醇0.1％鲸蜡 0.1％椰子甘油酯0.1％Laureth-7 0.1％浒苔属compressa提取物 0.1％香味剂QS防腐剂QS实施例8抗萎缩纹霜水QSF100％乳酸 10.0％三乙醇胺 7.5％cyclomethicone5.4％乙基己基软脂酸盐 4.5％氢化椰子甘油酯3.0％甲硅醇乳酸钠 3.0％丙二醇2.5％异癸基新戊酸酯2.0％顺序为Gly-His-Lys的三肽 2.0％甘油基硬脂酸盐1.7％二十烷醇 1.6％十六烷基醇1.3％
硬脂酸 1.0％富含羽扇醇的提取物 0.1-10％二十二醇 0.9％聚丙烯酰胺 0.8％日产槐属树叶提取物 0.5％二十烷葡糖甙 0.4％蜂蜡 0.4％C13-14异链烷烃 0.4％DEA十六烷基磷酸盐 0.3％葡萄糖酸锌 0.2％丙三醇 0.1％鲸芳香基醇 0.1％鲸蜡 0.1％椰子甘油酯 0.1％Laureth-7 0.1％浒苔属compressa提取物 0.1％香味剂 QS防腐剂 QS实施例9抗萎缩纹霜水 QSF100％乳酸 10.0％三乙醇胺 7.5％cyclomethicone 5.4％乙基已基软脂酸盐 4.5％氢化椰子甘油酯 3.0％甲硅醇乳酸钠 3.0％丙二醇 2.5％异癸基新戊酸酯 2.0％水解的大豆蛋白 1.0％顺序为Gly-His-Lys的三肽2.5％
甘油基硬脂酸盐 1.7％二十烷醇 1.6％十六烷基醇 1.3％硬脂酸 1.0％富含羽扇醇的提取物 0.1-10％二十二醇 0.9％聚丙烯酰胺 0.8％日产槐属树叶提取物 0.5％二十烷葡糖甙 0.4％蜂蜡 0.4％C13-14异链烷烃 0.4％DEA十六烷基磷酸盐 0.3％葡萄糖酸锌 0.2％丙三醇 0.1％鲸芳香基醇 0.1％鲸蜡 0.1％椰子甘油酯 0.1％Laureth-7 0.1％浒苔属compressa提取物 0.1％香味剂 QS防腐剂 QS实施例10重组胶体水 QSF100％PEG-6 3.60％丁二醇 2.70％糊精 1.86％苯基trimethicone 1.20％富含羽扇醇的提取物 0.1-10％丙烯酸脂/C10-30烷基丙烯酸脂交联聚合物 0.60％dimethicone/苯基乙烯基dimethicone交联聚合物0.30％
日产槐属树叶提取物0.20％黄原胶0.15％PPG 26-buteth-26 0.11％4，5，7-三羟基异黄酮 0.10％水解的大豆蛋白0.10％葡萄糖0.08％氢化蓖麻油PEG40 0.07％山梨醇0.04％积雪草asiatica提取物 0.04％丙三醇0.04％柠檬酸0.02％浒苔属compressa提取物 0.02％香味剂QS防腐剂QS
权利要求
1.利用富含羽扇醇的提取物生产药学的或化妆品的组合物的用途，其用于治疗和/或预防与胶原蛋白有关，特别是I型、II型、III型、IV型和V型胶原蛋白生产异常有关的真皮和/或软骨中的连接组织退化，特别是关节软骨和/或齿龈连接组织的退化。
2.根据权利要求1的用途，用于激活热休克蛋白的合成，特别是HSP47的合成。
3.根据前述任一权利要求的用途，其特征在于所述药学组合物用于治疗和/或预防关节疾病如关节病，或牙周病如齿龈炎或牙周炎，用于治疗萎缩纹或用于预防其发生。
4.根据权利要求1或2的用途，化妆品组合物作为皮肤和/或粘膜的愈合剂、重组剂和抗松垂剂。
5.根据权利要求4的用途，其特征在于化妆品组合物允许连接组织在身体受限制时经受住休克，如体重增加、超重或所述组织的膨胀，特别是在怀孕或辐射尤其是紫外辐射的情况下。
6.根据权利要求4或5的用途，用于预防和/或延缓皮肤老化，和/或用于预防和/或治疗萎缩纹或其发生。
7.根据权利要求4-6中任一项的用途，其特征在于希望所述化妆品组合物专门用于怀孕的妇女。
8.根据权利要求4的用途，组合物作为漱口药或牙膏。
9.根据权利要求4-8中任一项的用途，其特征在于所述化妆品组合物用于局部应用。
10.根据权利要求4-9中任一项的用途，其特征在于所述化妆品组合物包括重量为0.001-10％的富含羽扇醇的提取物。
11.根据前述任一权利要求的用途，其特征在于所述提取物具有的羽扇醇含量大于30重量％，优选大于50重量％。
12.根据权利要求11的用途，其特征在于所述提取物具有的羽扇醇含量为70％-100重量％。
13.根据前述任一权利要求的用途，其特征在于所述羽扇醇从白羽扇豆豆荚中获得，优选携带pauper基因的白羽扇豆变种Arès。
全文摘要
本发明涉及利用富含羽扇醇的提取物生产用于治疗和/或预防连接组织退化的化妆品或药学组合物的用途。所述的发明也涉及利用富含羽扇醇的提取物生产用于治疗和/或预防非炎症的关节疾病、牙周病和萎缩纹的药学组合物的用途。本发明还涉及利用富含羽扇醇的提取物生产作为皮肤和/或粘膜的愈合剂、重组剂和抗松垂剂的化妆品组合物的用途。
文档编号A61Q11/00GK1826127SQ200480020788
公开日2006年8月30日 申请日期2004年7月19日 优先权日2003年7月18日
发明者P·姆西卡, A·皮奇里利, N·皮卡尔迪 申请人:科学发展实验室