多重检测ROS1基因突变的试剂盒及方法与流程

本发明属于生物技术和肿瘤诊断领域，具体地说，本发明涉及多重检测ros1基因突变的试剂盒及方法。
背景技术：
：肺癌是发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(nsclc)数量约占所有肺癌患者的85％，晚期非小细胞肺癌患者的5年生存率约为15％。随着技术的发展，肿瘤中发生的基因突变越来越受到人们重视，非小细胞肺癌具有高度的异质性，导致其临床表现及治疗效果极其多样化。活性氧基团基因1(reactiveoxygenspecies1，ros1)融合基因突变在非小细胞肺癌(nsclc)中较为常见，在肺腺癌病例中约占2.4％。ros1基因编码一种受体酪氨酸激酶，是继egfr基因突变和alk融合基因突变之后又一明确的非小细胞肺癌药物治疗靶标。目前已发现ros1可与多个基因发生融合，如cd74、slc34a2、ezr、lrig3、sdc4、tpm3、tfg、gopc、ccdc6、msn、cltc、tmem106b和tpd52l1等，发生ros1融合后会持续激活ros1酪氨酸激酶区及其下游pi3k/akt、ras/mapk等信号通路，从而引起肿瘤的发生。克挫替尼作为靶向alk和met的酪氨酸激酶抑制剂，对ros1阳性突变的肺癌患者有较好的疗效，于2016年3月11日被美国食品和药物管理局(fda)批准用于晚期转移性ros1重排。因此，对于ros1融合基因的筛查对肿瘤靶向治疗具有重大的意义。目前基因突变常用的检测方法包括：荧光原位杂交法、荧光pcr法、免疫组化法、高通量测序法等。(1)荧光原位杂交法(fish)：目前fish是检测基因融合的金标准。fish的荧光探针标记方法很多，包括缺口平移法、随机引物法、氨基化合物标记法等，目前使用最多的是缺口平移法。但fish存在操作和判读技术要求较高、耗时长等不足，并且受酶用量和酶切偏好性的影响，针对不同模板标记效率存在差异，以致标记的探针用于检测基因融合准确性不足。(2)荧光pcr法：目前常用的基因突变检测方法，检测灵敏度高，可检出样品中含量低至1％的突变基因，且大幅缩短目标产物的长度，可解决石蜡包埋组织样本提取的dna片段化的难题，从而获得较为准确的检测结果。荧光pcr法操作简单，能极大的避免扩增产物的污染。但该方法多用于检测单碱基变异、缺失及插入，在检测基因融合时由于融合位点较多的较难同时设计覆盖所有突变，因此虽然荧光pcr法拥有众多优点，但在多重基因融合突变检测方面应用极少。(3)免疫组化法(ihc)：抗原抗体之间的结合具有高度特异性，采用ihc可对病理组织中的目标蛋白进行定位和相对定量的检测。ihc具有简便易行、价格便宜、操作方法成熟等优点，但存在敏感性和可重复性方面的挑战。(4)高通量测序法：高通量测序法价格昂贵，读长大约30-250bp，对序列拼接造成了负担，检测结果仍需要验证，并且对于检测外显子与内含子交界区的小片段缺失的准确性不够。高通量测序法操作繁琐，限制了测序速度。因此，本领域迫切需要开发能够有效检测肿瘤患者ros1融合基因突变的技术以满足临床准确、快捷、低成本的需求。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种多重检测ros1融合基因突变的试剂盒及方法。在本发明的第一方面，提供了一种用于多重检测ros1融合基因突变的引物对集，所述引物对集包括：如seqidno.:1所示的正向引物；和，如seqidno.:5所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对集还包括：seqidno.:2所示的正向引物；和/或，seqidno.:3所示的正向引物；和/或，seqidno.:4所示的正向引物。在另一优选例中，所述引物对集还包括：如seqidno.:6所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对集包括：如seqidno.:1、seqidno.:2、和seqidno.:3所示的正向引物；以及，如seqidno.:5所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对集包括：如seqidno.:1、seqidno.:2、seqidno.:3和seqidno.:4所示的正向引物；以及，如seqidno.:5和seqidno.:6所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对集还包括(内标)：如seqidno.:9示的正向引物；和，如seqidno.:10示的反向引物。本发明的第二方面，提供了一种多重检测ros1融合基因突变的探针组，所述探针组包括核苷酸序列如seqidno.:7示的第一突变探针，和/或核苷酸序列如seqidno.:8示的第二突变探针。在另一优选例中，所述探针组还包括核苷酸序列如seqidno.:11的内控探针。在另一优选例中，所述突变探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述突变探针的3’端包含有荧光淬灭基团。在另一优选例中，所述内控探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述内控探针的3’端包含有荧光淬灭基团。在另一优选例中，所述突变探针标记的荧光报告基团不同于所述内控探针标记的荧光报告基团。本发明的第三方面，提供了一种用于多重检测ros1融合基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针组。在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含seqidno.:1-11示的多核苷酸序列。在另一优选例中，使用pcr用缓冲液(buffer)配制所述引物探针混合液。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含rna酶系，所述rna酶系包括逆转录酶、热启动酶、rna酶抑制剂、和dntps。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性质控品。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性质控品。本发明的第四方面，提供了一种多重检测ros1融合基因突变的方法，所述方法包括步骤：(1)提供待检测对象的总核酸样本；(2)制备pcr反应体系并进行pcr检测：其中，所述pcr反应体系包括：步骤(1)提供的所述总核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针组。在另一优选例中，所述pcr反应体系包括步骤(1)提供的所述总核酸样本和引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含seqidno.:1-11示的多核苷酸序列。在另一优选例中，所述总核酸可来自石蜡包埋组织、新鲜组织。在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。在另一优选例中，所述pcr反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。在另一优选例中，所述pcr反应体系还包括rna酶系；和/或pcr用缓冲液。本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针组的用途，用于制备pcr检测试剂盒，所述pcr检测试剂盒用于检测ros1融合基因突变。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1ros1基因exon32、exon34融合检测灵敏度图；图2实例3中临床样本检测结果典型阳性示例1；图3实例3中临床样本检测结果典型阳性示例2；图4对照共用下游引物1结果示意图；图5对照共用下游引物2结果示意图；图6对照共用下游引物3结果示意图；图7对照共用下游引物2组合成多重pcr体系结果示意图；图8对照共用下游引物3组合成多重pcr体系结果示意图。具体实施方式本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种多重检测ros1融合基因突变的试剂盒及方法，能够同时检测ros1融合基因的6种突变类型，本发明的方法和试剂盒具有检测过程简单、可检突变类型多、灵敏度高、样本依赖性小等优点。本发明提供一种高特异性、高灵敏度的多重肺癌ros1融合基因突变检测的引物、探针、试剂盒及引物分配方式。本发明通过荧光检测技术，利用新鲜组织样本、石蜡包埋组织样本基因融合的检测，具有取材便捷、高特异性、高灵敏度、检测结果重复性好、操作快捷简便等优点，一次性检测肺癌ros1融合基因突变的6种突变，大大缩短检测时间的同时，提高了灵敏性和准确性，提供了可靠便捷的检测方法。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。多重pcr多重pcr(multiplexpcr)，又称多重引物pcr或复合pcr，它是在同一pcr反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的pcr反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般pcr相同。影响多重pcr反应的因素有很多，比如：(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是dna聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行pcr反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方dna介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。本发明的目的在于提供能够检测6种ros1融合基因突变的pcr检测试剂盒。由不同突变位点检测试剂和内控检测试剂组成。基因突变检测采用fam信号指示，内控检测采用vic信号指示。本试剂盒检测的突变和融合类型如表1：表1试剂盒检测的所有突变类型信息*以上基因信息来源于cosmic数据库。本试剂盒组成详见表2和表3，可同时检测6种肿瘤热点基因突变，简化操作，大大缩短检测耗时，对非小细胞肺癌个性化治疗具有指导意义。表2试剂盒组成试剂盒所需引物、探针序列如表3：表3引物、探针及序列号优选地，引物及探针序列长度为18-30个碱基；融合基因引物跨融合区域序列；gc含量为40-60％，扩增序列长度为100-350bp；tm值控制在50-60℃。优选地，所述荧光基团为fam、hex、ned、rox、tet、joe、tamra、cy3、cy5中的任意一种或组合多种，优选为fam荧光基团。优选地，所述淬灭基团选自mgb、bhq-1、bhq-2、bhq-3等任意一种或组合多种，优选为mgb淬灭基团。对特异性引物及探针经大量试验筛选，选出其中11条序列(包括引物和探针)，并对其进行组合、优化、验证，最终优选出组合后不会互相干扰、扩增效率高、特异性好的多重检测最优引探组合。本发明中，设计了共用上游、下游引物或探针，在识别多个突变位点的同时使用最少引物探针，节约成本。上述序列组合包含肺癌多重基因突变区域检测所需引物和探针，能够一次性完成6种ros1基因融合的检测。本试剂盒另一方面提供一种用于检测肺癌ros1基因融合的引物探针、反应体系、质控品：表4试剂盒其他组分优选地，buffer的组成为0.5-2mol/ltris-clph8.8、0.5-3mol/lkcl、0.1-1mol/l(nh4)2so4、0.5-2mol/lmgcl2，10-20％tween-20，最优选为1mol/ltris-clph8.8、1mol/lkcl、0.5mol/l(nh4)2so4、1mol/lmgcl2、20％tween-20。优选地，rna酶系的组成为逆转录酶2-40u/μl、热启动酶5-40u/μl、rna酶抑制剂0.1-1μl、dntps5-25mm，最优选为逆转录酶20u/μl、热启动酶15u/μl、rna酶抑制剂0.5μl、dntps15mm。本发明所述试剂盒用于判定检测有效标准为：每次检测均同时检测阴性质控品、阳性质控品，当检测结果的阳性质控品为阳性，且阴性质控品为阴性时，表明实验结果有效。本发明所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：(1)提取检测样本中的总核酸，包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织等样本中2-100ng/μl的总核酸。。(2)将酶系加入pcr反应管中，依次加入阴性质控品、检测样本核酸、阳性质控品。(3)实时荧光pcr反应，程序如下：第一阶段：50℃2-15min，95℃10-15min，1个循环；第二阶段：94℃10-15s，55-60℃45s，45个循环；根据实时荧光pcr扩增仪显示的阳性质控品信号最高荧光值1/20作为阈值线，结合ct值及荧光曲线判断检测结果。优选地，仅根据ct及荧光曲线判断检测结果，简化判定方法。本发明的有益效果在于：(1)本发明适用于新鲜组织、石蜡包埋组织等多种样本类型，并采用总核酸作为检测样本，更加简便快捷，易于操作。(2)试剂采用预分装单管单人份，操作简单，直接添加酶系和样本便可进行检测。(3)采用特异性引物和新型探针技术，通过双荧光通道检测模式，设定内控基因检测vic信号，可以在检测融合突变的同时监控样本核酸质量，提高判定准确性。(4)设计共用的下游引物和探针，使得识别同样多的突变位点的同时，减少引物、探针的数量，有效节约成本。(7)同时检测6种ros1融合基因突变，且仅需110分钟即可完成，易于操作的同时有效缩短检测时长。(8)特异性强，100ng/μl野生型核酸不会产生非特异性信号。(9)灵敏度高，可以检出100ng/μl中10拷贝/μl的融合基因。(10)判定方法简便，根据实时荧光pcr扩增仪显示的阳性质控品最高荧光值1/20作为阈值线，结合ct值及荧光曲线判断检测结果，易于理解，易于判定。本发明适用于肿瘤患者6个ros1融合基因突变位点的检测，是探索非小细胞肺癌高效治疗的一条可行途径，值得推广应用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在新药研发过程中，使用本发明的检测方法获得用作中间结果的基因突变信息，这些基因突变信息可以作为公众健康管理之需，也可以用于ros1融合基因突变的研究及靶向新药研发。下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。实施例1本发明提出一种肺癌多重基因融合检测的方法、引物、探针及试剂盒。具体实施步骤如下：(1)待测样本核酸模板提取中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20170666号)，按照试剂盒说明书进行核酸提取。组织样本提取后的核酸稀释为浓度2-100ng/μl，纯度应满足a260/a280比值范围在1.7-2.3之间。模板可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。(2)加样取rna酶系3μl加入pcr反应管中。瞬时离心15s。分别取5μl阴性质控品、步骤1制备样本核酸模板、阳性质控品，按照表5顺序，依次加入到反应管中。盖紧pcr反应管管盖，充分混匀，瞬时离心10s。表5荧光pcr加样布局编号abcdefgh1阴控样本1样本2样本3样本4样本5样本6阳控注：阴控为阴性质控品；阳控为阳性质控品(3)实时荧光pcr扩增：设置实时荧光pcr扩增仪同时检测fam信号和vic信号。实时荧光pcr反应程序如下：第一阶段：50℃2-15min，95℃10-15min，1个循环；第二阶段：94℃10-15s，55-60℃45s，45个循环；本发明所述试剂盒判定检测有效标准为：每次检测均同时检测阴性质控品、阳性质控品，当检测结果的阳性质控品为阳性，且阴性质控品为阴性时，表明实验结果有效。每管vic通道有明显荧光扩增曲线，且以阳性质控品vic信号最高荧光值1/20作为阈值线，ct值小于38，表明核酸模板质量良好。根据实时荧光pcr扩增仪显示的阳性质控品fam信号最高荧光值1/20作为阈值线，调整baselinestartcycle3，endcycle15，并结合ct值和荧光曲线判断结果：a.ct值小于37，且有明显荧光扩增曲线，则判断为阳性；b.ct值大于等于37，或无明显荧光扩增曲线，则判断为阴性。本实施例提供的多重ros1融合基因检测试剂盒的组成成分、包装如表6：表6试剂盒的组成成分、包装及数量实施例2灵敏度及准确性检测总核酸浓度100ng/μl的灵敏度参考品由检测基因位点质粒或细胞株，与野生型细胞株核酸分别按一定比例混合，100ng/μl混合液中含有10拷贝/μl融合基因。(1)加样取rna酶系3μl加入pcr反应管中。瞬时离心15s。分别取5μl阴性质控品、灵敏度参考品(100ng/μl总核酸中含有10拷贝/μl融合基因)、阳性质控品，按照表5顺序，依次加入到反应管中。盖紧pcr反应管管盖，充分混匀，瞬时离心10s。每种灵敏度参考品，5个重复试验。(2)实时荧光pcr扩增：设置实时荧光pcr扩增仪同时检测fam信号和vic信号。实时荧光pcr反应程序如下：第一阶段：50℃2-15min，95℃10-15min，1个循环；第二阶段：94℃10-15s，55-60℃45s，45个循环；检测结果的判断：a.每管vic通道有明显荧光扩增曲线，且以阳性质控品vic信号最高荧光值1/20作为阈值线，ct值小于38，表明核酸模板质量良好。b.根据实时荧光pcr扩增仪显示的阳性质控品fam信号最高荧光值1/20作为阈值线，调整baselinestartcycle3，endcycle15，并结合ct值和荧光曲线判断结果。五次检测结果符合率100％。检测结果表明，本发明的检测体系可以一次性准确检测核酸浓度100ng/μl中的10拷贝/μl的融合基因突变。实施例3临床样本检测检测样本核酸的提取：(1)临床待测样本核酸模板提取采集100例临床阴性样本，将已知slc34a2-ros1(slc34a2exon4；ros1exon32)、slc34a2-ros1(slc34a2exon4；ros1exon34)、sdc4-ros1(sdc4exon2；ros1exon32)、ezr-ros1(ezrexon10；ros1exon34)、cd74-ros1(cd74exon6；ros1exon32)、cd74-ros1(cd74exon6；ros1exon34)突变的临床样本随机混入其中，中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取或纯化试剂(组织样本可使用粤穗械备20170666号)，按照试剂盒说明书进行核酸提取，组织样本提取后的核酸稀释为浓度2-100ng/μl，纯度应满足a260/a280比值范围在1.7-2.3之间。模板可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。(2)加样取rna酶系3μl依次加入pcr反应管中。瞬时离心15s。分别取5μl阴性质控品、步骤1制备样本核酸模板、阳性质控品，按照表5顺序，依次加入到反应管中。盖紧pcr反应管管盖，充分混匀，瞬时离心10s。(3)实时荧光pcr扩增设置实时荧光pcr扩增仪同时检测fam信号和vic信号。实时荧光pcr反应程序如下：第一阶段：50℃2-15min，95℃10-15min，1个循环；第二阶段：94℃10-15s，55-60℃45s，45个循环；本发明所述试剂盒判定检测有效标准为：每次检测均同时检测阴性质控品、阳性质控品，当检测结果的阳性质控品为阳性，且阴性质控品为阴性时，表明实验结果有效。每管vic通道有明显荧光扩增曲线，且以阳性质控品vic信号最高荧光值1/20作为阈值线，ct值小于38，表明核酸模板质量良好。根据实时荧光pcr扩增仪显示的阳性质控品fam信号最高荧光值1/20作为阈值线，调整baselinestartcycle3，endcycle15，并结合ct值和荧光曲线判断结果：在所检测的106例的临床样本中(含6例已知ros1融合基因突变的临床样本)，共检出6例突变，典型阳性示例如图2-3所示。结果表明本发明检测体系的符合率达到了100％，进一步证明了本发明体系检测的准确性。本发明取材便捷、高特异性、高灵敏度、准确性高，可满足肺癌基因的快速检测。对比例1本发明人在研究过程中，针对各突变位点目标序列筛选了数十对pcr共用引物。这些引物出现特异性差、扩增效率低等问题。经过多轮筛选，最终筛选出灵敏度和特异性能够满足临床检测需求的引物、探针组合。例如，针对本发明的6个ros1融合基因突变位点，本发明人设计的部分典型引物序列如下：对照共用下游引物1：catgtgcaaacactactg(seqidno.:12)；sdc4exon2-ros1exon32；slc34a2exon4-ros1exon32；cd74exon6-ros1exon32公用。对照共用下游引物2：aatgtcatcttccacctt(seqidno.:13)；sdc4exon2-ros1exon32；slc34a2exon4-ros1exon32；cd74exon6-ros1exon32公用。对照共用下游引物3：tcttcagctttctcccactg(seqidno.:14)；sdc4exon2-ros1exon32；slc34a2exon4-ros1exon32；cd74exon6-ros1exon32公用。具体检测步骤、检测条件、探针序列同以上实施例，分别使用各引物对单独检测测试。使用对照共用下游引物1的检测结果如图4所示，检测结果表明该引物对特异性较差。对照共用下游引物2、3的灵敏度和特异性能够满足检测需求，检测结果如图5、6所示。对比例2本发明人在研究过程中，针对多重检测体系进行了反复优化和测试。例如，将包含上述对照共用下游引物2的引探对集，与针对其他位点检测的引探对集再组合，进行多重pcr扩增。结果表明，在该多重检测体系中，无法正常检测出sdc4exon2-ros1exon32融合基因突变位点，结果如图7所示。再如，将包含上述对照共用下游引物3的引探对集，与针对其他位点检测的引探对集再组合，进行多重pcr扩增。结果表明，在该多重检测体系中，因ros1融合基因共用较多上游、下游引物及探针，在多重pcr体系检测高浓度总核酸时，部分位点出现二次扩增现象，结果如图8所示。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>中山大学达安基因股份有限公司<120>多重检测ros1融合基因突变的试剂盒及方法<130>000053<160>14<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gagccctaccagacgat17<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ttacttctcggatttctctact22<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3caccattggctcctgtt17<210>4<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4agttgatgctgcggct16<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gctttctcccactgtattg19<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cactgtcaccccttcctt18<210>7<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7taaaccaggcattccca17<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tctggttgttacaatcccac20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ctttccgtaccagccactac20<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ggtggttcttgtccctacg19<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tgtgaccgctatgggattgt20<210>12<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12catgtgcaaacactactg18<210>13<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13aatgtcatcttccacctt18<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14tcttcagctttctcccactg20当前第1页12