本申请涉及微生物
技术领域：
，具体的，涉及一种木霉菌、微生物菌剂及其应用。
背景技术：
：根腐病是一种真菌引起的病，该病会造成根部腐烂，吸收水分和养分的功能逐渐减弱，最后全株死亡，主要表现为整株叶片发黄、枯萎。发病时间一般多在3月下旬至4月上旬，5月进入发病盛期。主要危害幼苗，成株期也能发病。发病初期，仅仅是个别支根和须根感病，并逐渐向主根扩展，主根感病后，早期植株不表现症状，后随着根部腐烂程度的加剧，吸收水分和养分的功能逐渐减弱，地上部分因养分供不应求，新叶首先发黄，在中午前后光照强、蒸发量大时，植株上部叶片才出现萎蔫，但夜间又能恢复。病情严重时，萎蔫状况夜间也不能再恢复，整株叶片发黄、枯萎。此时，根皮变褐，并与髓部分离，最后全株死亡。根腐病属于典型的土传病害，防治难度大，而且目前还没发现有效的防治方法，利用微生物及其代谢产物等生物农药进行病害防治，筛选对人体以及生态环境无危害的生防菌剂，逐渐替代一些化学试剂已成为植物病害的主要发展方向。技术实现要素：本公开的目的在于提供一种对根腐病安全有效的菌株和生防菌剂。为了实现上述目的，本公开一方面提供了一种芽孢杆菌nanm1s-1，该芽孢杆菌分类命名为芽孢杆菌(bacillussp.)，并且，该芽孢杆菌的保藏编号为cgmccno.19083。可选地，所述芽孢杆菌为苜蓿内生菌。另一方面，本公开提供了一种微生物菌剂，含有菌体和培养基，所述菌体含有保藏编号为cgmccno.19083的芽孢杆菌。可选地，每克所述微生物菌剂中，保藏编号为cgmccno.19083的芽孢杆菌的活菌数为108-1011cfu。可选地，所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤培养基或lb培养基，或者为他们中两者或三者的组合。可选地，所述微生物菌剂为粉剂或溶液剂。再一方面，本公开提供了上述微生物菌剂在防治植物根腐病中的应用。可选地，所述植物为苜蓿。通过上述技术方案，本公开提供了一种芽孢杆菌cgmccno.19083和一种微生物菌剂及其在防治根腐病中的应用，该芽孢杆菌为苜蓿内生菌，可以有效增强植物的免疫性，与植物互惠共存，同时对人畜安全无毒，对病害的特异性强，符合农业可持续发展的需要。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。生物材料保藏本公开的芽孢杆菌是本公开的发明人从苜蓿茎部中分离的纯培养物，其保藏编号为cgmccno.19083，保藏日期为2019年12月5日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为芽孢杆菌(bacillussp.)。具体实施方式以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开一方面提供了一种芽孢杆菌，该芽孢杆菌分类命名为芽孢杆菌(bacillussp.)，并且，该芽孢杆菌的保藏编号为cgmccno.19083。该芽孢杆菌为本公开的发明人从苜蓿根部样品中分离培养出一种新的菌种，经鉴定该菌属于芽孢杆菌(bacillussp.)。该菌种已在国家知识产权局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2019年12月5日，保藏编号为cgmccno.19083。本公开的芽孢杆菌可以在常规的细菌培养基中存活并生长繁殖。本公开的芽孢杆菌是一株苜蓿内生菌，并在防治苜蓿根腐病方面具有突出的效果。另一方面，本公开提供了一种微生物菌剂，含有菌体和培养基，所述菌体含有保藏编号为cgmccno.19083的芽孢杆菌。其中，微生物菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，例如每克微生物菌剂中，保藏编号为cgmccno.19083的芽孢杆菌的活菌数可以为108-1011cfu，优选情况下，每克微生物菌剂中，保藏编号为cgmccno.19083的芽孢杆菌的活菌数可以为109-1010cfu。根据本公开，所述培养基的种类可以为各种能够用于芽孢杆菌的培养基，例如，可以为牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基、lb培养基等常用培养基作为种子培养基，用于菌种的保存；而发酵的培养基一般用于生产，这些培养基的种类也为本领域技术人员所公知。上述培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”(microbiologyculturemediamanual)的记载制备得到。例如，种子培养基可以为牛肉膏蛋白胨培养基，其含有1-3g/l的牛肉膏、5-15g/l的蛋白胨、3-8g/l的氯化钠和15-20g/l的琼脂。例如发酵培养基可以含有：40-150g/l的淀粉、0.5-8g/l的氯化钠、0.5-5g/l的碳酸钙、2-10g/l的磷酸二氢钾和1-10g/l的氯化亚铁。其中，上述各种培养基可以按照常规的灭菌方法进行灭菌后备用，例如在115-125℃和1.5-2个标准大气压的条件下灭菌10-30分钟。其中，芽孢杆菌的培养方法没有特别的限制，例如，可以先将芽孢杆菌在种子培养基(lb培养基)中培养至菌密度od600值为0.6-0.8，得到菌液，然后在100重量份培养基(葡萄糖15g，淀粉1g，豆饼粉25g，硫酸锰1g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.5g，酵母膏0.2g，氯化铁0.1g，碳酸钙0.1g，ph7.0-7.2)中接种2-5重量份的芽孢杆菌的菌液，30℃培养，直至芽孢杆菌的活菌数为(2-20)*107个/克的培养基。优选情况下，通过培养使得到的每克所述微生物菌剂中，保藏编号为cgmccno.19083的芽孢杆菌的活菌数可以为107-1011cfu，更优选为109-1010cfu。在培养的过程中，可以通过常规的方法，例如血球板计数法或od值观察法得到活菌的浓度。培养后的菌液可以直接作为微生物菌剂使用，优选情况下，菌液通过包括无菌过滤、冷冻干燥等步骤进一步加工为更方便贮藏的剂型的微生物菌剂使用。其中，菌种的培养条件没有特别的限制，可以为芽孢杆菌培养过程中常用条件，例如采用摇床震荡培养，培养温度可以为30℃-37℃，培养时间可以为1-3天。优选地，所述微生物菌剂的制备方法还可以包括：将在发酵培养基中进行培养后得到的物料与惰性固体载体和粘结剂混合；所述惰性固体载体包括粘土、二氧化硅、硅藻土、高岭土、凹凸棒土、蒙脱土、膨润土、滑石粉、白碳黑和碳酸钙中的至少一种；所述粘结剂包括麦芽糖和/或糊精。优选地，惰性固体载体和粘结剂的用量使得所述微生物菌剂中，惰性固体载体的含量为30-90重量％；所述粘结剂的含量为5-20重量％。其中，混合后的物料可以进一步干燥制粒为颗粒剂。再一方面，本公开提供了上述微生物菌剂在防治植物根腐病中的应用。其中，通过向植物生长的土壤中施用如上所述的芽孢杆菌和如上所述的微生物菌剂，能够有效地增加植物的抗病性。其中，所述植物为苜蓿。以下结合实施例进一步详细说明本发明，但是本发明的范围并不限制于以下实施例中。实施例1采集健康未染病的苜蓿植株，对苜蓿植株的根部经过酒精浸泡，次氯酸钠浸泡、无菌水浸泡后，加入无菌水进行研磨，混合均匀制成悬浮液。将悬浮液稀释后涂布与lb平板，30℃下培养24h，分离得到芽孢杆菌cgmccno.19083。将芽孢杆菌cgmccno.19083接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃、180rpm摇床振荡培养12h，制成种子液。将100ml上述种子液加入100l发酵培养基中，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的芽孢杆菌的活菌数为1010cfu，所得到的培养液即为本实施例的微生物菌剂。实施例2将实施例1得到的芽孢杆菌cgmccno.19083接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃、180rpm摇床振荡培养12h，制成种子液。将100ml上述种子液加入100l发酵培养基中，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的芽孢杆菌的活菌数为1010cfu，然后使用硅藻土对发酵液进行吸附、离心或板框过滤、干燥，形成可湿性粉剂，所得到的可湿性粉剂即为本实施例的微生物菌剂。对比例1将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号cgmccno.11220的木霉菌从保藏斜面接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(pda)中，25℃培养箱培养7天，从中取3-4个菌块加入种子瓶。25℃、180rpm摇床上振荡培养48h，制成种子液。将种子液按1:150体积比加入种子发酵罐进行培养，然后按照1:20的体积比加入到厚垣孢子发酵培养基的发酵罐，28℃培养132小时，至90％菌丝都形成厚垣孢子，通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的木霉菌的活菌数为1010cfu。对比例2将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号cgmccno.8995的枯草芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃、180rpm摇床振荡培养12h，制成种子液。将100ml上述种子液加入100l发酵培养基中，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的芽孢杆菌的活菌数为1010cfu。对比例3将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号cgmccno.11220的木霉菌从保藏斜面接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(pda)中，25℃培养箱培养7天，从中取3-4个菌块加入种子瓶。25℃、180rpm摇床上振荡培养48h，制成种子液。将种子液按1:150体积比加入种子发酵罐进行培养，然后按照1:20的体积比加入到厚垣孢子发酵培养基的发酵罐，28℃培养132小时，至90％菌丝都形成厚垣孢子，得到厚垣孢子发酵液；然后使用硅藻土对发酵液进行吸附、离心或板框过滤、干燥，形成可湿性粉剂，直至木霉菌的活菌数为1010cfu/g，所得到的可湿性粉剂即为本对比例的微生物菌剂。对比例4将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号cgmccno.8995的枯草芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃、180rpm摇床振荡培养12h，制成种子液。将100ml上述种子液加入100l发酵培养基中，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的芽孢杆菌的活菌数为1010cfu，然后使用硅藻土对发酵液进行吸附、离心或板框过滤、干燥，形成可湿性粉剂，所得到的可湿性粉剂即为本实施例的微生物菌剂。对比例5购自山东麦肯生物科技有限公司的根腐宁-喜萃。测试例1本测试例使用的苜蓿根腐病常见致病菌为：腐皮镰孢霉(f.solani)和尖孢镰孢霉(f.oxysporum)。将过夜培养的腐皮镰孢霉(f.solani)菌液和尖孢镰孢霉(f.oxysporum)菌液菌液与营养琼脂培养基(含1.5％琼脂，w/v)混匀，将各菌液浓度稀释至2×107cfu/ml左右，取5ml倾注于制备好的营养琼脂平板中。将牛津杯用镊子轻轻放置于接种不同菌株的平板上，分别将200μl实施例1、对比例1和对比例2中溶液剂加入牛津杯后静置30min，于30℃培养16h，用游标卡尺测量测量其对腐皮镰孢霉(f.solani)和尖孢镰孢霉(f.oxysporum)的抑菌圈大小，如表1所示。表1抑菌圈-腐皮镰孢霉(mm)抑菌圈-尖孢镰孢霉(mm)实施例123.425.6对比例115.816.7对比例218.617.3由表1可以看出，本公开的保藏编号为cgmccno.19083的芽孢杆菌对苜蓿根腐病常见致病菌腐皮镰孢霉(f.solani)和尖孢镰孢霉(f.oxysporum)的抑制作用显著好于对比例1中的保藏编号为cgmccno.11220的木霉菌和对比例2中的保藏编号为cgmccno.8995的枯草芽孢杆菌。测试例2本测试实施在田间试验中测定本发明的微生物菌剂在防治苜蓿根腐病中的效果。试验田位于河北省廊坊市中国农业科学院试验基地，将死于根腐病的苜蓿植株的组织捣碎，用等重量的水浸泡48小时，过滤得到含有根腐病致病菌的浸种液。将紫花苜蓿(中苜1号，由国家种植牧草中期库提供，产品目录号为00068)种子浸泡于上述含有根腐病致病菌的浸种液中24小时，浸种液的用量足以淹没紫花苜蓿种子，得到浸泡后的种子。将浸泡后的苜蓿种子播种于农田中，播种10天后在不同种植区内施用实施例1-2和对比例1-5的微生物菌剂作为实验组，其中，实施例1和对比例1-4的微生物菌剂拌入各种植区泥土中，施用量为0.2kg/m2；对比例5中的市售根腐宁按照使用说明书用量将原液稀释500倍后进行喷施，施用量为1.5g/m2(原液)。并且使用未处理的种植区作为空白对照组。田间管理常规。生长40天后调查苜蓿根腐病发病情况。苜蓿根腐病病情分为5个级别，免疫(0级)：病指0；抗病(1级)：病指0.1-20.0；耐病(2级)：病指20.1-40.0；感病(3级)：病指40.1-60.0；高感(4级)：病指60.0以上或完全腐烂。病情指数＝∑(发病级别代表值×该级的株数)/(发病最重级别代表值×总株数)×100；防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％。结果如表2所示。表2处理病情指数防治效果(％)对照40.510.7实施例110.456.4实施例212.850.3对比例129.420.6对比例227.532.4对比例324.735.9对比例434.118.7对比例532.515.8通过表2数据可见实施例1和实施例2对于苜蓿根腐病的防治效果可以高达56.4％，显著高于各对比例，因此使用本公开的cgmccno.19083的芽孢杆菌制得的菌剂可以有效防治苜蓿根腐病。以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。当前第1页1 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