一种帕氏乳杆菌厌氧发酵剂及其应用的制作方法

本发明属于生物发酵饲料领域，具体涉及一种帕氏乳杆菌厌氧发酵剂及其应用。

背景技术：

近年来，饲料投喂前的发酵预处理，已经成为发展趋势，主要的目的就是去除饲料原料中的抗营养因子，并提高发酵后饲料在动物体内的的消化率，最终获得更好的养殖投资回报率。

应用于饲料发酵的微生物菌种主要分为四种：乳酸菌、芽孢菌、酵母菌和丝状真菌。芽孢菌为好氧菌，在厌氧发酵中无法发挥作用，且好氧发酵中应用芽孢菌，经常无法解决蛋白型发酵带来的臭味问题和蛋白损耗问题，且物料会因蛋白酶的过多分泌而引起物料法黏。酵母菌是较好的发酵菌种，但在厌氧发酵中，兼性厌氧的酵母菌很难发挥较好的作用，且无法实现菌量大幅增殖，应用成本偏高，也会带来损耗较大的问题；此外酵母在发酵后期，会将物料中的有机酸消耗掉，引起发酵料ph后期迅速升高，由此会引发霉菌抑制能力减弱等各种问题。丝状真菌中仅米曲霉和黑曲霉属于饲料添加剂菌株目录，而两种菌均以好氧发酵为主，而好氧发酵会带来损耗较大、产能较低、污染较难控制等各种问题。乳酸菌与其他菌相比，可迅速产酸，降低体系ph，抑制霉菌等杂菌生长，减少原料中毒素累积；还可将乳酸、乳酸菌素等益生性代谢物应用于动物试验中；还可通过利用糖而降低不良寡糖，从而去除豆粕中的不良寡糖等胀气抗营养因子。

发酵剂的应用与菌株的选择密切相关，菌株具备的特性越多，越可简化发酵剂制备的步骤，且可扩大应用的范围。而目前，一种功能多样，并且可以在厌氧环境中发挥作用的发酵剂对于动物养殖来说非常的重要。

技术实现要素：

本发明提供了一种帕氏乳杆菌厌氧发酵剂及其应用，该帕氏乳杆菌厌氧发酵剂采用具备降寡糖产乳酸抑病菌等多种特性的帕氏乳杆菌gbw-hb1903，经由多级发酵、冷冻干燥制成菌粉后，与缓释型复合载体复合形成的，可以在动物养殖中减少动物胀气、腹泻的问题，并提升动物的生长性能。

为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：

本发明提供了一种帕氏乳杆菌厌氧发酵剂，其包括帕氏乳杆菌菌粉和缓释型复合载体；所述帕氏乳杆菌菌粉中包括含菌量为40×10⁸cfu/g～42×10⁸cfu/g的帕氏乳杆菌。

进一步的，所述帕氏乳杆菌菌粉与缓释型复合载体的质量比为1∶52～54。

进一步的，所述帕氏乳杆菌选用保藏编号为cgmccno.18391的帕氏乳杆菌gbw-hb1903。

进一步的，所述缓释型复合载体包括柠檬酸钠和乳糖粉，所述柠檬酸钠和乳糖粉的质量比为1∶2～3。

进一步的，所述帕氏乳杆菌菌粉的制备包括以下步骤：

(1)菌株活化：帕氏乳杆菌gbw-hb1903经活化培养后得到一级菌苔种子；

(2)种子罐培养：将步骤(1)的一级菌苔种子接种到灭菌种子罐中培养后，得到二级种子培养液；培养条件为保持罐压0.05～0.06mpa，转速85～90rpm，通风量2.0～2.2m³/h，36～38℃培养4～5h；

(3)发酵罐培养：将步骤(2)的二级种子培养液转接到发酵生产罐中进行发酵培养后得到发酵液；培养条件为保持罐压0.05～0.06mpa，转速0～10h为100～110rpm、10～16h为120～130rpm，通风量0～10h为165～170m³/h、10～16h为215～220m³/h，36～38℃培养15～17h，当生产罐中的发酵液的ph保持稳定时停罐；

(4)冷冻干燥：将步骤(3)的发酵液移至离心罐内离心收集沉淀，得到菌泥；在菌泥中加入冻干保护剂后冷冻干燥，得到帕氏乳杆菌冻干菌粉；培养条件为

(5)筛分：将步骤(4)的帕氏乳杆菌冻干菌粉80～100目过筛后得到所述的帕氏乳杆菌菌粉。

进一步的，所述步骤(4)中冻干保护剂包括乳清粉、低聚木糖和海藻糖；冷冻干燥的温度为-35～-30℃，时间为130～140min。

本发明还提供了所述的帕氏乳杆菌厌氧发酵剂在制备用于动物养殖的饲料添加剂中的应用。

进一步的，所述帕氏乳杆菌厌氧发酵剂的添加量为饲料总质量的0.1～0.3％。

进一步的，所述帕氏乳杆菌厌氧发酵剂具有能够明显降低饲料的ph和增加l-乳酸含量的功能。

进一步的，所述帕氏乳杆菌厌氧发酵剂具有能够明显降解不良寡糖、粗纤维和毒素功能。

进一步的，所述帕氏乳杆菌厌氧发酵剂具有明显降低动物胀气率和腹泻率的功能。

进一步的，所述的动物包括家禽动物和家畜动物。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：

1、本发明所述的帕氏乳杆菌厌氧发酵剂中采用了自主筛选保藏的帕氏乳杆菌gbw-hb1903，该菌是从市政生活污水中分离出来的乳酸菌菌株，具有降解不良寡糖、产乳酸、降低ph、抑制大肠杆菌、副溶血弧菌、横梗霉等多种特性，应用于厌氧发酵中对豆粕、麸皮等原料进行处理，能够快速产酸降ph，降低不良寡糖、黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮等抗营养因子，进而促进动物对饲料中营养的吸收，由此提升动物的生长性能。

2、本发明所述的帕氏乳杆菌厌氧发酵剂采用缓释型复合载体，在节约成本的同时，兼顾帕氏乳杆菌gbw-hb1903的留存率与稳定性，在4℃存放12个月后菌量留存率仍达72.1％。使用本发明的帕氏乳杆菌厌氧发酵剂制备的饲料，ph低、l-乳酸含量高，并且完全去除了其中所含的不良寡糖，降低毒素和最小抑菌浓度mic，在应用于乳仔猪和肉鸡养殖中，能够显著增加欧洲指数、降低异/总vfa比例和腹泻率，起到了减少动物胀气、降低腹泻、提升动物生长性能的作用，进而提高机体免疫力，降低疾病发生，促进动物生长，提高经济效益。

3、本发明所述的帕氏乳杆菌厌氧发酵剂的制备方法简单、合理，操作快捷，具有良好的工业化实施前景。

附图说明

图1为所述帕氏乳杆菌gbw-hb1903在mrs平板上的菌落形态特征。

图2为26种乳酸菌发酵豆粕48h的ph降低能力比较结果。

图3为4种乳酸菌发酵豆粕48h-不良寡糖降解能力比较结果，其中a为蔗糖，b为棉籽糖，c为水苏糖；1为植物乳杆菌hfp9发酵豆粕、2为鼠李糖乳杆菌bj5发酵豆粕、3为帕氏乳杆菌gbw-hb1903发酵豆粕、4为卷曲乳杆菌xz2发酵豆粕、5为豆粕。

图4为4种乳酸菌在豆粕浸液平板上培养48h-产乳酸能力比较结果，其中1为植物乳杆菌hfp9、2为鼠李糖乳杆菌bj5、3为帕氏乳杆菌gbw-hb1903、4为卷曲乳杆菌xz2。

图5为4种乳酸菌对e.colidh5α靶标菌的抑菌能力比较结果，其中1为植物乳杆菌hfp9、2为鼠李糖乳杆菌bj5、3为帕氏乳杆菌gbw-hb1903、4为卷曲乳杆菌xz2；ck为水。

图6为4种乳酸菌对副溶血弧菌lbt1靶标菌的抑菌能力比较结果，其中1为植物乳杆菌hfp9、2为鼠李糖乳杆菌bj5、3为帕氏乳杆菌gbw-hb1903、4为卷曲乳杆菌xz2；ck为水。

图7为2种乳酸菌对横梗霉hgm1靶标菌的抑菌能力比较结果，其中1为hgm1+鼠李糖乳杆菌bj5，2为hgm1+不接乳酸菌，3为hgm1+帕氏乳杆菌gbw-hb1903。

图8为所述帕氏乳杆菌gbw-hb1903菌粉的生产工艺流程。

图9为帕氏乳杆菌发厌氧酵剂发酵豆粕的不良寡糖定性测定结果，其中其中a为蔗糖，b为棉籽糖，c为水苏糖；1为豆粕，2为帕氏乳杆菌gbw-hb1903发酵豆粕，3为帕氏乳杆菌gbw-hb1903发酵豆粕重复组。

图10为帕氏乳杆菌厌氧发酵剂发酵豆粕的不良寡糖定量测定结果，其中三个色谱峰分别标注：a为蔗糖，b为棉籽糖，c为水苏糖；1为豆粕，2为帕氏乳杆菌gbw-hb1903发酵豆粕；y轴为hplc不良寡糖峰面积。

图11为帕氏乳杆菌厌氧发酵剂发酵豆粕的l-乳酸定量测定结果，其中a：豆粕；b：帕氏乳杆菌gbw-hb1903发酵豆粕；y轴为hplcl-乳酸峰面积。

图12为帕氏乳杆菌厌氧发酵剂发酵麸皮的mic定量测定结果，其中a：麸皮；b：发酵麸皮ph＝3.93；c：发酵麸皮ph＝7；1为不接种对照；2为接种大肠杆菌e.colidh5α。

具体实施方式

结合以下具体实例对本发明作进一步详细说明。

实施例1：帕氏乳杆菌gbw-hb1903的筛选鉴定与特性研究

一、帕氏乳杆菌gbw-hb1903的分离、筛选

1、以市政生活污水为样品，梯度稀释后采用含碳酸钙mrs培养基倾注培养筛选“溶钙圈”明显的菌落，多次纯化后得到单菌落，命名为gbw-hb1903，保存。如图1所示，所述菌株gbw-hb1903在mrs平板上的菌落为圆形，乳白色，直径1-2μm，表面光滑湿润有光泽，中间略凸起，不透明，边缘整齐，无晕环。菌株gbw-hb1903在10～45℃温度范围内均能正常生长繁殖，而其最适生长温度为25～35℃；在ph值6～9的范围内均能生长，最适生长ph值为6.5～7.5；在溶氧含量小于0.5mg/l或大于1.0mg/l范围内都能正常生长，最适宜的溶氧量为2-3mg/l，且菌株gbw-hb1903属于兼性厌氧菌；菌株gbw-hb1903能够产生尿素酶、β-葡萄糖苷酶和甘油，能够降解或分解动力-硝酸盐、西蒙式枸橼酸盐和半固体琼脂。

2、帕氏乳杆菌gbw-hb1903的16srrna序列测定

以所述菌株gbw-hb1903的dna为模板，16srrna通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定。gbw-hb1903的16srdna测序结果与genbank中的序列进行比对分析，结果显示，菌株gbw-hb1903与lactobacillusparafarraginis同源性最高，因此确定该菌株gbw-hb1903为帕氏乳杆菌。

将筛选到的菌株gbw-hb1903进行菌种保藏，所述帕氏乳杆菌gbw-hb1903的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年08月16日；帕氏乳杆菌lactobacillusparafarraginis的保藏编号为cgmccno.18391。

帕氏乳杆菌gbw-hb1903的16srdna序列如seqidno.1所示。

二、帕氏乳杆菌gbw-hb1903降低豆粕ph的特性

选用mrs液体培养基，分别对25株乳酸菌与帕氏乳杆菌gbw-hb1903进行培养，并以水做参比，测定24h各个菌液在600nm时的od值，并以灭菌空白的mrs液体培养基将各乳酸菌菌液的od值调至一致，确定各个菌株的生长情况。分别取26种乳酸菌菌液1ml与399ml无菌水混合后，接种于1000kg豆粕中，混合均匀后放于密锡箔封袋内，采用fr-900型全自动封口机封口，于37℃发酵48h后测定发酵豆粕湿料的ph。测定ph时，取10.0g样品，加50ml蒸馏水，搅拌混匀后静置15min，应用phs-3cph计测定所测样品的ph。

26种乳酸菌发酵豆粕48h-ph降低能力的比较结果如图2所示，仅有植物乳杆菌hfp9、鼠李糖乳杆菌bj5、帕氏乳杆菌gbw-hb1903、卷曲乳杆菌xz2四株菌的发酵豆粕ph低于5，其中菌株gbw-hb1903的ph最低，说明该菌具有较高的产酸能力，因而导致了豆粕ph由6.59下降至4.61，降幅较大。

三、帕氏乳杆菌gbw-hb1903降解豆粕不良寡糖的特性

选用mrs液体培养基，对植物乳杆菌hfp9、鼠李糖乳杆菌bj5、帕氏乳杆菌gbw-hb1903、卷曲乳杆菌xz2四株菌进行培养，并以水为参比，测定24h各个菌液在600nm时的od值，以灭菌空白mrs液体培养基将各乳酸菌菌液的od值调至一致。分别取4种乳酸菌菌液1ml与399ml无菌水混合后，接种于1000kg豆粕中，混合均匀后放于密锡箔封袋内，采用fr-900型全自动封口机封口，于37℃发酵48h，60℃烘干1h后粉碎待测样品。准确称取发酵豆粕样品5.0g于250ml三角瓶中，加入40.0ml80％的乙醇溶液，70℃水浴浸提1h以上；浸提液于10000rpm离心10min，取上清；在预制硅胶板上点样，点样量为4μl，点样干燥后在展开液中展开，展开至离硅胶板前沿约2cm处；通风橱内自然晾干后，显色液内浸泡5s，在140℃下烘至显色；其中展开液的配置为正丁醇∶乙酸∶水＝3∶1∶1(v/v/v)，显色液的配置为1-萘酚1g、磷酸50ml和乙醇450ml。对比硅胶层析板上，样品和标样的条带，直接判读发酵豆粕中寡糖的降解情况。结果判定方法如下：完全降解：-，大部分降解：+，少部分降解：++，没有降解：+++。

4种乳酸菌发酵豆粕48h-不良寡糖降解能力的比较结果如图3和表1所示，在4种乳酸菌中，帕氏乳杆菌gbw-hb1903降解不良寡糖的能力最强，在发酵48h后，该菌的发酵豆粕样品棉籽糖、水苏糖等不良寡糖被完全降解。而棉籽糖和水苏糖被认为是豆粕中的胀气因子，在动物肠道内若存在较多，则会引起幼龄动物的胀气，进而影响养分消化吸收与生长性能，有效的去除动物肠道内的不良寡糖，有利于动物的生长。

表1.4种乳酸菌发酵豆粕48h-不良寡糖降解能力比较

四、帕氏乳杆菌gbw-hb1903降低利用豆粕碳源产乳酸的特性

豆粕煮浸液培养基的配制为：60目棉粕粉600g中加入1000ml水，边加热边搅拌，煮沸30min后用8层纱布过滤，滤液补水至1000ml，再加入5g碳酸钙和20g琼脂粉，混合均匀后经过121℃30min灭菌，冷却后倾注至各无菌平板中。

选用mrs液体培养基，对植物乳杆菌hfp9、鼠李糖乳杆菌bj5、帕氏乳杆菌gbw-hb1903、卷曲乳杆菌xz2四株菌进行培养，并以水为参比，测定24h各个菌液在600nm时的od值，以灭菌空白mrs液体培养基将各乳酸菌菌液的od值调至一致。每组取菌液3ml，8000rpm离心3min，弃上清，沉淀加3ml水重悬，获得4种乳酸菌菌体悬液。将每个豆粕煮浸液培养基平板均被划分为4个区域，每个区域点接2μl菌体悬液，以水为对照。菌体利用培养基产酸，并与碳酸钙形成乳酸钙钙圈，其直径可表征不同乳酸菌的产酸能力，在37℃培养48h，测定乳酸钙圈直径与菌体直径，产酸能力比值＝产酸钙圈直径/菌体直径。

4种乳酸菌在豆粕煮浸液培养基上培养48h-产乳酸能力的比较结果如图4和表2所示，与其他3株乳酸菌相比，帕氏乳杆菌gbw-hb1903具有更强的产酸能力，产酸能力比值达2.86，说明该菌利用了豆粕中的碳水化合物并产生了乳酸等物质。

表2.4种乳酸菌在豆粕浸液平板上培养48h-产乳酸能力比较

五、帕氏乳杆菌gbw-hb1903抑制大肠杆菌与副溶血弧菌的特性

选用mrs液体培养基，植物乳杆菌hfp9、鼠李糖乳杆菌bj5、帕氏乳杆菌gbw-hb1903、卷曲乳杆菌xz2四株菌进行培养，并以水为参比，测定24h各个菌液在600nm时的od值，以灭菌空白mrs液体培养基将各乳酸菌菌液的od值调至一致。

在特定的平板上考察4株乳酸菌对两种病原细菌的抑制能力，其中两种靶标菌分别为e.colidh5α和副溶血弧菌lbt1。e.colidh5α源自潍坊医学院生命科学学院分子生物学实验室；副溶血弧菌lbt1源自黄岛某受弧菌感染的玉筋鱼养殖水体，经16srrna序列测定和blast比对，确定菌株lbt1的16s序列与vibrioparahaemolyticusstrainvp24具有99.73％相似，因此该菌为副溶血弧菌。

e.colidh5a采用lb培养基活化并进行平板抑菌试验，副溶血弧菌lbt1采用2216e培养基活化并进行平板抑菌试验，活化靶标菌菌液于4℃备用。lb培养基配方如下：胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、nacl10g，水1000ml，ph调至7.0；2216e培养基配方如下：酵母粉1.0g、蛋白胨5.0g、fepo40.1g，陈海水1000ml，ph至7.6-7.8；以上两种液体培养基中添加2％琼脂粉，混合灭菌后倾注平板，冷却备用。将靶标菌分别涂布于特定的平板上，并在每个靶标菌培养基上放置4个牛津杯，每杯接种100μl菌液，以水为对照。菌液可通过抑制靶标菌的生长，在牛津杯附近形成抑菌圈，可表征乳酸菌的抑菌能力，而抑细菌能力比值＝抑菌圈直径/菌体直径。

4种乳酸菌对e.colidh5α和副溶血弧菌lbt1两种靶标菌的抑菌能力的比较结果如图5-6和表3所示。与其他3株乳酸菌相比，帕氏乳杆菌gbw-hb1903具有更强的抑菌能力，该菌抑制大肠杆菌e.colidh5α的抑菌能力比值达2.56，抑制水产常见的弧菌副溶血弧菌lbt1的抑菌能力比值达2.83，说明该菌有较好的抑制细菌性病原菌的能力，推测是由于帕氏乳杆菌gbw-hb1903产生了乳酸、乳酸菌素等抑菌物质。

表3.4种乳酸菌对e.colidh5α和副溶血弧菌lbt1的抑菌能力比较

六、帕氏乳杆菌gbw-hb1903抑制霉菌的特性

选用mrs液体培养基，对鼠李糖乳杆菌bj5、帕氏乳杆菌gbw-hb1903两株菌进行培养，并以水为参比，测定24h各个菌液在600nm时的od值，以灭菌空白mrs液体培养基将各乳酸菌菌液的od值调至一致。

在特定的平板上考察2株乳酸菌对病原真菌的抑制能力，其中病原真菌靶标菌为横梗霉hgm1。hgm1源自广州某市售霉变发酵湿料样品，经18srrna序列测定和blast比对，确定该菌18ssrrna序列与lichfheimiaramosastrainca-a2具有99.9％相似，该菌为横梗霉。

横梗霉hgm1采用孟加拉红培养基于30℃培养5d，至菌丝长满平皿，并采用直径为6mm的打孔器打孔，获得直径均为6mm的真菌菌块。孟加拉红培养基配方如下：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、孟加拉红0.033g、氯霉素0.1g，水1000ml，ph调至7.0。采用mrs培养基进行抑菌试验：将1ml乳酸菌菌液分别加入灭菌后冷却至35℃左右的mrs固体培养基中，倾注平板，待平板冷却凝固后，在平板中央接种真菌菌块；对照组不加乳酸菌液，但同样接种真菌菌块，共同于30℃培养，第1天采取正置培养，第2～5天采取倒置培养。乳酸菌的存在可以抑制真菌的生长，真菌的生长直径相比于对照组减少，而真菌抑制率＝(对照组真菌直径-试验组真菌直径)/对照组真菌直径，以百分比表示。

2种乳酸菌对横梗霉hgm1靶标菌的抑菌能力比较结果如图7所示，帕氏乳杆菌gbw-hb1903针对横梗霉hgm1的抑制率达35.3％，而乳酸杆菌bj5针对横梗霉hgm1的抑制率仅18.1％，说明帕氏乳杆菌gbw-hb1903可在一定程度上抑制真菌，推测是因为其产生乳酸等代谢物而抑制了真菌的生长。

实施例2：帕氏乳杆菌厌氧发酵剂的制备

一、帕氏乳杆菌厌氧发酵剂的制备

本发明所述的帕氏乳杆菌厌氧发酵剂，是由特异的帕氏乳杆菌菌粉与缓释型复合载体复配而成，所述的帕氏乳杆菌菌粉是由自主分离筛选的帕氏乳杆菌gbw-hb1903发酵后冷冻干燥而成，其生产工艺流程图如图8所示。

所述帕氏乳杆菌菌粉的制备工艺包括以下步骤：

(1)菌株活化：在灭菌mrs培养基上，活化帕氏乳杆菌gbw-hb1903，挑取乳酸钙圈较大的单菌落，接种于茄形瓶斜面上，37℃培养12h后，茄型瓶斜面上长满菌苔，得到一级菌苔种子。

(2)种子罐培养：采用灭菌冷却的接种铲，将茄型瓶上的一级菌苔种子接种到装有种子培养基的灭菌种子罐中，37℃培养5h，形成大量指数期活跃菌体，作为二级种子培养液。其中，所述种子培养基组分包括(g/l)：葡萄糖18.2～20.5；胰蛋白胨8.5～9.7；酵母膏5.1～4.9；磷酸氢二钠3.8～4.1；硫酸锰0.15～0.21，吐温801～1.2；调节起始ph至7.0。种子罐体积为200l，培养基定容至150l，实消条件：恒温121℃保持30min；培养条件：恒温37℃±1℃，罐压0.05mpa，转速85rpm；通风量2.1m³/h。

(3)生产罐培养：将种子罐中的二级种子培养液转接至生产罐进行发酵培养，37℃培养16h，当发酵液ph稳定时停罐，获得帕氏乳杆菌gbw-hb1903菌粉发酵液。所述发酵培养基组分包括(g/l)：棉籽蛋白粉25.0～26.5g/l；玉米糖浆17.5～19.5g/l；乙酸钠4.0～5.5g/l；磷酸氢二钾1.2～2.1g/l；硝酸钠0.55～0.75g/l；硫酸锰0.25～0.35g/l；固体发酵复合蛋白酶2.0～2.5g/l；消泡剂1.3～1.8g/l，ph7.2。生产罐体积为30000l，培养基定容至21000l，实消条件：恒温116℃保持30min；培养条件：恒温37℃±1℃，罐压0.05mpa，转速0～10h为100rpm、10～16h为120rpm；通风量0～10h为165m³/h、10～16h为215m³/h。所述帕氏乳杆菌gbw-hb1903菌粉发酵液在放罐时的菌含量一般达到150×10⁸cfu/g～175×10⁸cfu/g。

(4)冷冻干燥：将帕氏乳杆菌gbw-hb1903菌粉发酵液移至离心罐内，3000rpm离心2min，浓缩去除98.5％以上发酵液，收集菌泥，加入冻干保护剂，菌液调配；其中冻干保护剂的组分为：乳清粉8.1％、低聚木糖6.4％、海藻糖4.3％、naco31.2％，均为占菌泥的质量比值；采用fd12-qx台式冷冻干燥机对帕氏乳杆菌gbw-hb1903菌泥进行冷冻干燥，冷冻温度为-30℃，冷冻干燥时间130min，获得帕氏乳杆菌gbw-hb1903冻干菌粉。

(5)筛分与质检：将所述帕氏乳杆菌gbw-hb1903冻干菌粉80目过筛，过筛率＞95％，并参考《国标gb4789.35-2010食品微生物学检验》中乳酸菌检验，测定帕氏乳杆菌gbw-hb1903菌量，质检合格后则为帕氏乳杆菌gbw-hb1903菌粉，此时所述帕氏乳杆菌gbw-hb1903菌粉中含菌量为2100×10⁸～2300×10⁸cfu/g。

(6)帕氏乳杆菌厌氧发酵剂的制备：在帕氏乳杆菌gbw-hb1903菌粉中按照1∶52～54的质量比添加缓释型复合载体，然后采用slhsj双轴桨叶式高效混合机，混合90～100s，保证均匀度，获得帕氏乳杆菌厌氧发酵剂，此时含菌量为40×10⁸cfu/g～42×10⁸cfu/g。其中，所述的缓释型复合载体为柠檬酸钠与乳糖粉复合物，柠檬酸钠与乳糖粉的质量比为1∶2。

二、帕氏乳杆菌厌氧发酵剂中缓释型复合载体的筛选

将5种载体(柠檬酸钠、乳糖粉、柠檬酸钠∶乳糖粉＝1∶1、柠檬酸钠∶乳糖粉＝1∶2、柠檬酸钠∶乳糖粉＝1∶3)与帕氏乳杆菌gbw-hb1903菌粉混合后配制的发酵剂样品，于4℃存放12个月，参考国标gb4789.35-2010跟踪测定帕氏乳杆菌gbw-hb1903菌粉的菌量变化，统计留存率。5种载体对帕氏乳杆菌gbw-hb1903发酵剂菌量稳定性的影响如表5所示，相比于6碳的柠檬酸钠，12碳的乳糖粉更有利于帕氏乳杆菌gbw-hb1903的存活，6个月后菌量趋于稳定，12个月后菌量留存率为73.3％。然而乳糖粉售价格较高，一般是柠檬酸钠的2倍左右。为了降低成本，并考察了柠檬酸钠与乳糖粉以不同比例复配后的菌量留存率，结果显示柠檬酸钠∶乳糖粉＝1∶2与柠檬酸钠∶乳糖粉＝1∶3两个复配方案，12个月的菌量留存率分别为72.1％和72.9％，与单独用乳清粉的留存率差异不大，并能显著降低成本。乳糖由葡萄糖与半乳糖组成，而柠檬酸钠的碳源也是缓释型的，因此，两者结合可减缓乳酸菌的菌量衰减。而结合菌量留存效果与应用成本，本发明选择柠檬酸钠∶乳糖粉＝1∶2为所述缓释型复合载体。

表4.5种载体对帕氏乳杆菌gbw-hb1903厌氧发酵剂菌量稳定性的影响

实施例3：帕氏乳杆菌厌氧发酵剂的发酵豆粕指标变化与仔猪饲喂试验

一、帕氏乳杆菌厌氧发酵剂的发酵豆粕指标变化检测

本发明所述的帕氏乳杆菌厌氧发酵剂是由特异的帕氏乳杆菌gbw-hb1903菌粉与缓释型复合载体复配而成，而帕氏乳杆菌gbw-hb1903具有降解不良寡糖、产乳酸、抑制病原细菌、抑制霉菌等特性，因此该菌粉所制备的发酵剂，应用于豆粕发酵中，会对豆粕各个指标产生较大影响。

选用实施例2制备的帕氏乳杆菌厌氧发酵剂，含菌量为41×10⁸cfu/g，以固体底物40％的水为溶解载体，以0.1％的质量比接种于豆粕中，37℃发酵48h，60℃烘干1h后粉碎样品。

取10.0g样品，加入50ml蒸馏水，搅拌混匀后静置15min，应用phs-3cph计测定ph。准确称取发酵豆粕样品5.0g于250ml三角瓶中，加入40.0ml80％的乙醇溶液，70℃水浴浸提1h以上；浸提液10000rpm离心10min，取上清；在预制硅胶板上点样，点样量为4μl，点样干燥后在展开液中展开，展开至离硅胶板前沿约2cm处；通风橱内自然晾干后，显色液内浸泡5s，在140℃下烘至显色。对比硅胶层析板上，样品和标样的条带，直接判读发酵豆粕中寡糖的降解情况。结果判定方法如下：完全降解：-，大部分降解：+，少部分降解：++，没有降解：+++。

不良寡糖定量测定参照国标gb/t22491-2008大豆低聚糖。样品处理：取1g样品加20ml纯净水磁力搅拌1h，取2ml液体8000rpm离心3min，取上清液用0.22μm滤膜过滤；高效液相条件∶流动相乙腈∶水＝68∶32、流速：1ml/min、色谱柱：nh2氨基柱、检测器：rid-20a示差检测器、柱温：30℃、进样量：20μl；以98％纯度的棉籽糖与水苏糖为标准品，分别建立hplc标准曲线，r²分别为0.995与0.997，测定浓度范围为0.5～2.5mg/ml。

l-乳酸定量测定参照国标gb/t23877-2009饲料酸化剂中柠檬酸、富马酸和乳酸的测定hplc法。样品处理：1g样品，加水定容至100ml，常温磁力搅拌1h；8000rpm/min离心3min，取1ml上清，加水稀释10倍；样品用0.22μm滤膜过滤；高效液相条件∶流动相∶0.1％磷酸∶乙腈＝97.5∶2.5、流速：1ml/min、色谱柱：c18柱、检测器：spd-20a紫外检测器、检测波长：210nm、柱温：35℃、进样量：20μl；以99％纯度的l-乳酸标准品，建立hplc标准曲线，r²分别为0.996，测定浓度范围为0.1～0.5mg/ml。

参考《国标gb/t5009.5-2016食品安全国家标准》中蛋白质的测定，采用凯氏定氮法测定粗蛋白含量；参考国标gb/t6434-94饲料中粗纤维含量测定，采用jb牌粗纤维测定仪测定粗纤维含量。

豆粕经本发明所述的帕氏乳杆菌发酵剂发酵后，不良寡糖定性比较结果如图9所示，不良寡糖的定量比较结果如图10所示，l-乳酸的变化如图11所示，各指标变化的综合结果如表5所示。发酵豆粕与豆粕相比，ph下降2.05，不良寡糖定性测定完全降解，定量测定棉籽糖降解率98.8％，水苏糖降解率98.1％，l-乳酸比豆粕增长10.4倍，粗蛋白提升10.93％，粗纤维降解5.63％，以上结果说明帕氏乳杆菌gbw-hb1903的厌氧发酵处理，降低了豆粕的粗纤维，降解了胀气因子不良寡糖，尤其是棉籽糖和水苏糖，并将其转化为以l-乳酸为代表的有机酸，这些都将促进豆粕蛋白的高效利用。

表5.帕氏乳杆菌厌氧发酵剂发酵豆粕前后各指标的变化

二、帕氏乳杆菌厌氧发酵剂的仔猪饲喂试验

将采用本发明所述帕氏乳杆菌厌氧发酵剂发酵豆粕的样品，应用于28日龄仔猪试验。试验于2019年8月3日～2019年9月5日在山东省平度市南村镇某猪场进行，选取40头28日龄、体况良好、体质量相近的杜长大三元杂交断奶仔猪，随机分为2组，每组设置4个重复，每个重复5头猪，试验周期为30d，试验开始前3d为预饲期。饲养管理采用常规饲养管理模式。对照组饲喂含13％豆粕的乳猪全价配合饲料，试验组饲喂含13％发酵豆粕的乳猪全价配合饲料，考察断奶仔猪的生长指标、蛋白消化率、胀气率。于试验开始1、14、29d晨饲前空腹称重，计算平均日增重；记录饲料消耗数据，折算平均采食量；并采用全收粪法，测定蛋白消化率；结合乳仔猪腹变化与临床表现，判断胀气猪的比例。试验数据经初步处理后，利用spss16.0统计软件进行方差分析，如果方差分析结果差异显著，则采用lsd法进行多重比较，以p＜0.05为差异显著性判断标准。

乳仔猪的饲喂试验结果如表6所示，食用发酵豆粕的乳仔猪，表现出更高的生长指标与蛋白消化率，两者差异达显著水平(p＜0.05)。经帕氏乳杆菌厌氧发酵剂发酵后，饲喂豆粕引起的胀气问题基本得到解决，胀气率下降85.6％，两者差异达极显著水平(p＜0.01)。由于不良寡糖进入乳仔猪体内，因缺乏可降解棉籽糖、水苏糖的内源酶，在乳仔猪的胃和小肠内这些不良寡糖无法被消化，而直到大肠与盲肠内，这些不良寡糖才能被微生物消化，因此在乳仔猪肠道内产生co2等气体，进而引起乳仔猪的胀气、腹痛等问题，并影响其生长表现；而采用体外帕氏乳杆菌厌氧发酵剂处理后的发酵豆粕，解决了动物易引起胀气的不良寡糖问题，乳仔猪不再胀气，正常采食，因此获得较好的蛋白利用能力与生长表现，平均日增重和采食量也获得了明显的增长，有利于乳仔猪的生长和发育。

表6.发酵豆粕与豆粕对乳仔猪生长与健康指标的影响对比

实施例4：帕氏乳杆菌厌氧发酵剂发酵麸皮指标变化与白羽肉鸡饲喂试验

一、帕氏乳杆菌厌氧发酵剂的发酵麸皮指标变化

本发明所述的帕氏乳杆菌厌氧发酵剂是由特异的帕氏乳杆菌gbw-hb1903菌粉与缓释型复合载体复配而成，而帕氏乳杆菌gbw-hb1903具有降解不良寡糖、产乳酸、抑制病原细菌、抑制霉菌等特性，因此该菌粉所制备的厌氧发酵剂，应用于麸皮发酵中会对豆粕各个指标产生较大影响。

选用实施例2制备的帕氏乳杆菌厌氧发酵剂，含菌量为42×10⁸cfu/g，以固体底物45％的水为溶解载体，以0.1％的质量比例接种于麸皮中，37℃发酵48h，60℃烘干1h后粉碎样品。

取10.0g样品，加入50ml蒸馏水，搅拌混匀后静置15min，应用phs-3cph计测定ph。

l-乳酸定量测定参照国标gb/t23877-2009饲料酸化剂中柠檬酸、富马酸和乳酸的测定hplc法。样品处理：1g样品，加水定容至100ml，常温磁力搅拌ih；8000rpm/min离心3min，取1ml上清，加水稀释10倍；样品用0.22μm滤膜过滤；高效液相条件∶流动相∶0.1％磷酸∶乙腈＝97.5∶2.5、流速：1ml/min、色谱柱：c18柱、检测器：spd-20a紫外检测器、检测波长：210nm、柱温：35℃、进样量：20μl；以99％纯度的l-乳酸标准品，建立hplc标准曲线，r²分别为0.996，测定浓度范围为0.1～0.5mg/ml。

挥发性脂肪酸(volatilefattyacid，vfa)指标：采用sp-2100a气相色谱仪，毛细管柱型号kb-ffap30m×0.32mm×0.25μm，柱温130℃，汽化温度180℃，应用氢离子火焰检测器，检测温度180℃，载气为高纯氮气，通过内标法(巴豆酸)定量各组分。

采用96孔板测定系列发酵麸皮样品中乳酸菌素对大肠杆菌的抑制效果，采用最小抑菌浓度mic指标表示，mic越低，抑菌效果越强。样品母液：称取1g样品加入9ml无菌水中，混合均匀，37℃，180rpm/min，震荡提取4h后10000rpm/min离心10min后取上清，制成10倍稀释母液；指示液制作：e.colidh5α于lb液体培养基中37℃培养约12h，10000倍梯度稀释。在a与b排1～12列孔中分别加入100μllb无菌培养基；在a排第1孔加入100μl样品母液，移液器吸打混匀后，吸取100μl加入同排第2孔中，吸打混匀，再吸取100μl加入同排第3孔中，如此操作，依次稀释至第12孔，弃掉从第12孔吸取的100μl混合液，此时1～12孔稀释倍数为2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024，乘以母液稀释倍数为总稀释倍数；b排重复a排操作。在a排中加入100μllb无菌培养基，作为对照；在b排中加入100μle.colidh5α稀释指示液，37℃恒温培养箱内孵育16h，用酶标仪测定od600nm处吸光值。若在该稀释梯度下，样品有抑菌能力，则试验组od值不会因为接种大肠杆菌e.colidh5α而增高，与对照组od值保持类似趋势；反之，若在某一个稀释梯度及更高梯度下，样品无抑菌能力，则试验组od值会因接种大肠杆菌e.colidh5α而增高，与对照组od拉开较大差距。根据两条od曲线的交叉，可以找到mic的稀释倍数，结合样品母液的稀释倍数，即为该样品针对大肠杆菌e.colidh5α的mic浓度。采用elisa毒素试验盒，分别利用酶标仪测定黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素等指标。

麸皮经帕氏乳杆菌厌氧发酵剂发酵前后ph、产l-乳酸、vfa、抑菌mic等指标变化如表7和图12所示，发酵麸皮与麸皮相比，ph下降2.58，l-乳酸比麸皮增长18.3倍，总vfa增长2.97倍，异/总vfa下降41.8％，最小抑菌浓度mic显著降低，降至0.00625g/mi。利用磷酸氢二钠与磷酸二氢钠缓冲液将样品母液的ph由3.93调节为7，此时最小抑菌浓度mic略有增加，为0.0125g/ml，相当于保存了50％的抑菌特性。上述结果显示抑菌物质除了乳酸外，还有对ph不太敏感的乳酸菌素、细菌素等。

表7.帕氏乳杆菌厌氧发酵剂发酵麸皮前后各产酸与抑菌指标的变化

此外，经帕氏乳杆菌发酵剂发酵后，发酵麸皮的各种毒素变化情况如表8所示，麸皮发酵后各毒素含量均下降，且降幅均＞70％，尤其是黄曲霉毒素降低了81.2％，该结果说明帕氏乳杆菌的发酵处理，降低了麸皮的ph、毒素含量，说明与酸性环境抑制霉菌生长有关；发酵麸皮的l-乳酸含量显著增加，且最小抑菌浓度mic显著降低，都显著提升了发酵麸皮的应用价值。

表8.帕氏乳杆菌厌氧发酵剂发酵麸皮前后各毒素指标的变化(ppm)

二、帕氏乳杆菌厌氧发酵剂的白羽肉鸡饲喂试验

将采用本发明所述帕氏乳杆菌厌氧发酵剂发酵麸皮的样品，应用于7日龄白羽肉鸡试验。试验于2019年10月5日～2019年11月6日在青岛根源肉鸡养殖实验室进行，选取280只7日龄、体况良好、体质量相近的白羽肉鸡，随机分为2组，每组4个重复，每个重复70只鸡，试验周期为35d。试验开始前3d为预饲期。饲养管理采用常规饲养管理模式。对照组饲喂含10％麸皮的玉米豆粕全价肉鸡料，试验组饲喂含10％发酵麸皮的玉米豆粕全价肉鸡料，考察断肉鸡的料重比、欧洲指数、盲肠食糜总vfa、盲肠食糜异/总vfa腹泻率。记录每周龄各组生长性能指标，以计算料重比与欧洲指数。42日龄结束试验时，每个处理组取10只鸡，屠宰，取盲肠食糜，测总vfa。记录腹泻鸡个数，计算腹泻率。试验数据经初步处理后，利用spss16.0统计软件进行方差分析，如果方差分析结果差异显著，则采用lsd法进行多重比较，以p＜0.05为差异显著性判断标准。

白羽肉鸡的饲喂试验结果如表9所示，食用发酵麸皮的白羽肉鸡，表现出更高的生长指标和更大的投资回报率，两者差异达显著水平(p＜0.05)。经发酵后，饲喂发酵麸皮的肉鸡肠道，表现出更高的vfa指标和更低的异/总vfa，且两者具有显著差异(p＜0.05)。vfa指标主要包括乙酸、丙酸、丁酸，这些酸在动物肠道内，都能通过各种形式转化为能量为机体利用；异vfa主要包括异丁酸和异戊酸，主要由后肠微生物发酵残余蛋白产生，而该指标的降低，可以说明动物肠道残留蛋白相对减少，有利于减少蛋白型发酵带来尸氨、组胺、h2s等臭气问题。此外，发酵麸皮饲喂白羽肉鸡，还有效缓解了腹泻问题，降幅达86.1％。采用体外帕氏乳杆菌厌氧发酵剂处理后的发酵麸皮，减少了原料中的毒素含量，提高了乳酸等有机酸含量，降低了物料ph，在动物饲喂试验中也表现出较好的肠道区系与vfa含量与组成，使白羽肉鸡显著降低了腹泻率，同时获得了较好的生长表现。

表.9发酵麸皮与麸皮对白羽肉鸡生长与健康指标影响对比

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110>青岛尚德生物技术有限公司

<120>一种帕氏乳杆菌厌氧发酵剂及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1411

<212>dna

<213>帕氏乳杆菌(lactobacillusparafarraginis)

<400>1

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