抗4-1BB抗体及其用途的制作方法

提供了抗4-1bb抗体或其抗原结合片段及其用途。
背景技术：
：4-1bb是tnf受体超家族(tnfrsf)的成员并且是一种共刺激分子，其在免疫细胞(固有免疫细胞和适应性免疫细胞)活化后表达。4-1bb在调节各种免疫细胞的活性中起重要作用。4-1bb激动剂增强免疫细胞增殖、存活、细胞因子的分泌和cd8t细胞的细胞溶解活性。许多其他研究显示，4-1bb的活化增强了免疫应答，从而消除了小鼠中的肿瘤。因此，提示4-1bb是癌症免疫学中有希望的靶分子。尽管抗4-1bb抗体具有抗肿瘤功效，但它们在临床应用中诱导重度肝毒性。技术实现要素：一种实施方式提供了能够增强哺乳动物的免疫应答和/或治疗肿瘤(癌症)的抗4-1bb抗体或其抗原结合片段。与现有的抗4-1bb抗体相比，该抗4-1bb抗体或其抗原结合片段的特征在于仅在肿瘤微环境(tme)中定位和/或激活，和/或显著地降低肝脏毒性，同时维持增强免疫应答增强和/或肿瘤治疗的功效。另一种实施方式提供了抗4-1bb抗体或其抗原结合片段，其包含：cdr(互补决定区)-h1，其包含seqidno:1、2或3的氨基酸序列；cdr-h2，其包含seqidno:4、5或6的氨基酸序列；cdr-h3，其包含seqidno:7、8、9、10或11的氨基酸序列；cdr-l1，其包含seqidno:12或13的氨基酸序列；cdr-l2，其包含seqidno:14或15的氨基酸序列；以及cdr-l3，其包含seqidno:16或17的氨基酸序列。[表1]抗4-1bb抗体的cdr在特别的实施方式中，抗4-1bb抗体或其抗原结合片段可以包含：多肽，其包含seqidno:40的氨基酸序列作为h-fr1；多肽，其包含seqidno:41的氨基酸序列作为h-fr2；多肽，其包含seqidno:42、43、44或45的氨基酸序列作为h-fr3；多肽，其包含seqidno:46的氨基酸序列作为h-fr4；多肽，其包含seqidno:47、48或49的氨基酸序列作为l-fr1；多肽，其包含seqidno:50或51的氨基酸序列作为l-fr2；多肽，其包含seqidno:52或53的氨基酸序列作为l-fr3；和/或多肽，其包含seqidno:54或55的氨基酸序列作为l-fr4。另一种实施方式提供了抗4-1bb抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区，所述重链可变区包含含有seqidno:1、2或3的氨基酸序列的cdr-h1、含有seqidno:4、5或6的氨基酸序列的cdr-h2、和含有seqidno:7、8、9、10或11的氨基酸序列的cdr-h3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含含有seqidno:12或13的氨基酸序列的cdr-l1、含有seqidno:14或15的氨基酸序列的cdr-l2、和含有seqidno:16或17的氨基酸序列的cdr-l3。另一种实施方式提供了抗4-1bb抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区，所述重链可变区包含以下或基本上由以下组成：seqidno:18、19、20、21、22、23、39、57、58、59或60；和轻链可变区，所述轻链可变区包含以下或基本上由以下组成：seqidno:24、25、26、61或62的氨基酸序列。另一种实施方式提供了抗4-1bb抗体或其抗原结合片段，其包含：重链，所述重链包含以下或基本上由以下组成：seqidno:27、28、29、30、31或32的氨基酸序列；和轻链，所述轻链包含以下或基本上由以下组成：seqidno:33、34或35的氨基酸序列。在一种实施方式中，本文所述的抗4-1bb抗体或抗原结合片段可进一步包含靶向除4-1bb以外的生物活性物质的至少一种多肽。另一种实施方式提供了包含抗4-1bb抗体或其抗原结合片段的药物组合物。该药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。该药物组合物可用于增强免疫应答，和/或用于治疗和/或预防癌症。增强免疫应答可以是4-1bb信号活化、t细胞活化或两者。另一种实施方式提供了一种治疗和/或预防有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括将药学上有效量的抗4-1bb抗体或其抗原结合片段或药物组合物施用至受试者。该方法可以进一步包括在施用步骤之前鉴定需要治疗和/或预防癌症的受试者的步骤。另一种实施方式提供了一种增强有需要的受试者的免疫应答的方法，该方法包括将药学上有效量的抗4-1bb抗体或其抗原结合片段或药物组合物施用至受试者。该方法可以进一步包括在施用步骤之前鉴定需要增强免疫应答的受试者的步骤。增强免疫应答可以是4-1bb信号活化、t细胞活化或两者。另一种实施方式提供了抗4-1bb抗体或其抗原结合片段或药物组合物用于治疗和/或预防癌症的用途。另一种实施方式提供了抗4-1bb抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗和/或预防癌症的药物组合物中的用途。另一种实施方式提供了抗4-1bb抗体或其抗原结合片段或药物组合物用于增强免疫应答的用途。另一种实施方式提供了抗4-1bb抗体或其抗原结合片段在制备用于增强免疫应答的药物组合物中的用途。增强免疫应答可以是4-1bb信号活化、t细胞活化或两者。一种实施方式提供了编码抗4-1bb抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。具体地，一种实施方式提供了编码如上所述的抗4-1bb抗体或其抗原结合片段的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3中的任一个、重链可变区或重链的第一多核苷酸。另一种实施方式提供了编码如上所述的抗4-1bb抗体或其抗原结合片段的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3中的任一个、轻链可变区或轻链的第二多核苷酸。一种实施方式提供了包含第一多核苷酸、第二多核苷酸或其组合的重组载体。另一种实施方式提供了用重组载体转染的重组细胞。另一种实施方式提供了制备抗4-1bb抗体或其抗原结合片段的方法，包括在细胞中表达第一多核苷酸和第二多核苷酸。表达多核苷酸的步骤可以通过在允许多核苷酸表达的条件下培养包含多核苷酸(例如在重组载体中的多核苷酸)的细胞来进行。该方法可以进一步包括在表达或培养步骤之后，从细胞培养物中分离和/或纯化抗4-1bb抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“抗原结合片段”是抗体的具有识别和/或结合抗原能力的部分，该部分选自由f(ab')2、f(ab)2、fab'、fab、fd、fv、单链fv(scfv)、单链抗体、二硫键连接的fv(sdfv)、包含vk或vh结构域的片段、由fab表达文库产生的片段以及抗独特型(抗-id)抗体(包括例如本文公开的针对light抗体的抗-id抗体)组成的组。本公开的免疫球蛋白(例如人免疫球蛋白)或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何型(例如，ige、igm、igd、iga、igy等)、类(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、igg4、igg5、iga1、iga2等)或亚类。术语“抗体”可以涵盖可以在生化上区别的各类多肽。本领域技术人员将理解，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其中具有一些子类(例如γ1至γ4)，轻链则被分类为κ或λ(k、λ)。该链的性质决定了抗体的“类”分别为igg、igm、iga、igg或ige。免疫球蛋白亚类(同种型)例如igg1、igg2、igg3、igg4、igg5等已被很好地表征，并且已知给予功能专一性。本公开的抗体和抗原结合片段可包括但不限于：多克隆抗体或单克隆抗体；单特异性抗体或多特异性抗体；和/或人抗体、人源化抗体(例如小鼠、兔等)或嵌合抗体。术语“受试者”可以指期望进行诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者可以包括人类、家畜、农场动物以及动物园动物、运动动物或宠物，例如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、家牛、乳牛等。一方面，抗体或其片段是化学或重组合成的(不是天然存在的)。假设每种抗体都可以结合4-1bb(例如人4-1bb)，则可以将本文所公开的cdr序列，或vl(重链可变区)和vl(轻链可变区)序列“混合并匹配”以产生其他的抗4-1bb结合分子。附图说明图1a至图1c显示了根据本发明的一种实施方式制备的抗4-1bb抗体与4-1bb抗原的结合能力的分析(elisa)结果。显示每种抗4-1bb单克隆抗体都与胞外结构域4-1bb抗原特异性结合。图2是根据本发明的一种实施方式制备的抗4-1bb抗体与4-1bb抗原的结合能力的测量(facs)结果。显示每种抗4-1bb单克隆抗体都与细胞表面表达的4-1bb特异性结合。图3是显示根据本发明的一种实施方式制备的抗4-1bb抗体对4-1bb信号活化的图。图4是显示根据本发明的一种实施方式制备的抗4-1bb抗体对t细胞活化的图。图5是显示根据本发明的一种实施方式制备的双特异性抗体形式的抗4-1bb抗体对4-1bb信号活化的图。图6是显示根据本发明的一种实施方式制备的抗4-1bb抗体在小鼠肿瘤同基因模型中的癌症抑制功效的图。显示每种抗4-1bb抗体均能抑制敲入人4-1bb的小鼠体内的癌症生长。该结果意味着本发明的4-1bb抗体与表达人4-1bb的免疫细胞结合，从而抑制癌症的生长，并且有用地用作癌症治疗剂。图7是抗pd-l1/抗4-1bb双特异性抗体的示意图。图8a是显示抗4-1bb抗体(41b01)在4-1bb上的结合位点的示意图。图8b是显示抗4-1bb抗体(41b02)在4-1bb上的结合位点的示意图。图9a至图9e显示了乌瑞芦单抗(urelumab)与候选物(41b01和41b02)之间的交叉竞争。图10a至图10e显示了乌托鲁单抗(utomilumab)与候选物(41b01和41b02)之间的交叉竞争。图11a至图11d显示了41b01和41b02之间的交叉竞争。图12a至图12c显示了重组人41bb-配体与41b01之间的交叉竞争。具体实施方式定义在本文中，“多核苷酸”或“核酸”包括单链或双链核苷酸聚合物。包含这样的多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其修饰形式。除非本文另有说明，否则本文所述的多核苷酸的左端是5’端，其右端代表3’端。本文中，“分离的核酸分子”是指基因组来源的dna或rna，或合成来源的mrna、cdna，或它们的组合，它们与以下多核苷酸连接，所述多核苷酸全部或部分地与自然界存在的多核苷酸无关，或在自然界中观察不到。出于本发明的目的，包含特定核酸序列的核酸分子不包含完整染色体。相反，包含特定核酸序列的分离的核酸分子除了其特定序列外还可以包含至少几种另外的蛋白质编码序列，或者可以进一步包含用于表达特定核酸序列的调节序列和/或载体。本文中，术语“调节序列”是指通过与编码序列可操作地连接而影响编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。调节序列的这种性质可能受到各种宿主的影响。例如，适用于原核细胞的调节序列可包括启动子，偶尔地操纵子、核糖体结合位点和转录终止序列。在真核细胞中，调节序列可包含含有多个识别位点的启动子、转录增强子、多腺苷酸化序列和转录终止序列。调节序列可以进一步包含阅读序列(readersequence)和/或融合伴侣序列。本文中，“载体”是指用于将编码蛋白质的核酸分子递送至宿主细胞的任何分子，包括例如核酸、质粒、噬菌体或病毒。本文中，“表达载体或重组载体”是指适合转化宿主细胞的载体，并且包含与表达载体可操作地连接并调节编码靶蛋白的异源序列的表达的核酸序列。该表达载体也可以与编码序列可操作地连接，并且在转录、翻译和存在内含子的情况下，可以包含调节rna剪接或影响rna的序列。在本文中，“可操作地(或操作地)连接(或链接)”是指待连接的核酸序列被定位以便在适当条件下执行靶功能。例如，如果编码序列的转录在适当条件下在包含编码序列和调节序列的载体中受调节序列影响，则该编码序列被可操作地连接。本文中，“宿主细胞”是指可以表达通过靶核酸序列转化或待通过靶核酸序列转化的靶基因的细胞。该术语包括宿主细胞的后代，只要其表达靶基因即可，无论宿主细胞的身份和形式以及遗传构成如何。本文中，“转导”通常是指通过噬菌体将核酸从一种细菌移动到另一种细菌。例如，它包括使用不能复制的逆转录病毒将核酸移动到真核细胞。本文中，“转染”是指细胞摄取外来或外源dna，在这种情况下，dna通过细胞膜导入细胞。这可以参考本领域已知的方法，例如，sambrook等人,分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual),第4版,冷泉港出版社,冷泉港,n.y.(2012)；ausubel等人,分子生物学通用方法(currentprotocolsinmolecularbiology),格林出版协会。本文中，“转化”是指细胞遗传特性的改变，该细胞被修饰以使细胞包含新的dna或rna。例如，通过由转染、转导或其他技术导入新的遗传物质，可以转化细胞，从而改变遗传特性。通过包括转导或转染等方法转化的dna可以通过物理整合到细胞的染色体中而存在，或者可以作为不复制的附加体形式或可复制的质粒而暂时存在。当转化的dna伴随宿主细胞分裂而复制时，它被认为是稳定转化的。本文中，“氨基酸”包括本领域中理解的共同含义。二十种天然存在的氨基酸及其缩写与本领域常用的一样(免疫学-a合成(immunology-asynthesis)，第二版，e.s.golub和d.r.green编，sinauer公司：马萨诸塞州桑德兰.1991)。氨基酸包括典型氨基酸，20种典型氨基酸的立体异构体(d-氨基酸)、非天然氨基酸，例如α-,α-二取代氨基酸、n-烷基氨基酸和其他非典型氨基酸。作为非典型氨基酸的实例，4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-n,n,n-三甲基赖氨酸、ε-n-乙酰赖氨酸、o-磷酸丝氨酸、n-乙酰丝氨酸、n-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-n-甲基精氨酸和其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。在本文使用的多肽标记中，如本领域常用的，序列的左侧是氨基末端，右侧代表羧基末端。本文中，“多肽”或“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物，并且在本文中可互换使用。这不仅包括天然存在的氨基酸残基的聚合物，还包括其类似物或模拟物的聚合物。此外，多肽或蛋白质可以包含修饰，例如添加碳水化合物用于磷酸化或糖基化等。此外，多肽或蛋白质可以在重组或天然发现的细胞中产生。此外，多肽或蛋白质可包括其中一部分野生型序列或氨基酸序列缺失、添加和/或取代的多肽或蛋白质。另外，该多肽或蛋白质包括抗体，例如抗4-1bb抗体(或称为4-1bb抗体)、4-1bb结合蛋白或抗原结合片段、或其中缺失、添加和/或取代序列中的一个或多个氨基酸的序列。此外，“多肽片段”是指与全长蛋白质相比具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。与全长蛋白质相比，该片段还可包括修饰的氨基酸。在一种实施方式中，该片段的长度可以为约5至500个氨基酸，例如，长度为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或更多个氨基酸。考虑到本发明的目的，有用的多肽片段包括包含抗原结合结构域的抗体的免疫功能片段。在4-1bb结合抗体的情况下，这样的有用片段包括：包含1、2或3个重链或轻链的cdr序列，或包含重链或轻链的可变区或恒定区的抗体链的全部或部分，但不限于此。本文中，“分离的多肽、抗体或蛋白质”是指通常没有任何其他的蛋白质与它们一起被发现，并且至少天然与它们连接的脂质、碳水化合物和多核苷酸的至少约50％或更多被除去。通常，分离的蛋白质、多肽或抗体在某种组合物中包含至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。该多肽可以由合成来源的基因组dna、cdna、mrna或其他rna或其任意组合编码。特别地，分离的蛋白质、多肽或抗体基本上不含干扰其治疗、诊断和预防性研究或其他用途的应用的其他蛋白质或其他多肽的污染物。本文所述的抗体和/或其抗原结合片段可以包括其“变体”，其中变体可以指从多肽序列中插入、缺失、添加和/或取代一个或多个氨基酸残基的多肽，只要该多肽保持抗体和/或其抗原结合片段的期望的生物学活性和/或结构即可，并且变体可以包括通过与其他多肽连接的融合多肽。另外，变体可以包括这样一种变体，该变体通过蛋白质酶切割、磷酸化和/或其他翻译后修饰而被修饰，但是保持本文公开的抗体和/或其抗原结合片段的生物学活性，例如结合4-1bb和特异性。相对于本文公开的抗体或其抗原结合片段的序列，变体可以具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，例如，约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％的序列同一性。可以参考以下描述来计算同一性百分比(％)或同源性百分比。在一种实施方式中，同源性或同一性百分比可以计算为100×[(相同位置)/min(tga,tgb)]，在公式中，tga、tgb是比较的序列a和b的残基数目的总和内部空位位置(russell等人,j.molbiol.,244:332-350(1994))。在此，保守氨基酸取代是指基本上不影响多肽的活性或抗原性的取代。该多肽可以包含一个或多个保守取代。下表3中公开了非限制性示例。本文中多肽的“衍生物”是指通过与其他化学部分缀合而在一个或多个残基中化学修饰的多肽，该衍生物不同于插入、缺失、添加或取代变体。本文中所述的抗体或其抗原结合片段所识别的4-1bb(受体酪氨酸激酶样孤儿受体)可以指rtk(受体酪氨酸激酶)家族的跨膜蛋白。在一种实施方式中，它特别地识别胞外结构域。抗体识别的4-1bb可能是存在于细胞膜中或不存在于细胞膜中的胞外结构域。4-1bb的人蛋白质由937个氨基酸组成，氨基酸序列为ncbi参考序列id：np_005003.2，核酸序列为nm_005012.3。除非从本文所用的上下文显而易见，否则4-1bb是指人h4-1bb，但是抗体具有与小鼠4-1bb的特异性结合能力。小鼠4-1bb氨基酸序列由genbank：baa754.80.1表示。本文中“同一性”是指两种或更多种多肽或两种或更多种多核苷酸的序列相似性，其通过排列和比较两种或更多种多肽或两种或更多种多核苷酸来确定。序列之间的这种同一性通常用“同一性百分比”表示，这意味着待比较的分子之间相同氨基酸或核苷酸的比例，并且这基于待比较分子中最小的分子大小计算。当计算同一性百分比时，要比较的序列以提供序列之间的最大匹配的方式排列，并且在排列的序列中，可以存在空位、匹配和错配，并且这通过特定的数学模型或计算机算法来处理。在一种实施方式中，可使用包括gap程序的gcg程序包确定该同一性百分比，所述gap程序使用needlman和wunsch算法以最大化待比较序列之间的匹配并最小化空位数的方式排列两个序列(devereux等人，1984，nucl.acidres.12：387；美国威斯康辛州麦迪逊市威斯康辛大学遗传学计算机小组)。计算机算法gap通过在两个待比较的多肽或多核苷酸序列中以最大化它们之间的匹配并最小化空位数的方式排列两个序列来确定“匹配跨度”。该算法还一起使用空位开放罚分[计算为3×平均对角线(averagediagonal)，其中“平均对角线”是要使用的比较矩阵的对角线的平均值；并且“对角线”是通过特定比较矩阵为每个完整氨基酸匹配分配的分数或数字]和空位扩展罚分(这通常是空位开放罚分的1/10倍)，以及比较矩阵(例如pam250或blosum62)。在特别的实施方式中，标准比较矩阵(对于pam250比较矩阵，参考dayhoff等人，1978，蛋白质序列和结构图册(atlasofproteinsequenceandstructure)5：345-352；对于blosum62比较矩阵，参考henikoff等人，1992，proc.natl.acad.sci.u.s.a.89：10915-10919)。在一种实施方式中，推荐用于确定使用gap程序的多肽或多核苷酸的同一性百分比的参数如下：算法：needleman等人，j.mol.biol.1970，48：443-453；比较矩阵：blosum62(henikoff等人，1992，同上)；空位罚分：12(对末端空位不予罚分)；空位长度罚分：4；相似度阈值：0。当使用特定参数排列两个序列时，尽管两个序列之间没有显著相关性，但是可以导出它们以高度的同一性在短序列区域中匹配的结果。在这种情况下，为了通过至少50个连续氨基酸排列两个序列，可以校正用作gap程序的算法的参数。“基本上纯的”是靶分子作为主要种类存在。换句话说，这意味着基于摩尔，浓度高于同一混合物中的任何其他个体种类。在一种实施方式中，基本上纯的分子在组合物中所包含的所有聚合物中为至少约50％(基于摩尔)、至少约80％、约85％、至少约90％或至少约99％。在其他实施方式中，靶分子被基本上同质地纯化直到通过使用常规方法检测不到任何其他污染物，因此组合物包含一种同质聚合物物质。在一方面，本发明涉及特异性结合4-1bb蛋白或其抗原结合片段的重组抗体。在这方面，“重组蛋白”是使用重组技术，即通过表达本发明中描述的重组核酸来制备的蛋白质。产生重组蛋白的方法和技术是本领域众所周知的。本文中，“亲和力”是抗体或其抗原结合片段与抗原之间相互作用的强度，并且该强度由抗原的性质如抗原的大小、形状和/或电荷以及抗体或抗原结合片段的cdr序列来决定。用于确定亲和力的方法在本领域中是已知的，并且可以参考以下内容。当解离常数(kd)为10-6m或更小时，抗体或其抗原结合片段被称为与其靶标(例如抗原)“特异性结合”。当kd为1x10-8m或更小时，抗体以“高亲和性”与靶标特异性结合。本文中，“抗原结合区或位点”是指与特定抗原特异性结合的蛋白质或蛋白质的一部分。例如，包括通过与抗原相互作用为抗体提供与抗原的特异性和亲和性的氨基酸残基的抗体的一部分。该抗原结合区通常包含一个或多个“互补决定区(cdr)”。特定的抗原结合区还包含一个或多个“骨架(fr)”区。骨架区有助于维持这些cdr的适当构象，从而促进抗原结合区和抗原之间的结合。本文中，“抗体”是指能够为与任意同种型的完整免疫球蛋白或靶抗原结合而与完整抗体竞争的抗原结合片段。例如，它包括嵌合抗体、人源化抗体、完整的人抗体和双特异性抗体或其抗原结合片段。抗体本身就是一种抗原结合蛋白。完整抗体通常包含至少2个全长重链和2个全长轻链，但在一些情况下，如在骆驼科动物中天然存在的，抗体可仅包含重链。抗体或其抗原结合片段可以仅来源于一种来源或是嵌合的。嵌合抗体包含来源于两种不同抗体的部分，并在下面更详细地描述。抗体或其抗原结合片段可由杂交瘤、重组dna技术或完整抗体的酶促或化学切割产生。除非另有说明，否则本文中，术语抗体包括含有2条全长重链和2条全长轻链的抗体，及其衍生物、变体、片段和突变体，它们的实例如下所述。本文中，“轻链”包括具有可变区序列的全长轻链，所述可变区序列足以提供与抗原或表位及其片段的结合特异性。全长轻链包含可变区结构域vl和恒定区结构域cl。轻链的可变区结构域存在于轻链多肽的氨基末端。轻链的种类包括κ和λ链。本文中，“重链”包括具有可变区序列的全长重链，所述可变区序列足以提供与抗原或表位及其片段的结合特异性。全长重链包含可变区结构域vh和3个恒定区域ch1、ch2和ch3。vh结构域存在于重链多肽的氨基末端，ch结构域存在于羧基末端，ch3位于最靠近羧基末端的位置。重链包含igg(包含igg1、igg2、igg3和igg4亚型)、iga(包含iga1和iga2亚型)、以及igm和ige的同种型。如本文使用的，抗体或免疫球蛋白的链(重链或轻链)的“抗原结合片段”包括与全长链相比缺少一些氨基酸但可以特异性结合抗原的抗体的一部分。该片段可以被认为具有生物活性，在一方面它可以特异性结合靶抗原，或者可以与其他抗体或抗原结合片段竞争结合特定表位。在一方面，该片段包含存在于全长轻链或重链中的至少一个cdr，并且在一些实施方式中，该片段包含短链重链和/或轻链，或其部分。该生物活性片段可以通过重组dna技术产生，或者可以通过例如酶促或化学切割完整抗体来产生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括fab、fab’、f(ab’)2、scfab、dsfv、fv、scfv、scfv-fc、双抗体、微型抗体、scab和dab，但不限于此，并且可以来源于任何哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、骆驼科动物或兔，但不限于此。抗体的功能部分例如本文所述的一个或多个cdr可以通过共价键与二级蛋白质或小分子化合物连接，从而用作对特定靶标的靶向治疗剂。本文中，“fc”区包含两个重链片段，所述两个重链片段包括抗体的ch2和ch3结构域。这两个重链片段彼此通过两个或更多个二硫键与ch3结构域的疏水相互作用相互结合。本文中，“fab片段”由1条轻链和1条重链组成，所述重链包含可变区和仅ch1。fab分子的重链不能与其他重链分子形成二硫键。scfab是两个fab分子通过柔性接头连接的分子。本文中，“fab’片段”除了fab片段外还包含重链的ch1和ch2结构域之间的区域，并且它可以在两个fab’片段分子的两条重链之间形成二硫键，以形成f(ab’)2分子。本文中，“f(ab’)2片段”包含两条轻链和两条重链，所述重链包含可变区、ch1和ch1与ch2结构域之间的恒定区的一部分，如上所述，从而在2个重链之间形成链内二硫键。因此，f(ab’)2片段由两个fab’片段组成，并且两个fab’片段通过它们之间的二硫键彼此会合。本文中，“fv区”是包含重链和轻链的每个可变区但不包含恒定区的抗体片段。sdfv是重链和轻链通过二硫键连接的抗体片段。scfc是通过柔性接头连接重链和轻链的单链可变区(fv)的抗体片段。scfv-fc是fc与scfv连接的抗体片段。微型抗体是ch3与scfv相连的抗体片段。双抗体包含两个scfv分子。本文中，“短链抗体(scab)”是重链和轻链可变区通过柔性接头连接的包含重链或轻链恒定区的一个可变区的单一多肽链。短链抗体可以参考例如美国专利第5,260,203号，并且在此通过引用公开。本文中，“结构域抗体(dab)”是免疫功能性免疫球蛋白片段，其仅包含重链可变区或轻链可变区。在一种实施方式中，两个或更多个vh区通过肽接头通过共价键连接，以形成二价结构域抗体。该二价结构域抗体的两个vh区可以靶向相同或不同的抗原。本文中，“二价抗原结合蛋白”或“二价抗体”包含两个抗原结合位点。该二价抗体中包含的两个抗原结合位点可具有相同的抗原特异性或可以分别结合不同抗原的双特异性抗体。本文中，“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”靶向两种或更多种抗原或表位。本文中，“双特异性”，“双重特异性”抗原结合蛋白或抗体是具有2个不同抗原结合位点的杂合抗原结合蛋白或抗体。该双特异性抗体是一种多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体，并且可以通过已知的各种方法，例如杂交瘤的融合或fab'片段的连接等方法来制备。例如，可以参考songsivilai和lachmann，1990，clin.exp.immunol.79：315-321；kostelny等人，1992，j.immunol.148：1547-1553等。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个抗原结合位点结合的彼此不同的两个表位可以位于相同或不同蛋白质靶标中。本文中，术语“抗原”或“免疫原”是指例如抗原结合蛋白(例如，抗体或其免疫功能性抗原结合片段)可以结合的分子或分子的一部分，并可以用于在动物中产生可与抗原结合的抗体。抗原可包含一个或多个可与不同抗体或其片段相互作用的表位。在一种实施方式中，抗原是4-1bb蛋白的胞外结构域。在本文中，“表位”是与抗原结合蛋白或抗体结合或被抗原结合蛋白或抗体识别的分子的部分，并且包括可以与抗原结合蛋白(例如抗体或t细胞受体)特异性结合的任何决定因子。该表位可以是连续的或非连续的，例如，在多肽序列中，它不是彼此连续的，但是在分子的一个方面，如构象表位，它可以是通过一种抗原结合蛋白结合但彼此远离的氨基酸残基。在一种实施方式中，表位包括与用于产生抗体的表位相似的三维结构，但就可以不包括表位中发现的残基或可以仅包括一些残基而言可以是模拟物。通常，表位是蛋白质，但它可以是其他种类的物质，如核酸。表位决定因子可以是通过诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的分子在表面上形成的化学活性基团，或者可以具有特定的三维结构性质和/或特定电荷性质。通常，对特定靶抗原具有特异性的抗体识别存在于蛋白质和/或聚合物的复合物中的靶抗原的表位。本文中，“治疗剂”是指为了靶向治疗效果而被施用于受试者的分子。受试者包括非人类哺乳动物，例如灵长类动物或人类。治疗剂的实例包括含有肽和多肽的蛋白质、核酸、抗体或小分子化合物。在另一方面，治疗剂可以通过与抗体结合而用作相关疾病例如癌症的治疗剂或抗体。在本文中，术语“治疗”是指减轻或治疗损伤、疾病、或疾病的症状或病态，包括任何客观或主观参数，包括减少，缓解，减轻损伤、疾病、或疾病的症状或病态，或使患者能够更好地承受损伤、疾病、或疾病的症状或病态，减缓损伤、疾病、或疾病的症状或病态的恶化速率，或在精神上或肉体上改善患者的生活质量。可以基于身体检查、与疾病有关的各种指标的检查和影像检查的结果来判断这种对损伤、疾病、或疾病的症状或病态的治疗或改善。本文中，“有效量(剂量)”通常是指足以降低由于疾病，特别是与4-1bb相关的疾病引起的症状的严重性和/或发生频率的量，足以去除由于疾病，特别是与4-1bb相关的疾病和/或疾病发生的根本原因引起的症状的量，或足以防止由于疾病，特别是与4-1bb相关的疾病和/或疾病发生的根本原因引起的症状发生的量，和/或足以改善或纠正由疾病，特别是与4-1bb相关的疾病引起的损伤的量。在一些实施方式中，有效剂量是治疗有效剂量或预防有效剂量。“治疗或药学有效剂量”是足以治疗疾病，特别是与4-1bb相关的症状或病症的量，或足以预防、延迟疾病，特别是与4-1bb相关的症状或病症的量，或足以逆转其进展的量。“预防有效剂量”是用于预防或延迟疾病，特别是与4-1bb相关的疾病；或与疾病，特别是与4-1bb相关的疾病的症状的发生或复发并降低其概率的量。完全治疗或预防效果可以通过几次施用而不通过单次施用来引起。因此，治疗或预防有效剂量可通过一次或多次施用来递送。4-1bb4-1bb，也称为cd137或tnfrsf9(tnf受体超家族成员9)，是tnf受体超家族(tnfrsf)的成员，并且是一种共刺激分子，其在免疫细胞(固有免疫细胞和适应性免疫细胞)活化后表达。4-1bb在调节各种免疫细胞的活性中起重要作用。如本文所用，4-1bb可以源自哺乳动物，例如智人(人)(ncbi登录号np_001552)。例如，人4-1bb蛋白(np_001552.2)可以由氨基酸序列(seqidno:67)表示，如下所示：如本文所述，术语“4-1bb”包括变体、同种型、同系物、直系同源物和旁系同源物。例如，在某些情况下，对人4-1bb蛋白具有特异性的抗体可以与人类以外物种的4-1bb蛋白发生交叉反应。在其他实施方式中，对人4-1bb蛋白具有特异性的抗体可以对人4-1bb蛋白完全特异，并且可以表现出物种或其他类型的交叉反应性，或者可以与来自某些其他物种但并非所有其他物种的4-1bb交叉反应(例如，与猴子4-1bb交叉反应，但不与小鼠4-1bb交叉反应)。术语“人4-1bb”是指人序列4-1bb，例如具有ncbi登录号np_001552的人4-1bb的完整氨基酸序列。术语“小鼠4-1bb”是指小鼠序列4-1bb，例如具有ncbi登录号np033430.1的小鼠4-1bb的完整氨基酸序列。4-1bb在本领域中也可以被称为例如cd137。本公开中的人4-1bb序列可以由于例如具有保守突变或在非保守区域中具有突变而与ncbi登录号np_001552的人4-1bb不同，本公开中的4-1bb具有与ncbi登录号np_001552的人4-1bb基本相同的生物学功能。抗4-1bb抗体如实验例所证明的，本文公开的抗4-1bb抗体显示出4-1bb结合能力，与细胞表面表达的4-1bb的结合能力以及高的4-1bb结合亲和力。另外，如在实验例中所证明的，例如，当与本文公开的抗pd-l1抗体结合时，本公开的抗4-1bb抗体能够活化t细胞。此外，如实验例所证明的，本文公开的抗4-1bb抗体增加了体内抗肿瘤作用。这些抗4-1bb抗体可用于治疗目的，例如治疗各种类型的癌症等，并且还可用于诊断和预后目的。本发明公开了与4-1bb蛋白的胞外结构域或其抗原结合片段特异性结合的抗体。抗体是包含本文公开的一个或多个互补决定区或位点(cdr)的多肽。在一些实施方式中，cdr包含在“骨架”区域中，并且骨架朝向cdr，使得该cdr可以具有合适的抗原结合特性。该抗体与人和小鼠来源的4-1bb胞外结构域特异性结合，并且可以与细胞表面上表达的分离形式的胞外结构域或4-1bb胞外结构域特异性结合。本文公开的抗体与4-1bb结合，特别是与人4-1bb和小鼠4-1bb结合。本文公开的抗体可以特异性结合至源自人或小鼠的细胞表面上表达的4-1bb胞外结构域或4-1bb，因此可以有效地用于靶向4-1bb的癌症的靶向治疗。例如，通过结合抗体和抗癌剂，可将其用于治疗特定癌症。另外，由于它与小鼠4-1bb结合，可以通过小鼠实验来确认目标毒物，并且可以使用过表达小鼠4-1bb的小鼠癌细胞系通过同系模型来确认体内功效，从而可以有效地用于开发与4-1bb有关的各种药物。在一种实施方式中，抗体包括单克隆抗体、双特异性抗体、双抗体、多特异性抗体、多抗体、微型抗体、结构域抗体、抗体模拟物(或合成抗体)、嵌合抗体、或抗体融合体(或抗体缀合物)及其片段，但不限于此，并且抗体包括本文公开的各种形式的抗体。在一种实施方式中，本文公开的抗体的抗体片段可以是fab，fab'，f(ab')2，scfab，fv，dsfv，scfv，scfv-fc，微型抗体，双抗体，scab或dab。在其他实施方式中，本文公开的抗体可以由包含表2a和表2b中公开的可变区的仅轻链或仅重链的多肽组成。本文公开的一种抗体与本文公开的另一种抗体共享特定区域或序列。在一种实施方式中，它可以共享抗体或抗原结合片段的恒定区。在另一种实施方式中，它可以共享fc区。在另一种实施方式中，它可以共享可变区的骨架。在一种实施方式中，该抗体具有自然界中发现的抗体的典型结构。骆驼科动物产生由单个重链组成的抗体，但该抗体的结构单元通常包含四聚体多肽，并且四聚体包含两个由不同的2个多肽链组成的一对多肽链体。在典型的抗体中，一对多肽链体包含一条全长轻链(约25kda)和一条全长重链(约50至70kda)。每条链显示出特征性的折叠模式，并且由数个由约90至110个氨基酸组成的免疫球蛋白结构域组成。这些结构域是由抗体多肽组成的基本单元。每条链的氨基末端部分通常包含作为识别抗原部分的被称为可变区或v区的部分。羧基末端部分在进化上比氨基末端更保守，并且它包含被称为恒定区或c区的部分。人轻链通常分类为κ和λ轻链，它们分别包含一个可变区和一个恒定区。重链通常分类为μ、δ、γ、α或ε链，这些分别定义为igm、igd、igg、iga和ige同种型。igg包括igg1、igg2、igg3和igg4，但具有无限多种亚型。igm亚型包括igm和igm2。iga亚型包括iga1和iga2。在人类中，iga和igd同种型包含4条重链和4条轻链；igg和ige同种型包含2条重链和2条轻链，igm同种型包含5条重链和5条轻链。重链恒定区通常显示效应子功能，但包含一个或多个结构域。重链恒定区结构域的数量根据同种型而不同。例如，igg重链包含分别称为ch1、ch2和ch3的3个c区。本文公开的抗体可以是这些同种型和亚型中的任何一种。在一种实施方式中，该抗体是igg1、igg2a、igg2b、igg3或igg4亚型。在另一种实施方式中，本发明的抗体是igg1型或igg2型。在另一种实施方式中，本发明的抗体是igg1型。重链可变区和轻链可变区可以与人恒定区的至少一部分连接。恒定区的选择可以通过是否部分地需要抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用和/或补体依赖性细胞毒性来确定。例如，人同种型igg1和igg3具有补体依赖性细胞毒性，人同种型igg2和igg4不具有这种细胞毒性。此外，人igg1和igg3比人igg2和igg4诱导更强的细胞介导的效应子功能。轻链恒定区可以是λ或κ。在一种实施方式中，该抗体可以是人源化抗体或人抗体，并且重链恒定区可以是igg1、igg2、igg3或igg4型。在另一种实施方式中，本发明的抗体是igg1型或igg2型。在其他实施方式中，该抗体是人源化抗体或人抗体，并且特异性识别小鼠4-1bb。在全长轻链和重链中，可变区和恒定区通过长度为约12个或更多个氨基酸的“j”区连接，并且重链还包含约10个或更多个氨基酸的“d”区。通常，抗体的轻链/重链对的可变区形成抗原结合位点。免疫球蛋白链的可变区通常具有相同的总体结构，并且包含由称为“互补决定位点或区或结构域”或cdr(互补决定区)的3个高变区连接的相对保守的骨架区(fr)。衍生自由重链/轻链对组成的每条链的可变区的cdr通常根据骨架区排列，从而形成与靶蛋白(4-1bb)的特定表位特异性结合的结构。天然存在的轻链和重链区的这些因子通常以如下顺序从n端到c端而被包含：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。可变区中对应于它们中的每一个的氨基酸序列的位置可以通过kabat(kabat等人,(1983)美国卫生与公众服务部,“具有免疫学意义的蛋白质序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)”)、chothia(chothia和lesk,j.mol.biol.196:901-917(1987))或与opal文库相关的方法(hyeyoungyang等人,2009mol.cells27:225)来确定。当彼此比较时，由每个定义确定的cdr可以是重叠的子集或一个包含另一个的子集。然而，本文中，通过每种方法定义的所有cdr都被包括在本发明的范围内。当提供抗体的可变区的序列时，本领域技术人员将通过它们中的每个定义而容易地选择cdr序列。在一种实施方式中，抗4-1bb抗体或其片段能够对人4-1bb蛋白具有特异性。抗4-1bb抗体或其片段可包含：(i)cdr-h1，其包含选自由seqidno:1、2和3组成的组中的氨基酸序列；(ii)cdr-h2，其包含选自由seqidno:4、5和6组成的组中的氨基酸序列；(iii)cdr-h3，其包含选自由seqidno:7、8、9、10和11组成的组中的氨基酸序列；(iv)vlcdr1，其包含seqidno:12或13的氨基酸序列；(v)vlcdr2，其包含seqidno:14或15的氨基酸序列；和(vi)vlcdr3，其包含seqidno:16或17的氨基酸序列。在具体实施方式中，抗4-1bb抗体或其片段可包含：(a)seqidno:1的cdr-h1、seqidno:4的cdr-h2、seqidno:7的cdr-h3、seqidno:12的vlcdr1、seqidno:14的vlcdr2、和seqidno:16的vlcdr3；(b)seqidno:1的cdr-h1、seqidno:4的cdr-h2、seqidno:8的cdr-h3、seqidno:12的vlcdr1、seqidno:14的vlcdr2、和seqidno:16的vlcdr3；(c)seqidno:1的cdr-h1、seqidno:4的cdr-h2、seqidno:9的cdr-h3、seqidno:12的vlcdr1、seqidno:14的vlcdr2、和seqidno:16的vlcdr3；(d)seqidno:2的cdr-h1、seqidno:5的cdr-h2、seqidno:10的cdr-h3、seqidno:12的vlcdr1、seqidno:14的vlcdr2、和seqidno:16的vlcdr3；或(e)seqidno:3的cdr-h1、seqidno:6的cdr-h2、seqidno:11的cdr-h3、seqidno:13的vlcdr1、seqidno:15的vlcdr2、和seqidno:17的vlcdr3。在非限制性实施方式中，抗4-1bb抗体或其抗原结合片段可以包含：包含seqidno:40的氨基酸序列作为h-fr1的多肽；包含seqidno:41的氨基酸序列作为h-fr2的多肽；包含seqidno:42、43、44或45的氨基酸序列作为h-fr3的多肽；包含seqidno:46的氨基酸序列作为h-fr4的多肽；包含seqidno:47、48或49的氨基酸序列作为l-fr1的多肽；包含seqidno:50或51的氨基酸序列作为l-fr2的多肽；包含seqidno:52或53的氨基酸序列作为l-fr3的多肽；和/或包含seqidno:54或55的氨基酸序列作为l-fr4的多肽。在非限制性实例中，抗4-1bb抗体或其片段可包含：(1)重链可变区，其包含如下的多肽或基本上由如下的多肽组成，该多肽包含选自由seqidno:18、19、20、21、22、23、39、57、58、59和60组成的组中的氨基酸序列，或该多肽与上述氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；和/或(2)轻链可变区，其包含如下的多肽或基本上由如下的多肽组成，该多肽包含选自由seqidno:24、25、26、61和62组成的组中的氨基酸序列，或该多肽与上述氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在非限制性实例中，抗4-1bb抗体可包含：(1)重链，其包含如下的多肽或基本上由如下的多肽组成，该多肽包含选自由seqidno:27、28、29、30、31和32组成的组中的氨基酸序列，或该多肽与上述氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；和/或(2)轻链，其包含如下的多肽或基本上由如下的多肽组成，该多肽包含选自由seqidno:33、34和35组成的组中的氨基酸序列，或该多肽与上述氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。本公开的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或性质。例如，抗体可以与人4-1bb结合并且可以与来自某些其他物种(例如食蟹猴，恒河猴)的4-1bb(例如猴子4-1bb)结合，但可以基本上不与来自某些其他物种的4-1bb(例如小鼠4-1bb)结合。优选地，本公开的抗体以高亲和力结合人4-1bb。可以使用本领域充分建立的一种或多种技术来评估本公开的抗体或其抗原结合片段与4-1bb的结合。例如，在优选实施方式中，可以通过流式细胞术测定来测试抗体，其中该抗体与表达人4-1bb的细胞系发生反应，所述细胞系例如已被转染以在其细胞表面表达4-1bb(例如人4-1bb或猴4-1bb(例如恒河猴或食蟹猴4-1bb)或小鼠4-1bb)的cho细胞。用于流式细胞术测定的其他合适的细胞包括表达天然4-1bb的抗cd3刺激的cd4+活化t细胞。其他合适的结合测定包括elisa测定，例如使用重组4-1bb蛋白进行的elisa测定。另外地或可替代地，可以在octet分析中测试抗体的结合，包括结合动力学(例如，kd值)。本公开的抗体的优选结合亲和力包括解离常数或kd为1×10-6m或更小，1×10-7m或更小或1×10-8m或更小，例如1.01×10-9m或更小的结合亲和力。此外，本公开的抗体，特别是当以双特异性抗体的形式构建时，具有增强免疫细胞增殖、存活、细胞因子分泌和cd8t细胞的细胞溶解活性的能力。在某些实施方式中，包含本公开的抗体和抗pd-l1抗体的双特异性抗体与人4-1bb结合并表现出活化t细胞的能力。该抗体刺激免疫应答的其他能力包括该抗体抑制肿瘤生长的能力，例如在体内肿瘤移植模型中抑制肿瘤生长的能力。在一些实施方式中，抗4-1bb抗体或其片段进一步包含重链恒定区(例如，seqidno:36)、轻链恒定区(例如seqidno:37或38)、fc区、或其组合。在一些实施方式中，轻链恒定区可以是κ或λ链恒定区。在一些实施方式中，抗体是igg、igm、iga、ige或igd的同种型，例如人igg、人igm、人iga、人ige或人igd。在一些实施方式中，同种型可以是igg，例如人igg，例如igg1、igg2、igg3或igg4。在一些实施方式中，片段(抗pd-l1抗体的抗原结合片段)可以是包含抗体的重链cdr和/或轻链cdr的任何片段，例如，所述片段可以选自由以下组成的组：fab，fab'，f(ab')2，fd(包含重链可变区和ch1结构域)、fv(重链可变区和/或轻链可变区)、单链fv(scfv；以任何顺序包含以下或基本上由以下组成：重链可变区和轻链可变区以及重链可变区和轻链可变区之间的肽接头)、单链抗体、二硫键连接的fv(sdfv)等。抗4-1bb抗体或其片段是嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体，但不限于此。一方面，抗体或其片段不是天然存在的，或不是化学合成或重组合成的。假定这些抗体中的每种都可以结合4-1bb，例如人4-1bb，则cdr序列或vh和vl序列可以被“混合并匹配”以产生本公开的其他抗4-1bb结合分子。优选地，例如，当cdr序列或vh和vl链被混合并匹配时，将来自特定vh/vl配对的vh序列替换为结构相似的vh序列。同样，优选将来自特定vh/vl配对的vl序列替换为结构相似的vl序列。一种实施方式可以是编码双特异性抗体中的4-1bb抗体的多核苷酸。一种实施方式可以是编码呈igg-scfv形式的双特异性抗体的重链的多核苷酸。其他实施方式可以是编码呈igg-scfv形式的双特异性抗体的轻链的多核苷酸。igg-scfv形式可以指一种双特异性抗体，其包括靶向(结合至)两种抗原中的一种抗原的全长igg抗体和靶向(结合至)另一种抗原的scfv片段，其中scfv直接(无肽接头)或通过肽接头连接至全长igg抗体的c端和/或n端。在一种实施方式中，当igg-scfv形式的双特异性抗体包含针对称为x的某些抗原的全长igg抗体和针对4-1bb的scfv片段时，编码双特异性抗体的重链的多核苷酸可以编码针对x的全长igg抗体的重链和针对4-1bb的scfv片段，所述scfv片段直接或通过肽接头连接至全长igg抗体的c端和/或n端；并且编码双特异性抗体的轻链的多核苷酸可以编码针对x的全长igg抗体的轻链。在另一种实施方式中，当igg-scfv形式的双特异性抗体包含针对4-1bb的全长igg抗体和针对某些抗原(“x”)的scfv片段时，编码双特异性抗体的重链的多核苷酸可以编码针对4-1bb的全长igg抗体的重链和针对x的scfv片段，所述scfv片段直接或通过肽接头连接至全长igg抗体的c端和/或n端；并且编码双特异性抗体的轻链的多核苷酸可以编码针对4-1bb的全长igg抗体的轻链。代表性的实施方式(例如，抗pd-l1/抗4-1bb双特异性抗体)可以在图7中示出。抗4-1bb抗体或其抗原结合片段可以用于治疗和/或预防癌症和/或增强免疫应答。增强抗4-1bb抗体或其抗原结合片段的免疫应答可以指当处理(或施用)抗4-1bb抗体或其抗原结合片段时的免疫应答水平高于未处理(或未施用)抗4-1bb抗体或其抗原结合片段的情况。增强免疫应答可以是4-1bb信号活化、t细胞活化或两者。在一种实施方式中，癌症的实例可以包括包括血癌、肺癌、胃癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、结肠直肠癌、结肠癌、乳腺癌、子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、喉癌、小肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、少年期实体瘤、分化型淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊柱肿瘤、神经胶质瘤、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤，但不限于此。可以口服或肠胃外施用有效成分(例如抗4-1bb抗体、抗原结合片段等)或药物组合物。对于肠胃外施用，可以进行静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、内皮施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用和直肠内施用。由于口服施用导致蛋白质或肽被消化，因此可以将用于口服施用的组合物中的活性成分包衣或配制以防止在胃中消化。另外，可以使用使活性成分能够递送至靶细胞的任选装置来施用组合物。药学有效量的抗4-1bb抗体或其抗原结合片段可以以各种量来规定，这取决于诸如制备(配制)方法、施用方法、患者的年龄、体重、性别、病理状况和饮食、施用时间、施用间隔、施用途径、排泄速度和反应敏感性等因素。例如，抗4-1bb抗体或其抗原结合片段的日剂量可以为0.001至1000mg/kg，特别为0.01至100mg/kg，更特别为0.1至50mg/kg，甚至更特别地为0.1至20mg/kg，但不限于此。日剂量可以配制成单位剂型的单一制剂或配制成适当分开的剂型，或者可以被制造为容纳在多剂量容器中。药物组合物可以与其他药物联合施用，并且可以根据患者的状况对其他药物的剂量、施用方法和种类制定适当的处方。可以将药物组合物配制成油溶液或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆、乳剂、提取物、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式，并且可以进一步包含分散剂或稳定剂以用于配制。特别地，由于包含抗4-1bb抗体或其抗原结合片段的药物组合物包含抗体或其抗原结合片段，因此可以被配制为免疫脂质体。可以使用本领域广为人知的任何方法来制备包含抗体的脂质体。免疫脂质体可以是包含磷脂酰胆碱、胆固醇以及聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺的脂质组合物，并且可以通过反相蒸发法制备。例如，抗体的fab'片段可以通过二硫键交换反应与脂质体缀合。可以将抗4-1bb抗体或其抗原结合片段或药物组合物施用至期望进行诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者可以包括人类、家畜、农场动物以及动物园动物、运动动物，或宠物，例如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、家牛、乳牛等。另一种实施方式提供：编码重链互补决定区的多核苷酸、编码轻链互补决定区的多核苷酸或其组合；编码重链可变区的多核苷酸、编码轻链可变区的多核苷酸或其组合；或编码重链的多核苷酸、编码轻链的多核苷酸或其组合，其中互补决定区、重链和轻链可变区以及重链和轻链如上对抗-4-1bb抗体所述；携带多核苷酸或其组合的重组载体；和/或带有重组载体的重组细胞。在一种实施方式中，上述重组载体可在单个载体或在携带每种多核苷酸的分开的载体中包含：分别编码抗4-1bb抗体中的重链互补决定区和轻链互补决定区的多核苷酸；分别编码抗4-1bb抗体中的重链可变区和轻链可变区的多核苷酸；或分别编码抗4-1bb抗体中的重链和轻链的多核苷酸。术语“载体”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的工具，例如质粒载体、粘粒载体和病毒载体，例如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。重组载体可以由本领域常用的质粒(例如pcdna3.1、pcdna3.4、pcho1.0、psc101、pgv1106、pacyc177、cole1、pkt230、pme290、pbr322、puc8/9、puc6、pbd9、phc79、pij61、plafr1、phv14、pgex系列、pet系列和puc19)、噬菌体(例如λgt4λb、λ-charon、λδz1和m13)或通过操纵病毒(例如sv40等)来构建。在重组载体中，多核苷酸可以可操作地连接至启动子。术语“可操作地连接”旨在涉及在目的核苷酸序列与表达调节序列(例如，启动子序列)之间的功能性连接。当“可操作地连接”时，调节元件可以控制目的核苷酸的转录和/或翻译。通常可以将重组载体构建为克隆载体或表达载体。对于重组表达载体，可以使用本领域通常可用于在植物、动物或微生物细胞中表达外源蛋白质的载体。本领域熟知的各种方法可用于构建重组载体。为了在宿主如原核或真核细胞中使用，可以相应地构建重组载体。例如，当将载体构建为用于原核宿主中的表达载体时，该载体通常包括用于转录的强启动子(例如plκλ启动子、cmv启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、t7启动子等)，用于起始翻译的核糖体结合位点以及转录/翻译终止序列。另一方面，用于真核宿主的表达载体包括真核细胞中可操作的复制起点，例如f1复制起点、sv40复制起点、pmb1复制起点、腺病毒复制起点(adenooriginofreplication)、aav复制起点和bbv复制起点，但不限于此。另外，表达载体通常包括源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒启动子和hsv的tk启动子)以及作为转录终止序列的聚腺苷酸化序列。可以通过将重组载体导入合适的宿主细胞中来制备重组细胞。在本公开中可以使用本领域已知的任何宿主细胞，只要该细胞允许以稳定的方式顺序克隆和表达重组载体。可用于本公开的原核宿主细胞的实例包括大肠杆菌、芽孢杆菌属，例如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)，以及肠杆菌科菌株例如鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)和各种假单胞菌属物种。可用于转化的真核宿主细胞可包括但不限于啤酒酵母(saccharomycecerevisiae)、昆虫细胞和动物细胞，例如sp2/0、cho(中国仓鼠卵巢)、cho-k1、chodg44、cho-s、per.c6、w138、bhk、cos-7、293、hepg2、huh7、3t3、rin和mdck。可以使用本领域熟知的方法将核酸分子或携带该核酸分子的重组载体导入(转染)到宿主细胞中。当宿主细胞是原核细胞时，可以使用cacl2或电穿孔方法进行此转染。对于真核宿主细胞，可以使用但不限于显微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体介导的转染或颗粒轰击来实现基因导入。为了选择转化的宿主细胞，可以根据本领域熟知的方法利用与选择标记相关的表型。例如，当选择标记是赋予对特定抗生素抗性的基因时，宿主细胞可以在培养基中存在抗生素的情况下生长，从而选择了目的转化体。另一个方面提供了生产抗4-1bb抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在相关宿主细胞中表达多核苷酸或重组载体的步骤。在一种实施方式中，生产方法可包括培养携带有多核苷酸或重组载体的重组细胞，并任选地从培养基中分离和/或纯化抗体。[实施例]在下文中，将通过实施例详细描述本发明。以下实施例仅用于举例说明本发明，并不被解释为对本发明的限制。实施例1抗4-1bb单克隆抗体的制备1.1.筛选抗4-1bb的完整人类单克隆抗体为了淘选针对靶分子的每种噬菌体文库(获自kbiohealth和curebio)，使用4-1bb(ncbi登录号np_001552.2；seqidno:67)包被的免疫管进行共计4轮淘选。将来自3轮淘选的细菌菌落输出物在96深孔板中的sb-羧苄青霉素中生长直至混浊，此时将1011pfu的vcsm13辅助噬菌体添加到每个孔中。在37℃下轻轻摇动(80rpm)感染1小时后，添加70μg/ml卡那霉素，并将细胞在30℃下以200rpm摇动培养过夜。第二天，将板离心，并将含有噬菌体的上清液添加至用在pbst中的3％bsa溶液封闭的4-1bb抗原包被的elisa板中。在室温下温育1小时后，将板用pbst洗涤3次，并添加抗m13抗体。将板温育1小时，用pbst洗涤3次，并使用四甲基联苯胺(tmb)测量结合活性。扩增4-1bb特异性结合物以用于质粒dna测序。分析了ig轻链v基因(vl)和vh序列，以鉴定独特序列并确定序列多样性。尽管可以制备任何类型的igg形式，在表2-9中总结了所获得的igg4形式的4-1bb特异性抗体的序列：[表2]41b0141b01氨基酸序列(n'→c')重链seqidno:27重链可变区(vh)seqidno:18h-cdr1sydms(seqidno:1)h-cdr2wisysggsiyyadsvkg(seqidno:4)h-cdr3dgqrnsmrefdy(seqidno:7)轻链seqidno:33轻链可变区(vl)seqidno:24l-cdr1sgsssnignnyvt(seqidno:12)l-cdr2adshrps(seqidno:14)l-cdr3atwdyslsgyv(seqidno:16)[表3]41b01.0141b01.01氨基酸序列(n'→c')重链seqidno:28重链可变区(vh)seqidno:19h-cdr1sydms(seqidno:1)h-cdr2wisysggsiyyadsvkg(seqidno:4)h-cdr3daqrnsmrefdy(seqidno:8)轻链seqidno:33轻链可变区(vl)seqidno:24l-cdr1sgsssnignnyvt(seqidno:12)l-cdr2adshrps(seqidno:14)l-cdr3atwdyslsgyv(seqidno:16)[表4]41b01.0241b01.02氨基酸序列(n'→c')重链seqidno:29重链可变区(vh)seqidno:20h-cdr1sydms(seqidno:1)h-cdr2wisysggsiyyadsvkg(seqidno:4)h-cdr3daqrqsmrefdy(seqidno:9)轻链seqidno:33轻链可变区(vl)seqidno:24l-cdr1sgsssnignnyvt(seqidno:12)l-cdr2adshrps(seqidno:14)l-cdr3atwdyslsgyv(seqidno:16)[表5]41b01.03[表6]41b01.0441b01.04氨基酸序列(n'→c')重链seqidno:29重链可变区(vh)seqidno:20h-cdr1sydms(seqidno:1)h-cdr2wisysggsiyyadsvkg(seqidno:4)h-cdr3daqrqsmrefdy(seqidno:9)轻链seqidno:34轻链可变区(vl)seqidno:25l-cdr1sgsssnignnyvt(seqidno:12)l-cdr2adshrps(seqidno:14)l-cdr3atwdyslsgyv(seqidno:16)[表7]41b02[表8]41b02.0141b02.01氨基酸序列(n'→c')重链seqidno:31重链可变区(vh)seqidno:22h-cdr1gydms(seqidno:2)h-cdr2viypddgntyyadsvkg(seqidno:5)h-cdr3hggqkpttksssaygmdg(seqidno:10)轻链seqidno:34轻链可变区(vl)seqidno:25l-cdr1sgsssnignnyvt(seqidno:12)l-cdr2adshrps(seqidno:14)l-cdr3atwdyslsgyv(seqidno:16)[表9]41b031.2.抗4-1bb的scfv抗体的制备使用实施例1.1的表中所示的抗4-1bb的完整人单克隆抗体的可变区，制备具有(n’)-vl-接头-vh-(c’)结构的抗4-1bbscfv抗体，其中重链可变区的第44位的氨基酸残基“g”被“c”取代，轻链可变区的第103位的氨基酸残基“g”被“c”取代。scfv中从“g”到“c”的这种氨基酸取代可有助于增加包含scfv作为一个靶标特异性部分的双特异性抗体的稳定性。尽管下表示出了制备的抗4-1bbscfv的氨基酸序列，但本领域技术人员可以在以下实施方式中应用氨基酸序列的改变或修饰以满足特定目的，包括应用各种类型的肽接头，例如(ggggs)2、(ggggs)3、(ggggs)4或(gs)9。表10至15总结了获得的scfv形式的4-1bb特异性抗体的序列：[表10]41b01(scfv)氨基酸序列(n'→c')轻链可变区(vl)seqidno:61接头seqidno:56重链可变区(vh)seqidno:57[表11]41b01.01(scfv)氨基酸序列(n'→c')轻链可变区(vl)seqidno:61接头seqidno:56重链可变区(vh)seqidno:58[表12]41b01.03(scfv)氨基酸序列(n'→c')轻链可变区(vl)seqidno:62接头seqidno:56重链可变区(vh)seqidno:58[表13]41b01.04(scfv)氨基酸序列(n'→c')轻链可变区(vl)seqidno:62接头seqidno:56重链可变区(vh)seqidno:39[表14]41b02(scfv)氨基酸序列(n'→c')轻链可变区(vl)seqidno:61接头seqidno:56重链可变区(vh)seqidno:59[表15]41b02.01(scfv)氨基酸序列(n'→c')轻链可变区(vl)seqidno:62接头seqidno:56重链可变区(vh)seqidno:601.4.双特异性抗体形式的抗4-1bb的scfv抗体的制备作为双特异性抗体的代表性实例，制备了由以下重组件和轻组件组成的pd-l1x4-1bb双特异性抗体：(1)重组件(n’→c’)1)抗pd-l1抗体的重链：seqidno:63或seqidno:65，2)接头：seqidno:66(ggggsggggsggggs)，和3)实施例1.2中制备的抗4-1bbscfv、41b01(scfv)(表10)、41b01.01(scfv)(表11)、41b01.02(scfv)、41b01.03(scfv)(表12)或41b01.04(scfv)(表13)；和(2)轻组件(n’→c’)抗pd-l1抗体的轻链：seqidno:64。1.5.抗4-1bb抗体与人4-1bb的的抗原结合能力(1)通过elisa测量抗原结合为了评估抗原结合活性，将候选抗体进行elisa测试。简而言之，将微量滴定板用在pbs中的0.1μg/ml的人4-1bb-fc蛋白以100μl/孔的浓度在4℃下包被过夜，然后用100μl/孔的5％bsa封闭。将实施例1.1中获得的抗体的系列稀释液添加到每个孔中，并在室温下温育1至2小时。将板用pbs/吐温洗涤，然后与用辣根过氧化物酶(hrp)缀合的山羊抗人igg抗体在室温下温育1小时。洗涤后，将板用tmb底物显影，并通过分光光度计在od450至630nm处分析。所获得的结果在图1a-1c中显示。如图1a、1b和1c所示，测试的抗4-1bb抗体显示出高的4-1bb结合能力。(2)通过facs测量细胞结合为了评估抗原结合特性，通过facs分析了候选抗体与哺乳动物表达的4-1bb的结合。简而言之，将4-1bb-jurkat细胞与抗体(41b01和41b02)一起温育。用facs缓冲液(在pbs中的1％bsa溶液)洗涤后，将fitc-抗人igg抗体添加到每个孔中，并在4℃下温育1小时。fitc的mfi由facscaliber评估。如图2所示，所测试的抗4-1bb抗体显示出与在细胞表面表达的4-1bb的结合能力，并且可以有效地与在哺乳动物细胞上表达的4-1bb结合。如图2所示，测试的抗4-1bb抗体显示了与在细胞表面上表达的4-1bb的结合能力。(3)4-1bb的蛋白质动力学为了探索人源化抗体的结合动力学，本实施例通过使用octetred96进行了亲和力排名。如下表16所示，测试的抗4-1bb抗体显示出高的4-1bb结合亲和力。[表16]octet的4-1bb亲和力结果抗体kd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)chir241b011.80e-106.58e+051.19e-040.03920.998741b021.01e-095.95e+056.03e-040.05250.997341b037.90e-107.55e+055.97e-040.12130.9951(4)表位图谱进行了表位图谱以鉴定4-1bb抗体的独特表位。通过高通量流式细胞术筛选了突变的几乎所有4-1bb(ncbi登录号np_001552.2)的表面残基，以通过ranomics(多伦多，ca)对表位进行作图。gfp标签融合到4-1bb的c末端，并且4-1bb的胞外结构域(24-186)的每个表面残基都突变为arg。如果残基是arg，则其突变为glu。将突变的质粒汇合到文库中，并转染到hek293细胞系中。将得到的细胞系针对gfp和/或41b01/41b02结合进行分选。通过rnaseq分析分选的细胞池中每种突变体的类群。如果突变体显示在gfp池中的计数高于在gfp/抗-4-1bb池中的计数，则该突变位点被视为表位。表位残基在表17中列出：[表17]克隆4-1bb的表位残基(ncbi登录号np_001552.2)结构域41b01phe125,gly150,arg154,asp155,val157crd441b02trp136,thr137,leu147,gly150,arg154crd4图8a和8b显示了41b01克隆和41b02克隆的表位。在附图中，以分子表面表示将4-1bb蛋白显示为与4-1bb配体结合的带状(pdbid：6mgp)。球形中显示了针对抗4-1bb抗体在4-1bb中鉴定出的表位残基。如图所示，41b01和41b02结合至4-1bb的cdr4内的表位，该表位远离4-1bb内的4-1bbl的结合位点。因此，41b01和41b02不与4-1bbl竞争。这些观察结果与实施例1.5(5)竞争测定中的发现一致，即41b01和41b02不与4-1bbl竞争，而乌托鲁单抗(utomilulumab)与4-1bbl竞争。乌托鲁单抗还与41b01或41b02竞争。因为乌托鲁单抗与4-1bb的crd34(87-118)内的表位结合，所以4-1bb内的乌托鲁单抗的结合位点靠近并与4-1bbl、41b01或41b02的结合位点重叠。(5)竞争分析进行竞争测定以测试4-1bb抗体是否具有独特的表位。将96孔黑色微孔板(greinerbioone)安装在生物传感器托盘盒中，然后分别在8个孔中添加200μl1x动力缓冲液(kineticbuffer)(1xkb)。通过用缓冲液在孔中浸泡10分钟，将8种ni-nta生物传感器(fortebio，美国)水化。使用1xkb将分析物(41b01、41b02、乌瑞芦单抗、乌托鲁单抗、重组人41bb配体)稀释至100nm的浓度。将重组人41bb-his标签蛋白(sinobiological，10041-h08h)用1xkb缓冲液稀释至2μg/ml的浓度，然后用于在生物传感器上进行抗原固定。实验是根据表18通过对两种分析物的顺序缔合步骤进行的。根据octet程序模板，将1xkb添加到新的96孔黑色微孔板中。将生物传感器浸入200μl1xkb中以生成基线1，然后将生物传感器置于200μl的抗原，重组人41bbhis标签蛋白(2μg/ml)中，以将抗原固定在生物传感器上。在将生物传感器以1xkb200μl(基线2)重新水合后，将第一分析物(200μl)与生物传感器上的抗原缔合。随后，将第二分析物(200μl)与生物传感器上的分子缔合。实验板的温度控制在30℃。完成实验后，使用octetanalysis9.0软件评估第一分析物和第二分析物之间的交叉竞争。[表18]分析物清单运行编号第一分析物第二分析物1乌瑞芦单抗乌瑞芦单抗2乌瑞芦单抗41b02341b01乌瑞芦单抗4乌瑞芦单抗41b02541b02乌瑞芦单抗6乌托鲁单抗乌托鲁单抗7乌托鲁单抗41b01841b01乌托鲁单抗9乌托鲁单抗41b021041b02乌托鲁单抗1141b0141b011241b0141b021341b0241b011441b0241b0215重组人41bb-配体重组人41bb-配体16重组人41bb-配体41b011741b01重组人41bb-配体所获得的结果在图9a-12c中显示。图9a至9e显示了乌瑞芦单抗(urelumab)与候选物(41b01和41b02)之间的交叉竞争。在乌瑞芦单抗和两种候选物(41b01和41b02)之间进行竞争测定。重组人41bb-his标签蛋白首先被固定在生物传感器上。然后将第一抗体和第二抗体依次与生物传感器缔合，以检测两种抗体之间的结合竞争。总体而言，在乌瑞芦单抗和两种候选物之间未观察到结合竞争，表明每种抗体具有独特的表位。图9a显示了乌瑞芦单抗(对照)的自结合结果，图9b显示了乌瑞芦单抗作为第一抗体和41b01作为第二抗体的结果，图9c显示了41b01作为第一抗体和乌瑞芦单抗作为第二抗体的结果，图9d显示了乌瑞芦单抗作为第一抗体和41b02作为第二抗体的结果，图9e显示了41b02作为第一抗体和乌瑞芦单抗作为第二抗体的结果。图10a至图10e显示了乌托鲁单抗(utomilumab)与候选物(41b01和41b02)之间的交叉竞争。在乌托鲁单抗和两种候选物(41b01和41b02)之间进行竞争测定。重组人41bb-his标签蛋白首先被固定在生物传感器上。然后将第一抗体和第二抗体依次与生物传感器缔合，以检测两种抗体之间的结合竞争。总体而言，在乌托鲁单抗和两种候选物之间未观察到结合竞争，表明每种抗体具有独特的表位。图10a显示了乌托鲁单抗(对照)的自结合结果，图10b显示了乌托鲁单抗作为第一抗体和41b01作为第二抗体的结果，图10c显示了41b01作为第一抗体和乌托鲁单抗作为第二抗体的结果，图10d显示了乌托鲁单抗作为第一抗体和41b02作为第二抗体的结果，图10e显示了41b02作为第一抗体和乌托鲁单抗作为第二抗体的结果。图11a至图11d显示了41b01和41b02之间的交叉竞争。在两种候选物(41b01和41b02)之间进行竞争测定。重组人41bb-his标签蛋白首先被固定在生物传感器上。然后将第一抗体和第二抗体依次与生物传感器缔合，以检测两种抗体之间的结合竞争。总体而言，在41b01和41b02之间观察到结合竞争，表明这两种候选物具有针对41bb的相同表位。图11a显示了41b01的自结合的结果，图11b显示了41b01作为第一抗体的结果和41b02作为第二抗体的结果，图11c显示了41b02作为第一抗体的结果和41b01作为第二抗体的结果，图11d显示了41b02的自结合的结果。图12a至图12c显示了重组人41bb-配体与41b01之间的交叉竞争。在重组人41bb配体和41b01之间进行竞争测定。重组人41bb-his标签蛋白首先被固定在生物传感器上。然后将重组人41bb-配体和41b01与生物传感器依次缔合，以检测它们之间的结合竞争。总体而言，在重组人41bb-配体和41b01之间未观察到结合竞争，这表明与重组人41bb-配体相比，41b01具有与41bb的独特结合位点。图12a显示了重组人41bb-配体的自结合的结果，图12b显示了重组人41bb-配体作为第一抗体的结果和41b01作为第二抗体的结果，图12c显示了41b01作为第一抗体的结果和重组人41bb-配体作为第二抗体的结果。实施例2抗4-1bb抗体的活性(1)抗4-1bb抗体促进4-1bb信号的活性为了测试抗4-1bb抗体促进4-1bb信号的活性，使用了基于细胞的4-1bb测定。在该测定中，使用了gloresponsetmnfκb-luc2/4-1bbjurkat细胞系(promega，目录号cs196004)。将gloresponsetmnfκb-luc2/4-1bbjurkat细胞系遗传修饰以在响应元件下游稳定表达4-1bb受体和萤光素酶。抗体与4-1bb受体结合时诱导萤光素酶表达。简而言之，将25μl与抗人iggfc二抗交联的抗体(从500nm开始稀释5倍)添加到平板中。收获gloresponsetmnfκb-luc2/4-1bbjurkat细胞系，并且每孔分配50μlgloresponsetmnfκb-luc2/4-1bbjurkat细胞系，使得以每孔5x104个细胞铺板。在37℃+5％co2加湿培养箱中培养6小时。在温育期间，根据制造商的说明复原bio-glotm试剂。温育6小时后，将bio-glotm试剂每孔75添加到测定板上。等待5分钟，然后使用酶标仪测量发光。用graphpad软件进行四参数逻辑曲线分析。所获得的结果在图3中显示。如图3所示，测试的抗4-1bb抗体显示4-1bb激动活性。(2)抗4-1bb抗体促进人t细胞免疫应答的活性为了测试抗4-1bb抗体刺激人pbmc应答的能力，使用了细胞因子产生测定。使用人抗cd3抗体刺激的人pbmc作为效应细胞。使用不表达4-1bb的hcc-1954细胞作为靶细胞。在该系统中，在存在人抗cd3抗体的情况下，将pbmc(3×104个)与hcc-1954(1×104个)共培养。将抗4-1bb抗体(从100nm(＝15ug/ml)开始稀释10剂)和fc交联抗体(从500nm(＝75ug/ml)开始稀释10剂)添加到混合培养物中。所获得的结果在图4中显示。如图4所示，抗4-1bb抗体诱导细胞因子释放。(3)pd-l1x4-1bb抗体促进4-1bb信号的活性使用基于细胞的4-1bb测定测量了双特异性抗体形式的4-1bb抗体对4-1bb信号的促进。双特异性抗体pd-l1x4-1bb双特异性抗体由如下的重组件和轻组件组成：(1)重组件(n’→c’)1)抗pd-l1抗体的重链：seqidno:63，2)接头：seqidno:66(ggggsggggsggggs)，和3)在实施例1.2中制备的抗4-1bbscfv，41b01(scfv)(表10)或41b02(scfv)(表14)；和(2)轻组件(n’→c’)抗pd-l1抗体的轻链：seqidno:64。在该测定中，使用了gloresponsetmnfκb-luc2/4-1bbjurkat细胞系(promega，目录号cs196004)作为效应细胞，并且使用表达pd-l1或不表达pd-l1的癌细胞作为靶细胞。将gloresponsetmnfκb-luc2/4-1bbjurkat细胞系遗传修饰以在响应元件下游稳定表达4-1bb和萤光素酶。抗体与4-1bb受体结合时诱导萤光素酶表达。简而言之，将hcc1954(表达pd-l1)以每孔2.5x104个细胞在100μl培养基(rpmi1640+10％fbs)中在白色96孔测定板中铺板。在37℃+5％co2加湿培养箱中培养过夜。过夜培养后，除去100μl培养基，然后将25μl测定培养基(rpmi1640+1％fbs)分配到预铺板的靶细胞中。将25μl每种双特异性抗体(从15nm开始稀释8倍或从1.5nm开始稀释4倍)添加到板中。收获gloresponsetmnfκb-luc2/4-1bbjurkat细胞系并用测定培养基重悬。每孔分配25μlgloresponsetmnfκb-luc2/4-1bbjurkat细胞系，使得以每孔2.5x104个细胞铺板。在37℃+5％co2加湿培养箱中培养6小时。在温育期间，根据制造商的说明复原bio-glotm试剂。温育6小时后，将bio-glotm试剂每孔75添加到测定板上。等待5分钟，然后使用酶标仪测量发光。用graphpad软件进行四参数逻辑曲线分析。获得的结果如图5所示，其中41b01表示包含41b01(scfv)的pd-l1x4-1bb双特异性抗体，而41b02表示包含41b02(scfv)的pd-l1x4-1bb双特异性抗体。如图5所示，当以双特异性抗体(pd-l1x4-1bb双特异性抗体)的形式构建4-1bb抗体时，与单独应用的抗pd-l1单克隆抗体相比，测试的pd-l1x4-1bb双特异性抗体在存在肿瘤抗原(pd-l1)的情况下显示出更强的4-1bb信号活化。(4)抗4-1bb抗体的体内功效使用表达人4-1bb的胞外结构域的人源化小鼠。小鼠结肠腺癌细胞(mc38)被工程化以表达人pd-l1。向人源化小鼠(h4-1bb)皮下植入mc38-hpd-l1细胞。对小鼠以q3d共5次(每3天注射抗体，共五次)经腹腔施用以下抗体：人igg型对照(10mg/kg)和抗4-1bb抗体(41b01，10mg/kg)。在实验过程中，每周两次通过卡尺测量监测肿瘤体积，所得结果如图6所示。使用41b01的抗4-1bb抗体诱导的肿瘤生长抑制作用显著大于每种靶向单克隆抗体的组合所观察到的肿瘤生长抑制作用(参见图6)。如图6所示，与higg(对照)相比，抗4-1bb抗体具有增强的体内抗肿瘤作用。本公开不受限于所描述的具体实施方式的范围，所述具体实施方式旨在作为本公开的各个方面的单个说明，并且在功能上等同的任何组合物或方法均在本公开的范围内。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本公开的精神或范围的情况下，可以对本公开的方法和组合物进行各种修改和变化。因此，本公开旨在覆盖本公开的修改和变型，只要它们落入所附权利要求及其等同物的范围内。本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，其程度就好像每个单独的出版物或专利申请都被具体地和单独地指出通过引用并入一样。当前第1页12