1.一种包括多核苷酸的混合物的组合物，所述混合物包括：
含有成对的多核苷酸的第一池，其中所述第一池中的每对含有第一多核苷酸和第二多核苷酸；和
插入多核苷酸的第二池，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸包括在其5'端的与来自所述第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端互补的第一组装重叠序列和在其相对的3'端的与第二多核苷酸的5'端互补的第二组装重叠序列。
2.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括克隆载体，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端包括与所述克隆载体互补的序列。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中选择来自所述第一池的每一多核苷酸，使得除了所述第一池的所述成对的多核苷酸与所述第二池的所述插入多核苷酸之间、或所述第一池的所述成对的多核苷酸与所述克隆载体之间的设计的组装重叠序列之外，没有来自所述第一池的多核苷酸与来自所述第一池的超过指定的阈值的任何其他多核苷酸共享共同序列。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述指定的阈值为5至15个连续核苷酸。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的组合物，进一步包括聚合酶。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述聚合酶是链置换的或非链置换的。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述聚合酶是非链置换的，并且所述组合物进一步包括拥挤剂。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述拥挤剂是聚乙二醇(peg)。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述peg以约3％至约7％(重量/体积)的浓度使用。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述peg选自peg-200、peg-4000、peg-6000、peg-8000或peg-20,000。
11.根据权利要求6所述的组合物，其中所述聚合酶是链置换的，并且所述组合物进一步包括单链结合蛋白质。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述单链dna结合蛋白质是极端热稳定的单链dna结合蛋白质(etssb)、大肠杆菌reca、t7基因2.5产物、噬菌体λredb或rac前噬菌体rect。
13.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括5'-3'核酸外切酶。
14.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括连接酶。
15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一池中的每对是双链dna(dsdna)或单链(ssdna)。
16.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸是dsdna或ssdna。
17.根据权利要求1所述的组合物，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括对应于宿主细胞中的靶基因组基因座的序列。
18.根据权利要求1所述的组合物，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括对应于作为代谢途径的一部分的基因的编码序列。
19.根据权利要求1所述的组合物，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括对应于功能结构域或一或多种蛋白质的编码序列。
20.根据权利要求1所述的组合物，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在单个构建体中连接在一起，其中所述单个构建体包括用于所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸之间的一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列包括归巢核酸内切酶识别序列。
22.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸上的所述第一组装重叠序列和所述第二组装重叠序列包括分别与来自所述第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端互补的1或多个核苷酸。
23.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸上的所述第一组装重叠序列和所述第二组装重叠序列包括分别与来自所述第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端互补的约25个核苷酸。
24.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸包括位于所述第一组装重叠序列与所述第二组装重叠序列之间的一或多个有效负载序列。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述一或多个有效负载序列选自启动子、基因、调节序列、编码降解决定子的核酸序列、编码溶解度标签的核酸序列、终止子、唯一标识符序列或其部分。
26.根据权利要求17所述的组合物，其中所述第一池中的每对第一多核苷酸和第二多核苷酸包括与所述第一池中的每个其他对相比对应于宿主细胞中不同的靶基因组基因座的序列。
27.根据权利要求17所述的组合物，其中所述第一池中的每对第一多核苷酸和第二多核苷酸包括对应于宿主细胞中相同靶基因组基因座的序列。
28.根据权利要求24所述的组合物，其中所述第二池中的所述插入多核苷酸中的每个有效负载序列不同于所述第二池中的每个其他插入多核苷酸中的有效负载序列。
29.根据权利要求24所述的组合物，其中所述第二池中的所述插入多核苷酸中的每个有效负载序列与所述第二池中的每个其他插入多核苷酸中的有效负载序列相同。
30.一种用于生成多核苷酸的文库的方法，所述方法包括：
(a)组合多核苷酸的第一池和多核苷酸的第二池，其中所述第一池含有成对的多核苷酸，其中所述第一池中的每对含有第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述第二池含有插入多核苷酸，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸包括在其5'端的与来自所述第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端互补的第一组装重叠序列和在其相对的3'端的与第二多核苷酸的5'端互补的第二组装重叠序列；以及
(b)将所述第一池和所述第二池组装成多核苷酸的文库，其中所述文库中的每一多核苷酸包括来自所述第二池的插入多核苷酸和来自所述第一池的一对第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述组装通过体外克隆方法或体内克隆方法进行。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸上的所述第一组装重叠序列和所述第二组装重叠序列包括分别与来自所述第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端互补的1或多个核苷酸。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸上的所述第一组装重叠序列和所述第二组装重叠序列包括分别与来自所述第一池的一对多核苷酸中的第一多核苷酸的3'端和第二多核苷酸的5'端互补的约25个核苷酸。
33.根据权利要求30所述的方法，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在单个构建体中连接在一起，其中所述单个构建体包括用于所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸之间的一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列。
34.根据权利要求33所述的方法，其中用于一或多种位点特异性核酸酶的所述一或多个识别序列包括归巢核酸内切酶识别序列。
35.根据权利要求33所述的方法，其中通过经由剪接和重叠延伸pcr(soe-pcr)、限制连接、钝端连接、基于重叠的组装方法、基于重组的方法或连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的任何其他酶促或化学方法连接各个第一多核苷酸和第二多核苷酸，或通过直接合成单个构建体来产生连接的单个构建体。
36.根据权利要求30所述的方法，进一步包括在步骤(a)期间将克隆载体与所述第一池和所述第二池组合，其中，对于所述第一池中的每对，所述克隆载体的相对端包括与所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端互补的序列。
37.根据权利要求30所述的方法，进一步包括在步骤(a)之前将克隆载体与所述第一池组合，其中，对于所述第一池中的每对，所述克隆载体的相对端包括与所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端互补的序列。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述克隆载体和来自所述第一池的每对中的所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端包括用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列。
39.根据权利要求38所述的方法，进一步包括通过添加所述一或多个识别序列的一或多种位点特异性核酸酶，在所述克隆载体的相对端与来自所述第一池的每对中的所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端之间生成单链互补突出物。
40.根据权利要求39所述的方法，进一步包括连接所述克隆载体的所述相对端与来自所述第一池的每对中的所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端之间的所述单链互补突出物。
41.根据权利要求36或37所述的方法，其中步骤(b)产生环状产物，所述环状产物包括来自所述第二池的插入多核苷酸、来自所述第一池的一对的第一多核苷酸和第二多核苷酸以及所述克隆载体。
42.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述第一池通过从更大组的此类序列中选择成对的多核苷酸序列来生成，使得除了所述第一池的所述成对的多核苷酸与所述第二池的所述插入多核苷酸之间、或所述第一池的所述成对的多核苷酸与所述克隆载体之间的设计的组装重叠序列之外，没有来自所述第一池的多核苷酸与来自所述第一池的超过指定的阈值的任何其他多核苷酸共享共同序列。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述指定的阈值为5至15个连续核苷酸。
44.根据权利要求30所述的方法，其中所述组装是体外克隆方法，其中将所述第一池和所述第二池的混合物加热以使存在于所述第一池和所述第二池中的多核苷酸部分或完全变性，然后在组装之前被冷却至室温。
45.一种用于生成多核苷酸的文库的方法，所述方法包括：
(a)经由聚合酶链反应pcr扩增多核苷酸的第一池，其中所述第一池含有成对的多核苷酸，其中所述第一池中的每对含有第一多核苷酸和第二多核苷酸，并且其中一对中的每一个第一多核苷酸和每一个第二多核苷酸包括5'端和3'端，其中所述扩增将包括用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列的共同重叠序列引入到来自所述第一池的一对中的第一多核苷酸的5'端和第二多核苷酸的3'端上；
(b)通过利用共同重叠序列将来自所述第一池的每对第一多核苷酸和第二多核苷酸组装成单个核酸片段，其中每对的所述单个核酸片段包括由所述共同重叠序列从所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端分离的第一多核苷酸和第二多核苷酸，并且其中每对的所述单个核酸片段中的所述第一多核苷酸的3'端和所述第二多核苷酸的5'端位于所述单个核酸片段的相对末端上，远离一或多个位点特异性核酸酶识别序列；
(c)将每对的所述单个核酸片段与含有插入多核苷酸的第二池组合，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸包括在其5'端的与所述单个核酸片段中存在的所述第一多核苷酸的3'端互补的第一组装重叠序列和在其相对的3'端的与所述单个核酸片段中存在的所述第二多核苷酸的5'端互补的第二组装重叠序列；
(d)将所述第一池和所述第二池组装成环化的产物的第三池，其中所述组装经由体外或体内重叠组装方法进行，并且其中所述第三池中的每种环化的产物包括来自所述第二池的插入序列和来自所述第一池的一对第一多核苷酸和第二多核苷酸；
(e)经由一或多种位点特异性核酸酶的消化使所述第三池中的每种环化的产物线性化，所述位点特异性核酸酶识别位于所述第三池中的每种环化的产物中的所述第一多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列之间的一或多个位点特异性核酸酶识别序列；以及
(f)通过体外或体内克隆方法将线性化的产物组装到克隆载体中。
46.根据权利要求45所述的方法，其中位于所述第一多核苷酸序列与所述第二多核苷酸序列之间的所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列是归巢核酸酶识别序列。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中位于所述第一多核苷酸序列与所述第二多核苷酸序列之间的所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列的所述一或多种位点特异性核酸酶是归巢核酸内切酶。
48.根据权利要求45所述的方法，其中所述共同重叠序列包括至少1个核苷酸的组装重叠序列，并且步骤(b)中的组装通过基于重叠的dna组装方法进行。
49.根据权利要求45所述的方法，其中所述共同重叠序列包括10-25个核苷酸的组装重叠序列，并且步骤(b)中的组装通过基于重叠的dna组装方法进行。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述基于重叠的dna组装方法选自soe-pcr或体外重叠组装方法。
51.根据权利要求50所述的方法，其中存在于所述第一多核苷酸的5'端的所述共同重叠序列中的所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列与存在于每对中的所述第二多核苷酸的3'端的所述共同重叠序列中的所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列互补，并且其中在步骤(b)中利用每对中的所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的所述共同重叠序列需要进行soe-pcr。
52.根据权利要求45所述的方法，其中在步骤(b)中利用每对中的所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的所述共同重叠序列需要用一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶消化每对中的所述第一多核苷酸5'端和所述第二多核苷酸3'端上的所述共同重叠序列中存在的所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列，以在每对中的所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端生成包括互补序列的单链突出物；以及连接在每对中的所述第一多核苷酸的5'端和所述第二多核苷酸的3'端上的所述单链突出物上存在的互补序列。
53.根据权利要求45所述的方法，其中步骤(d)的所述组装使用基于重叠的dna组装方法进行。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述基于重叠的dna组装选自soe-pcr和体外重叠组装方法。
55.根据权利要求45所述的方法，其中每对中的所述单个核酸片段中的所述第一多核苷酸的3'端和所述第二多核苷酸的5'端包括一组附加的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，并且所述第二池中的每个插入多核苷酸中的所述第一组装重叠序列和所述第二组装重叠序列包括一或多个位点特异性核酸酶识别序列。
56.根据权利要求55所述的方法，其中步骤(d)中的组装需要用每对中的所述单个核酸片段中的所述第一多核苷酸的3'端和所述第二多核苷酸的5'端上的附加的一或多个位点特异性核酸酶识别序列以及来自所述第二池的每个插入多核苷酸中的所述第一组装序列和所述第二组装序列中存在的一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶消化每对中的所述单个核酸片段中的所述第一多核苷酸的3'端和所述第二多核苷酸的5'端上存在的附加的一或多个位点特异性核酸酶识别序列和来自所述第二池的每个插入多核苷酸中的所述第一组装序列和所述第二组装序列中存在的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，以在所述第一多核苷酸的3'端上生成包括与来自所述第二池的插入多核苷酸的所述第一组装序列的5'端上的单链突出物上存在的序列互补的序列的单链突出物和在所述第二多核苷酸的5'端上生成包括与来自所述第二池的相同插入多核苷酸的所述第二组装序列的3'端上的单链突出物上存在的序列互补的序列的单链突出物；以及连接所述单链突出物上存在的互补序列。
57.根据权利要求45所述的方法，其中步骤(f)的所述克隆载体包括一或多个位点特异性核酸酶识别序列。
58.根据权利要求57所述的方法，其中步骤(f)中的组装需要用所述克隆载体中存在的所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列的所述一或多种位点特异性核酸酶消化所述克隆载体中的一或多个位点特异性核酸酶识别序列，其中所述消化在所述克隆载体的相对端上生成单链突出物，其中所述克隆载体的所述相对端的一个上的所述单链突出物包括与步骤(e)中生成的所述线性化的产物的端互补的序列，并且所述克隆载体的所述相对端的另一个上的所述单链突出物包括与步骤(e)中生成的所述线性化的产物的相对端互补的序列；以及连接所述克隆载体的所述单链突出物上存在的互补序列和来自步骤(e)的所述线性化的产物。
59.根据权利要求45所述的方法，其中所述第一池通过从更大组的此类序列中选择成对的多核苷酸序列来生成，使得除了所述第一池的所述成对的多核苷酸与所述第二池的所述插入多核苷酸之间、或所述第一池的所述成对的多核苷酸与所述克隆载体之间的设计的组装重叠序列之外，没有来自所述第一池的多核苷酸与来自所述第一池的超过指定的阈值的任何其他多核苷酸共享共同序列。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述指定的阈值为5至15个连续核苷酸。
61.根据权利要求45所述的方法，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸上的所述第一组装重叠序列和所述第二组装重叠序列包括与所述单个核酸片段的所述相对末端互补的1或多个核苷酸。
62.根据权利要求45所述的方法，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸上的所述第一组装重叠序列和所述第二组装重叠序列包括与所述单个核酸片段的所述相对末端互补的约25个核苷酸。
63.根据权利要求30或45所述的方法，其中，在步骤(a)之前，通过将含有来自成对的多核苷酸的每一个第一多核苷酸的混合物与含有来自成对的多核苷酸的每一个第二多核苷酸的混合物组合来生成多核苷酸的所述第一池。
64.根据权利要求30或45所述的方法，其中所述第一池中的每对是双链dna(dsdna)或单链dna(ssdna)。
65.根据权利要求30或45所述的方法，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸是dsdna或ssdna。
66.根据权利要求30或45所述的方法，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括对应于宿主细胞中的靶基因组基因座的序列。
67.根据权利要求30或45所述的方法，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括对应于作为代谢途径的一部分的基因的编码序列。
68.根据权利要求30或45所述的方法，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括对应于功能结构域或一或多种蛋白质的编码序列。
69.根据权利要求30或45所述的方法，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸包括位于所述第一组装重叠序列与所述第二组装重叠序列之间的一或多个有效负载序列。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述一或多个有效负载序列选自启动子、基因、调节序列、编码降解决定子的核酸序列、编码溶解度标签的核酸序列、终止子、唯一标识符序列或其部分。
71.根据权利要求66所述的方法，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括与所述第一池中的每个其他对相比对应于宿主细胞中不同的靶基因组基因座的序列。
72.根据权利要求66所述的方法，其中，对于所述第一池中的每对，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括对应于宿主细胞中相同靶基因组基因座的序列。
73.根据权利要求69所述的方法，其中所述第二池中的所述插入多核苷酸中的每个有效负载序列不同于所述第二池中的每个其他插入多核苷酸中的有效负载序列。
74.根据权利要求69所述的方法，其中所述第二池中的所述插入多核苷酸中的每个有效负载序列与所述第二池中的每个其他插入多核苷酸中的有效负载序列相同。
75.根据权利要求30或45所述的方法，其中所述第二池中的每个插入多核苷酸通过以下生成：
(i)对包括所述有效负载序列、正向引物和反向引物的混合物进行聚合酶链反应(pcr)，其中所述正向引物自5'至3'包括与所述有效负载序列互补的一或多个核苷酸的短段、所述第一组装重叠序列、用于一或多种位点特异性核酸酶的一或多个识别序列、所述第二组装重叠序列和与所述有效负载序列互补的一或多个核苷酸的第二段，并且其中所述反向引物包括与所述有效负载序列或与所述有效负载序列下游的其他序列互补的序列，其中所述pcr生成pcr产物，所述pcr产物自5'至3'包括与所述有效负载序列互补的核酸的短段、所述第一组装重叠序列、所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列、所述第二组装重叠序列和所述有效负载序列；
(ii)经由选自由剪接和重叠延伸pcr(soe-pcr)、限制性连接、钝端连接、基于重叠的组装方法和基于重组的方法组成的群组的组装方法，或连接两个dna分子的任何其他酶促或化学方法，使所述pcr产物环化；以及
(iii)用识别所述一或多个位点特异性核酸酶识别序列的一或多种位点特异性核酸酶使所述环化的pcr产物线性化，从而生成多核苷酸的所述第二池。
76.根据权利要求20所述的组合物，其中所述位点特异性核酸酶是限制性核酸内切酶、iis型核酸内切酶、归巢核酸内切酶、rna导向的核酸酶、dna导向的核酸酶、锌指核酸酶、talen或切口酶中的一或多种。
77.根据权利要求33或45所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶是限制性核酸内切酶、iis型核酸内切酶、归巢核酸内切酶、rna导向的核酸酶、dna导向的核酸酶、锌指核酸酶、talen或切口酶中的一或多种。