非生物胁迫耐受性植物及其方法与流程

1.本发明涉及植物育种和遗传育种，特别是涉及到提高植物对非生物胁迫的耐受性。
技术背景
2.植物的胁迫可以是有生物的和非生物的因素引起的。例如，生物引发的胁迫包括病菌的感染、昆虫的取食，另一种植物的寄生如榭寄生。非生物胁迫包括，如过量的或不足的可用水、极端温度、和化学合成品如除草剂。
3.非生物胁迫是造成全球作物损失的主要原因，导致主要作物的平均产量损失超过50％(boyer，j.s.(1982)science 218:443-448；bray，e.a.等(2000)in biochemistry and molecular biology of plants，由buchanan和b.b.等人编辑，amer.soc.plant biol.，第1158-1249页)。
4.因此，需要开发增加植物对非生物胁迫耐受性的组合物和方法。本发明提供了这样的组合物和方法。
5.发明概述
6.以下实施例属于本公开发明所涵盖的实施例：
7.在一个实施例中，本公开发明提供了包含有至少一个异源调控元件可操作地连接一个抑制元件的抑制dna构建体，其中所述抑制元件减少了一种内源性靶向多核苷酸的表达，所述内源性靶向多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152序列有至少90％的序列一致性。在某些实施例中，所述抑制元件包括编码多肽的多核苷酸的至少100个连续碱基对，该多肽含有的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152有至少90％的序列一致性。在某些实施例中，所述抑制元件含有的多核苷酸序列为seq id no:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149或151。
8.本公开发明还提供了一种含有至少一个异源调控序列可操作地连接grna的crispr/cas构建体，其中所述grna被靶向一个包含有dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1基因和/或其调控元件的基因组区域以减少这些内源性多肽dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1的表达或活性。在某些实施例中，所述内源性基因编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、
92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152有至少90％的一致性。在某些实施例中，dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1这些基因包含的多核苷酸的核苷酸序列为seq id no:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149或151，或其包含1个到10个核苷酸改变的等位基因。
9.本公开发明进一步提供了一个改良的植物或种子，能够降低内源性dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1等多肽的表达或活性。在某些实施例中，所述改良的植物或种子包含有抑制dna构建体，该抑制dna构建体含有至少一个异源调控元件可操作地连接抑制元件，其中所述抑制元件减少了内源性dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1等多肽的表达或活性。在某些实施例中，所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152有至少90％的序列一致性。在某些实施例中，所述抑制元件包含有多核苷酸的至少100个连续碱基对，该多核苷酸的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152有至少90％的序列一致性。在某些实施例中，所述抑制元件包含的多核苷酸序列为seq id no:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149或151。
10.在某些实施例中，所述改良的植物或种子在其基因组位点上包含一个靶向基因修饰，该基因组位点含有一个编码dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1等多肽的多核苷酸，其中所述靶向基因修饰减少了该多肽的表达量和/或活性。在某些实施例中，所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152有至少90％的序列一致性。
11.在某些实施例中，所述改良的植物或种子表现出至少一种选自以下的表型：耐旱性的增加、籽粒产量的增加、或非生物胁迫耐性的增加。在某些实施例中，所述的具有能够降低dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1这些多肽的表达量和/或活性的改良植物或种子可以增加耐旱性、提高籽粒产量和/或增加非生物胁迫耐性。
12.在某些实施例中，本文中所述方法和组合物的植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、小米、甘蔗和柳枝稷。
13.还提供了一种增加植物耐旱性的方法，所述方法包括减少至少一种多核苷酸的表
达量和/或活性，所述多核苷酸编码植物中的dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1多肽。在某些实施例中，所述多肽含有的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152有至少80％的序列一致性。
14.在某些实施例中，所述增加耐旱性的方法包括：(a)向一个可再生的植物细胞引入一个抑制dna构建体，其中所述抑制dna构建体包含至少一个异源调控元件可操作地连接抑制元件；(b)从可再生植物细胞再生一个改良植物，其中所述植物包含该抑制dna构建体。在某些实施例中，所述抑制元件减少了一个内源靶向多核苷酸的表达，所述多核苷酸的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152有至少90％的序列一致性。在某些实施例中，所述抑制元件包含有多核苷酸的至少100个连续碱基对，该多核苷酸的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152有至少90％的序列一致性。在某些实施例中，所述抑制元件包含的多核苷酸为seq id no:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149或151。
15.在某些实施例中，所述增加耐旱性的方法包括：(a)向一个可再生植物细胞的基因组位点上引入一个靶向基因修饰，该基因组位点包含有编码dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1等多肽的多核苷酸；和(b)再生所述植物，其中该植物在其基因组中包含有一个引入的基因修饰并能减少所述多肽的表达和/或活性。在某些实施例中，所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152相比较有至少80％的序列一致性。在某些实施例中，所述靶向基因修饰可以使用选用以下的基因组修饰技术引入：多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(talen)、工程位点特异性巨核酸酶或argonaute。在某些实施例中，所述靶向基因修饰存在于基因组位点的(a)编码区域；(b)非编码区域；(c)调控序列；(d)非翻译区；或(e)任何(a)-(d)的组合，所述基因组位点编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152相比较时有80％的序列一致性。
16.在某些实施例中，所述靶向基因修饰通过包含有至少一个异源调控序列可操作地连接grna的crispr/cas构建体引入，其中所述grna是靶向dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1等基因和/或其调控元件。
17.附图说明及序列表
18.要全面理解本公开的内容，详见以下详细说明以及构成本技术组成部分的附图和序列列表。本附件中的序列描述和序列列表符合37c.f.r.
§§
1.821和1.825中规定的专利申请中核苷酸和氨基酸序列披露的规则。序列描述包括37c.f.r.
§§
1.821和1.825中定义的氨基酸的三个字母代码，其通过引用并入本文。
19.表1.序列表详述
[0020][0021]
[0022][0023]
详细描述
[0024]
本发明所述的每个参考文献的公开内容都作为引用并入本文。
[0025]
在本文中和所附的权利要求中，“一个”、“一种”“所述”包括复数引用，除非文中另有明确规定。例如，“植物”是指多个这样的植物；“细胞”包括本领域技术人员已知的一个或多个细胞及其它对应物，以此类推。
[0026]
定义
[0027]
在本文中，植物的“增加的耐旱性”是指在干旱条件下生长时相对于参照或对照植物测量的生理或物理特征(例如产量)的任何可测量的改善。通常，当在其基因组中包含重组dna构建体或dna修饰的植物相对于参照或对照植物表现出增加的耐旱性时，参照或对照植物在其基因组中不包含重组dna构建体或dna修饰。
[0028]“农艺性状”是一个可测量的参数，包括但不限于：绿色的量、籽粒产量、生长速率、总生物量或积累速率、成熟期鲜重、成熟期干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实总氮含量、种子总氮含量、营养组织中的氮含量、植物游离氨基酸总含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织中游离氨基酸含量、植物总蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量、耐旱性、氮吸收、根系倒伏、收获指数、茎秆倒伏、株高、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、穗大小、早幼活力和低温下幼苗出苗。
[0029]“转基因”是指任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，其基因组因异源核酸(例如重组dna构建体)的存在而改变，包括那些最初的转基因事件以及由最初的转基因事件通过性杂交或无性繁殖产生的事件。本文使用的术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(例如随机交叉受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化)改变基因组(染色体或染色体外)、非重组转座或自发突变。
[0030]“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到目的基因。例如，对照植物可以是具有与测试植物相同的遗传背景的植物，二者的差别只在于测试植物或细胞发生了遗传改变。
[0031]“植物”包括植物整株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。
[0032]“子代”包括植物的任何后续世代。
[0033]“改良植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸或修饰的基因或启动子的植物。例如异源多核苷酸能够稳定地整合进基因组中，并遗传连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组dna构建体的部分整合进基因组中。
[0034]
针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因位点的显著改变的序列。
[0035]“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链rna或dna聚合物。核苷酸(通常以它们的5
′‑
单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“a”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应rna或dna)，“c”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“g”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“u”表示尿苷酸，“t”表示脱氧胸苷酸，“r”表示嘌呤(a或g)，“y”表示嘧啶(c或t)，“k”表示g或t，“h”表示a或c或t，“i”表示肌苷，并且“n”表示任何核苷酸。
[0036]“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和adp-核糖基化。
[0037]“重组dna构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组dna构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
[0038]“调控元件”指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、rna加工或稳定性、或者相关核苷酸序列的翻译。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”以及“调控区域”在本文中可互换使用。
[0039]“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。“植物中有功能启动子”是能够控制植物细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
[0040]“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
[0041]“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如转录生成mrna或功能rna)和/或rna翻译成前体或成熟蛋白质。
[0042]
在本文中，“增加的”、“增多的”等是指与对照组(例如，不包含dna修饰的野生型植物)相比，实验组(例如，具有本文所述的dna修饰的植物)中任何可检测到的增加。因此，蛋白质表达的增加包括样品中蛋白质总水平的任何可检测出的增加，可以使用本领域的常规方法如western印迹和elisa来确定。
[0043]
在本文中，“产量”是指每单位土地收获的农作物产品的量，并且可以包括指根据谷物收获时经过水分调整后每英亩或每公斤作物的蒲式耳(例如，通常为玉米15％，大米13.5％)。谷物水分是在收获时的谷物中测量的。调整后的谷物测试重量确定为每蒲式耳磅数或每株植物克数的重量，根据收获时的谷物水分水平进行调整。
[0044]“抑制dna构建体”是重组dna构建体，当其转化或稳定整合到植物的基因组中时能导致植物中靶基因的“沉默”。靶基因可以是植物的内源或转入的基因。
[0045]
本文所用的关于靶基因“沉默”通常是指抑制靶基因表达的mrna或蛋白质/酶的数量，和/或酶活性或功能蛋白质的数量。术语“抑制”，“抑制”和“沉默”在本文可互换使用，还包括降低、减少、下降、减少、抑制、消除或预防。
[0046]
抑制dna构建体在本领域中是众所周知的，并且一旦选择目的靶基因就可以容易地构建，包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、产生双链rna的构建体、更一般地、rnai(rna干扰)构建体和小rna构建体、例如sirna(短干扰rna)构建体和mirna(microrna)构建体。
[0047]“反义抑制”是指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的反义rna转录物。“共抑制”是指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的正义rna转录物。“正义”rna是指包含mrna的rna转录本，可以在细胞内或体外翻译成蛋白质。另一种变体描述了使用植物病毒序列来指导抑制近端mrna编码序列(1998年8月20日发表的pct出版物no.wo 98/36083)。
[0048]
rna干扰(rnai)是指由短干扰rna(sirna)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(fire等，nature 391:806(1998))。植物中的相应过程通常称为转录后基因沉默
(ptgs)或rna沉默，真菌中称为平息(quelling)。转录后基因沉默的过程被认为是一种进化上保守的细胞防御机制，用于阻止外源基因的表达，并且通常由不同的植物群和门共享(fire等，trends genet.15:358(1999))。
[0049]
在本文中，在两个多核苷酸或多肽序列的背景下，“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比较窗口内比对以获得最大对应性时相同的两个序列中的残基。当序列同一性百分比用于蛋白质时，人们认识到不完全相同的残基位置往往因保守的氨基酸替代而有所不同，其中氨基酸残基被其他具有相似化学性质(如电荷或疏水性)的氨基酸残基所取代因此不会改变分子的功能特性。当序列在保守取代中不同时，可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性质。通过这种保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的手段对于本领域技术人员来说是众所周知的。通常，这涉及将保守取代评分为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，在相同氨基酸的得分为1且非保守取代的得分为零的情况下，保守取代的得分为零至1。例如，如在程序pc/gene(intelligenetics，mountain view，california)中实施的那样，计算保守取代的得分。
[0050]
在本文中，“序列同一性百分比”是通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数来计算的，以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100。
[0051]
除非另有说明，否则使用clustal v比对方法(higgins和sharp。(1989)cabios.5:151-153)以默认参数(间隙罚分＝10，间隙长度罚分＝10)。成对比对的默认参数和使用clustal v方法计算氨基酸序列的同一性百分比是ktuple＝1，空位罚分＝3，窗口＝5和保存对角线＝5。对于核酸，这些参数是ktuple＝2，空位罚分＝5，窗口＝4，保存对角线＝4。序列比对后，使用clustal v程序，可以通过查看同一程序上的“序列距离”表来获得“同一性百分比”和“差异”值；除非另有说明，本文提供和要求保护的百分比同一性和差异以这种方式计算
[0052]
组合物
[0053]
本公开发明提供了减少dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1等多肽表达和/或活性的构建体。
[0054]
一方面，所述多肽包含的氨基酸序列与seq id no:3(osdn-drt20)、seq id no:6(osein3-1)、seq id no:9(oscyp-1)、seq id no:12(osnac67-3)、seq id no:15(osdn-dtp21)、seq id no:18(ossip1)、seq id no:21(osdc1d1)、seq id no:24(ostns1)、seq id no:27(ossaur27)和seq id no:30(oship1)等任何氨基酸序列相比较时，有至少80％(如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的一致性。
[0055]“osdn-drt20”是一种过量表达时能赋予敏旱表型的水稻多肽。所述osdn-drt20多肽(seq id no:3)是由水稻基因位点loc_os02g51760.1上的编码序列(cds)(seq id no:2)或核苷酸序列(seq id no:1)编码的，其在tigr的注释为“表达蛋白”。“dn-drt20多肽”在本文是指osdn-drt20多肽及其来自于其它生物体的横向同源物(例如，seq id no:62由seq id no:61编码)或同源物，例如玉米(seq id no:64由seq id no:63编码)、高粱(seq id no:66由seq id no:65编码)、或大豆(seq id no:68由seq id no:67编码)。
no:119编码)或同源物，例如高粱(seq id no:122由seq id no:121编码)。
[0062]“ostns1”是一种过量表达时能赋予敏旱表型的水稻多肽。所述ostns1(seq id no:24)是由水稻基因位点loc_os01g49890.1上的编码序列(cds)(seq id no:23)或核苷酸序列(seq id no:22)编码的，其在tigr的注释为“苏氨酸合酶，叶绿体前体，推测，表达”。“tns1多肽”在本文是指ostns1多肽及其来自于其它生物体的横向同源物(例如，seq id no:124由seq id no:123编码)或同源物，例如玉米(seq id no:126由seq id no:125编码)、高粱(seq id no:128由seq id no:127编码)、拟南芥(seq id no:130由seq id no:129编码)或大豆(seq id no:132由seq id no:131编码)。
[0063]“ossaur27”是一种过量表达时能赋予敏旱表型的水稻多肽。所述ossaur27(seq id no:27)是由水稻基因位点loc_os06g48850.1上的编码序列(cds)(seq id no:26)或核苷酸序列(seq id no:25)编码的，其在tigr的注释为“ossaur27生长素反应性saur基因家族成员，表达”。“saur27多肽”在本文是指ossaur27多肽及其来自于其它生物体的横向同源物(例如，seq id no:134由seq id no:133编码)或同源物，例如玉米(seq id no:136由seq id no:135编码)、高粱(seq id no:138由seq id no:137编码)、拟南芥(seq id no:140由seq id no:139编码)或大豆(seq id no:142由seq id no:141编码)。
[0064]“oship1”是一种过量表达时能赋予敏旱表型的水稻多肽。所述oship1(seq id no:30)是由水稻基因位点loc_os01g39290.1上的编码序列(cds)(seq id no:29)或核苷酸序列(seq id no:28)编码的，其在tigr的注释为“harpin诱导的蛋白1结构域蛋白，表达”。“hip1多肽”在本文是指oship1多肽及其来自于其它生物体的横向同源物(例如，seq id no:144由seq id no:143编码)或同源物，例如玉米(seq id no:146由seq id no:145编码)、高粱(seq id no:148由seq id no:147编码)、拟南芥(seq id no:150由seq id no:149编码)或大豆(seq id no:152由seq id no:151编码)。
[0065]
本领域技术人员应当理解的，本公开内容涵盖的不仅仅是特定的示例性序列。引起在给定位点产生化学等价氨基酸的核酸片段的改变，但是不影响编码多肽的功能特性，这在领域内是众所周知的。例如，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一疏水性较低残基(例如甘氨酸)的密码子或更疏水性残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)替代。类似地，导致一个带负电荷的残基取代另一个(例如谷氨酸取代天冬氨酸)，或另一种带正电荷的残基取代另一个(例如精氨酸取代赖氨酸)，也可以预期产生功能上等同的产物。导致多肽分子的n-末端和c-末端部分改变的核苷酸变化也不会改变多肽的活性。所提出的每种修饰都完全在本领域的常规技术范围内，确定编码产物的生物活性的保留也是如此。
[0066]
a.抑制dna构建体和crispr/cas构建体
[0067]
提供了减少dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1等多肽表达的抑制dna构建体。在某些实施例中，所述抑制dna构建体是共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、双链rna产生构建体，更简单地，是rnai(rna干扰)构建体和小rna构建体，例如sirna(短干扰rna)构建体和mirna(小rna)构建体。
[0068]
在某些实施例中，所述抑制dna构建体含有至少一个可操作地连接抑制元件的异源调控元件，其中所述抑制元件抑制内源性靶向多核苷酸的表达，所述内源性靶向多核苷
酸的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152有至少90％的序列一致性。在某些实施例中，所述抑制元件含有至少100个连续碱基对，其多核苷酸的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152有至少90％的序列一致性。在某些实施例中，所述抑制元件含有的多核苷酸为seq id no:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149或151。
[0069]
本公开发明还提供了一种包含有至少一种异源调控序列可操作地连接grna的crispr/cas构建体，其中所述grna靶向于一个含有内源dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1等基因和/或其调控元件的基因组区域，以减少内源性dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1等多肽的表达量或活性。在某些实施例中，所述内源基因编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152有至少90％的序列一致性。进一步，所述dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1基因包含的多核苷酸的核苷酸序列为seq id no:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149或151，或包含有1到10左右的核苷酸变化的等位基因。在某些实施例中，所述内源调控元件含有的多核苷酸的核苷酸序列为seq id no:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149或151。
[0070]
在某些实施例中，至少一个调控元件是异源调控元件。在某些实施例中，至少一个重组dna构建体的调控元件包含一个启动子。在某些实施例中，所述启动子是一个异源启动子。
[0071]
大量启动子可以被用在本公开所述的重组dna构建体中。所述启动子可以依据期望的结果被挑选，且可以包括组成型、组织特异型、或其它用于在宿主生物体中表达的启动子。
[0072]“组成型”启动子是一种启动子，在大多数环境条件下都具有活性。组成型启动子包括例如wo 99/43838和美国专利号6072050中公开的rsyn7启动子的核心启动子和其他组成型启动子、核心camv 35s启动子(odell等(1985)nature313:810-812)、水稻肌动蛋白(mcelroy等(1990)plant cell 2:163-171)、泛素(christensen等(1989)plant mol.biol.12:619-632和christensen等(1992)plant mol.biol.18:675-689)、pemu(last
等(1991)theor.appl.genet.81:581-588)、mas(velten等(1984)embo j.3:2723-2730)、als启动子(美国专利号5659026)等。其他组成型启动子包括例如美国专利号5608149、5608144、5604121、5569597、5466785、5399680、5268463、5608142和6177611。
[0073]
组织特异性或发育调节的启动子是一种dna序列，能选择性地调节植物细胞/组织中dna序列的表达，例如对穗发育、种子成熟或对两者都至关重要的那些细胞/组织中的dna序列，并且通常将这种dna序列的表达限制在植物中期望的发育期(例如穗发育或种子成熟)。引起所需时间和空间表达的任何可识别的启动子可以用于本公开的方法中。
[0074]
本领域已知许多叶片优选的启动子(yamamoto等(1997)plant j.12(2)：255-265；kwon等(1994)plant physiol.105:357-367；yamamoto等(1994)plant cell physiol.35(5)：773-778；gotor等(1993)plant j.3:509-518；orozco等(1993)plant mol.biol.23(6)：1129-1138；和matsuoka等(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90(20)：9586-9590)。
[0075]
种子或胚胎特异性且可用于公开的启动子包括大豆kunitz胰蛋白酶抑制子(kti3，jofuku和goldberg，(1989)植物细胞1:1079-1093)、豌豆球蛋白convicilin、vicilin和legumin(豌豆子叶)(rerie，w.g.等人(1991)mol.gen.genet.259:149-157；newbigin，e.j.等人(1990)planta 180:461-470；higgins，t.j.v.等人(1988)plant.mol.biol.11:683-695)、玉米醇溶蛋白(玉米胚乳)(schemthaner，j.p.等人(1988)embo j.7:1249-1255)，菜豆蛋白(豆子叶)(segupta-gopalan，c.等人(1985)proc.natl.acad.sci.82:3320-3324)、植物血凝素(豆子叶)(voelker，t.等人(1987)embo j.6:3571-3577)、b-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白(大豆子叶)(chen，z-l等(1988)embo j.7:297-302)、谷蛋白(水稻胚乳)、大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(marris，c.，等(1988)plant mol.biol.10:359-366)、谷蛋白和麦醇溶蛋白(小麦胚乳)(colot，v.等(1987)embo j.6:3559-3564)。与嵌合基因构建中的异源编码区可操作连接的种子特异性基因的启动子在转基因植物中维持其时间和空间表达模式。这些实例包括拟南芥2s种子贮藏蛋白基因启动子以在拟南芥和甘蓝型油菜种子中表达脑啡肽(vanderkerckhove等人(1989)bio/technology 7:l929-932)，豆凝集素和豆β-菜豆蛋白启动子以表达荧光素酶(riggs等(1989)plant sci.63:47-57)，和小麦谷蛋白启动子表达氯霉素乙酰转移酶(colot等(1987)embo j 6:3559-3564)。
[0076]
诱导型启动子选择性表达可操作连接的dna序列以响应内源或外源刺激的出现，例如通过化合物(化学诱导剂)或响应于环境、激素、化学和/或发育信号。诱导型或调节型启动子包括例如由光、热、胁迫、洪水或干旱、植物激素、伤口或化学物质如乙醇、茉莉酮酸盐、水杨酸盐或安全剂调节的启动子。
[0077]
还考虑了合成启动子，其包括一种或多种异源调节元件的组合。
[0078]
本发明的抑制dna的启动子构建体可以是本领域已知的任何类型或类别的启动子，使得许多启动子中的任何一个可以用于表达本文公开的各种多核苷酸序列，包括天然启动子的目的多核苷酸序列。用于本发明的抑制dna构建体的启动子可以基于期望的结果进行选择。
[0079]
本公开的抑制性dna构建体还可以包括其他调控元件，包括但不限于翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。在某些实施例中，抑制dna构建体还包含增强子或沉默子。
[0080]
可以将内含子序列添加到5'非翻译区、蛋白质编码区或3'非翻译区，以增加在胞质溶胶中积累的成熟信息的量。已经在植物和动物表达构建体中的转录单元中包含可剪接的内含子可使mrna和蛋白质水平的基因表达增加高达1000倍(buchman和berg。(1988)mol.cell biol.8:4395-4405；callis等(1987)genesdev.1:1183-1200)
[0081]
b.植物和植物细胞
[0082]
提供了在其基因组中包含有任何本文所述的抑制dna构建体的植物、植物细胞、植物部分、种子和籽粒，因而所述植物、植物细胞、植物部分、种子和/或籽粒，其具有减少的编码多肽的表达量。
[0083]
还提供了在基因组位点上包含有引入的基因修饰的植物、植物细胞、植物部分、种子和籽粒，该基因组位点编码本文所述的多肽。在某些实施例中，所述多肽含有的氨基酸序列与来自于seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152的这些氨基酸序列相比较时有至少80％的一致性。在某些实施例中，所述基因修饰减少了该编码多肽的活性。在某些实施例中，所述基因修饰减少了该编码多肽的水平。在某些实施例中，所述基因修饰同时减少了该编码多肽的水平和活性。
[0084]
所述植物可以是单子叶植物或双子叶植物，例如水稻或玉米或大豆植物，例如玉米杂交植物或玉米自交植物。植物也可以是向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、小米、甘蔗或柳枝稷。
[0085]
在某些实施例中，所述植物在与对照植物相比较时，表现出增加的耐旱性。在某些实施例中，所述植物在和对照植物相比较时，表现出至少一种农艺性状的改变。
[0086]
本领域普通技术人员熟悉模拟干旱条件以及评估经受模拟或自然发生的干旱条件的植物的耐旱性的方案。例如，人们可以通过给予植物比通常需要的水少或一段时间内没有水来模拟干旱条件，并且可以通过寻找生理和/或物理条件的差异来评估耐旱性，包括(但不限于)活力、生长、大小或根长、或特别是叶色或叶面积大小。其他评估耐旱性的技术包括测量叶绿素荧光、光合速率和气体交换速率。
[0087]
c.其它性状的堆叠
[0088]
在某些实施例中，本发明公开的创新的多核苷酸被设计成分子堆栈。这样，本发明中多种宿主细胞、植物、植物细胞、植物组织、种子和/或籽粒能进一步包含一种或多种期望性状。在某些实施例中，为了创造出拥有期望性状组合的植物，所述宿主细胞、植物、植物细胞、植物组织、种子和/或籽粒可以被堆栈成任何期望的多核苷酸序列的组合。在本文中，术语“性状堆叠”是指在同一植物或期望的生物体中存在多种性状。例如，“性状堆叠”可以包含序列在物理上彼此相邻的分子堆叠。在本文中，性状是指来源于特定序列或序列组的表型。在一个实例中，所述分子堆叠包含有至少一个能赋予草甘膦耐性的多核苷酸。能赋予草甘膦耐性的多核苷酸在本领域内是已知的。
[0089]
在某些实施例中，所述分子堆叠包含有至少一个能赋予草甘膦耐性的多核苷酸和至少一个能赋予第二除草剂耐性的附加多核苷酸。
[0090]
在某些实施例中，具有本发明的多核苷酸序列的植物、植物细胞、种子和/或籽粒可以与一个或多个序列堆叠并赋予耐受性如：als抑制剂、hppd抑制剂、2,4-d、其他苯氧基
生长素除草剂、芳氧基苯氧基丙酸除草剂、麦草畏、草铵膦除草剂、靶向protox酶的除草剂(也称为“protox抑制剂”)。
[0091]
包含有本文描述的减少多肽表达和/或活性的植物、植物细胞、植物组织、种子和/或籽粒也可以与至少一个其它性状进行结合，进一步产生包含有多种期望性状组合的植物。例如，植物、植物细胞、植物组织、种子和/或籽粒可以堆叠能编码具有杀虫和/或杀虫活性的多肽的多核苷酸，或具有本发明的多核苷酸序列的植物、植物细胞、植物组织、种子和/或籽粒可以与植物抗病基因组合。
[0092]
这些堆叠的组合物的产生可以由以下任何方法，包括但不限于，任何常规育种或遗传转化培育植物。如果所述序列通过遗传转化堆叠在植物中，期望的多核苷酸序列可以在任何时间以任何目的结合。所述性状可以由转化盒的任何组合提供的期望多核苷酸的共转化协议同时被引入。例如，如果两个序列将被引入，则两个序列可以包含在单独的转化盒(反式)中或包含在相同的转化盒(顺式)中。序列的表达可以由相同的启动子或不同的启动子驱动。在某些情况下，可能需要引入抑制目的多核苷酸表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合物结合以产生植物中所需的性状组合。进一步认识到，可以使用位点特异性重组系统将多核苷酸序列堆叠在所需的基因组位置。参见例如wo99/25821，wo99/25854，wo99/25840，wo99/25855和wo99/25853，所有这些都通过引用并入本文。
[0093]
方法
[0094]
a.提高植物耐旱性和/或增加植物籽粒产量的方法
[0095]
提供了一种提高植物耐旱性和/或增加植物籽粒产量的方法，包括减少至少一种编码dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1多肽的多核苷酸的表达量和/或水平。在某些实施例中，多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152有至少80％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的一致性。
[0096]
在某些实施例中，该方法包括：(a)在一个可再生植物细胞中表达本文所述的抑制dna构建体；和(b)再生所述植物，其中该植物在其基因组中包含有该抑制dna构建体。在某些实施例中，所述调控元件是一种异源启动子。
[0097]
在某些实施例中，所述方法包括：(a)向一个可再生植物细胞中编码所述多肽的基因组位点上引入一个靶向基因修饰；和(b)再生该植物，其中所述植物中该编码多肽的水平和/或活性是降低的。在某些实施例中，所述靶向基因修饰可以使用选自以下的基因组修饰技术引入：多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(talen)、工程位点特异性巨核酸酶或argonaute。在某些实施例中，所述靶向基因修饰存在于基因组位点的(a)编码区域；(b)非编码区；(c)调控序列；(d)非翻译区；或(e)任何(a)-(d)的组合，该基因组位点编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150或152这些氨基酸序列相比有至少80％
的一致性。
[0098]
使用本发明中方法的植物可以是本文描述的的任何种类的植物。在某些实施例中，所述植物是玉米、大豆或水稻。
[0099]
多种方法可以用于将期望序列引入植物、植物部分、植物细胞、种子和/或籽粒中。“引入”意味着把本发明中的多核苷酸或以这种方式产生的多肽给植物、植物细胞、种子和/或籽粒，这样序列得以进入植物细胞的内部。本公开所述的方法不依靠特定的向植物、植物细胞、种子和/或籽粒中引入序列的方法，仅需要所述多核苷酸或获得的多肽进入至少一个植物细胞的内部。
[0100]
和向植物引入多肽或多核苷酸序列的方法一样的转化方法，可以取决于植物或植物细胞的种类(即，单子叶植物或双子叶植物)有针对性地转化。合适的引入植物细胞多肽和多核苷酸的方法包括显微注射(crossway等(1986)biotechniques 4:320 334)、电穿孔(riggs等人(1986)proc.natl.acad.sci.usa 83:5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5563055和美国专利号5981840)、直接基因转移(paszkowski等人(1984)embo j.3:2717-2722)和弹道粒子加速(参见例如美国专利号4945050、美国专利号5879918、美国专利号5886244和5932782；tomes等(1995)in plant cell,tissue,and organ culture:fundamental methods,ed.gamborg and phillips(springer-verlag,berlin(springer-verlag，berlin)；mccabe等人(1988)biotechnology 6:923-926)和lec1转化(wo 00/28058)参见weissinger等人(1988)ann.rev.genet.22:421 477；sanford等人(1987)particulate science and technology 5:27 37(洋葱)；christou等人(1988)plant physiol.87:671 674(大豆)；mccabe等人(1988)bio/technology 6:923 926(大豆)；finer和mcmullen(1991)in vitro cell dev.biol.27p:175-182(大豆)；singh等人(1998)theor.appl.genet.96:319-324(大豆)；datta等人(1990)biotechnology 8:736-740(水稻)；klein等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:4305-4309(玉米)；klein等人(1988)biotechnology 6:559-563(玉米)；美国专利号5240855、5322783和5324646；klein等人(1988)plant physiol.91:440-444(玉米)；fromm等人(1990)生物技术8:833-839(玉米)；hooykaas van slogteren等(1984)nature(london)311:763-764；美国专利号5736369(谷物)；bytebier等(1987)proc.natl.acad.sci.usa 84:5345-5349(百合科)；de wet等(1985)in the experimental manipulation of ovule tissues，ed.chapman等(longman，new york)，第197-209页(花粉)；kaeppler等(1990)plant cell reports 9:415-418，以及kaeppler等(1992)theor.appl.genet.84:560-566(晶须介导转化)；d'halluin等(1992)plant cell 4:1495-1505(electroporation)；li等(1993)plant cell reports 12:250-255和christou与ford(1995)annals of botany 75:407-413(rice)；osjoda等(1996)nature biotechnology 14:745-750(玉米根瘤菌)；所有这些都通过引用并入本文。
[0101]
在其他的实施例中，本公开中创造性的多核苷酸可以通过用病毒或病毒核酸接触植物被引入植株。通常，这些方法涉及将公开的核苷酸构建体合并入dna或rna分子中。应当认识到，所述创造性的多核苷酸序列可以开始作为病毒多蛋白的一部分合成，所述病毒多蛋白之后可以在体内或体外进行蛋白水解处理以产生所需的重组蛋白。应该进一步认识到，本文披露的启动子还包括用于病毒rna聚合酶转录的启动子。向植物引入多核苷酸并在其中进行编码表达蛋白，相关的病毒dna或rna分子在领域内是已知的。参见例如美国专利
号5889191、5889190、5866785、5589367、5316931和porta等，(1996)molecular biotechnology，5:209-221；在此通过引用并入本文中。
[0102]
已经转化的细胞可以按照常规方式生长成植物。参见，例如，mccormick等人(1986)plant cell reports 5:81-84。然后这些植物可以生长，并用相同的转化菌株或不同的菌株授粉，并鉴定所得后代是否具有所需表型特征的组成型表达。可以生长两代或更多代以确保所需表型特征的表达被稳定维持和遗传，然后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。以这种方式，本公开提供了具有本文公开的多核苷酸的转化种子(也称为“转基因种子”)，例如，作为表达盒的一部分，稳定地掺入其基因组中。
[0103]
可以培养通过植物转化技术衍生的转化植物细胞，包括上面讨论的那些，以再生具有转化基因型(即本发明的多核苷酸)并因此具有所需表型的整株植物，例如增加的产量。对于玉米的转化和再生，参见gordon kamm等，the plant cell，2:603-618(1990)。
[0104]
可以使用各种方法在植物、植物部分、植物细胞、种子和/或籽粒的基因组位点处引入基因修饰，并编码本文公开的多肽。在某些实施例中，靶向dna修饰可以通过选用以下基因修饰技术引入：多核苷酸引导的内切核酸酶、crispr-cas内切核酸酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活物样效应核酸酶(talen)、工程位点特异性巨核酸酶或argonaute。
[0105]
在一些实施例中，可以通过在基因组中靠近所需改变的限定位置诱导双链断裂(dsb)或单链断裂来促进基因组修饰。可以使用任何可用的双链断裂(dsb)诱导剂诱导双链断裂(dsb)，包括但不限于talen、巨核酸酶、锌指核酸酶、cas9-grna系统(基于细菌crispr-cas系统)、引导的cpf1内切核酸酶系统等。在一些实施方案中，双链断裂(dsb)的引入可以与引入多核苷酸修饰模板组合。
[0106]
多核苷酸修饰模板可以通过本领域已知的任何方法引入细胞，例如但不限于瞬时引入方法、转染、电穿孔、显微注射、颗粒介导的递送、局部应用、晶须介导的递送、通过细胞穿透肽递送、或介孔二氧化硅纳米粒子(msn)介导的直接递送。
[0107]
多核苷酸修饰模板可以作为单链多核苷酸分子、双链多核苷酸分子或作为环状dna(载体dna)的一部分引入细胞中。多核苷酸修饰模板也可以连接到向导rna和/或cas内切核酸酶。
[0108]“修饰的核苷酸”或“编辑的核苷酸”是指与未修饰的核苷酸序列相比包含至少一个目的核苷酸序列的改变。这种“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替换、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)任何(i)-(iii)的组合。
[0109]
术语“多核苷酸修饰模板”包括一个多核苷酸，其与未编辑的核苷酸序列相比包含至少一个核苷酸修饰。核苷酸修饰可以是至少一个核苷酸的取代、添加或缺失。任选地，多核苷酸修饰模板可以进一步包含一个同源核苷酸序列，侧翼连接至少一个核苷酸修饰，其中侧翼同源核苷酸序列与待编辑的所需核苷酸序列提供足够的同源物。
[0110]
编辑一个结合双链断裂(dsb)和修饰模板的基因组序列的过程通常包括：向宿主细胞提供识别染色体中靶序列的双链断裂(dsb)诱导剂或编码双链断裂(dsb)诱导剂的核酸序列，并能够在基因组序列中诱导双链断裂(dsb)。与待编辑的核苷酸序列相比，至少一个多核苷酸修饰模板中包含有至少一个核苷酸的改变。多核苷酸修饰模板可以进一步包含位于至少一个核苷酸改变侧翼的核苷酸序列，其中侧翼序列与双链断裂(dsb)侧翼的染色
体区域基本同源。
[0111]
核酸内切酶可以通过本领域已知的任何方法提供给细胞，例如但不限于瞬时引入方法、转染、显微注射和/或局部应用或间接通过重组构建体。内切核酸酶可以作为蛋白质或向导多核苷酸复合物，直接提供给细胞或通过重组构建体间接提供。内切核酸酶可以瞬时引入细胞中，或者可以使用本领域已知的任何方法掺入宿主细胞的基因组中。在crispr-cas系统的情况下，如2016年5月12日公布的wo2016073433中所述，可以用细胞穿透肽(cpp)促进内切核酸酶和/或引导的多核苷酸摄入细胞。
[0112]
除了通过双链断裂技术进行修饰之外，使用碱基编辑技术实现对没有这种双链断裂的一个或多个碱基的修饰，参见例如gaudelli等，(2017)programmable base editing of a*t to g*c in genomic dna without dna cleavage.nature，551(7681):464-471；komor等，(2016)programmable editing of a target base in genomic dna without double-stranded dna cleavage,nature，533(7603):420-425。
[0113]
这些融合物含有dcas9或cas9切口酶以及合适的脱氨酶，它们可以将例如胞嘧啶转化为尿嘧啶而不诱导靶向dna的双链断裂。然后通过dna复制或修复将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶。具有目标灵活性和特异性的改进的基础编辑器用于编辑内源基因位点以产生目标变异并提高谷物产量。同样，腺嘌呤碱基编辑器可使腺嘌呤变为肌苷，然后通过修复或复制将其转化为鸟嘌呤。因此，目标碱基改变，即c
·
g到t
·
a转换和a
·
t到g
·
c转换在使用适当的位点特异性碱基编辑的多个位点进行。
[0114]
在一个实施例中，碱基编辑是一种基因组编辑方法，能够在目标基因组位点将一个碱基对直接转化为另一个碱基对，而不需要双链dna断裂(dsbs)、同源定向修复(hdr)过程、或外部供体dna模板。在一个实施例中，碱基编辑包括(i)催化受损的crispr-cas9突变体，其突变使得其核酸酶结构域之一不能形成双链断裂(dsb)；(ii)单链特异性胞苷/腺嘌呤脱氨酶，其在由cas9产生的单链dna泡中的适当核苷酸窗口内将c转化为u或a转化为g；(iii)阻碍尿嘧啶切除的尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)和降低碱基编辑效率和产物纯度的下游过程；(iv)切口酶活性以切割未编辑的dna链，然后进行细胞dna修复过程以替换含g的dna链。
[0115]
如本文所用，“基因组区域”是细胞基因组中染色体的区段，其存在于靶位点的任一侧，或者还包含靶位点的一部分。基因组区域可至少包含5-10、5-15、5-20、5-25、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-45、5-50、5-55、5-55、5-60、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-10、5-15、5-15、5-15、5-15、5-15、5-15、5-15、5-15、5-15、5-15、5-15、5-15-20、5-20、5-20、5-25、5-25、5-25、5-25、5
‑‑
1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600，5-2700、5-2800.5-2900、5-3000、5-3100或更多碱基，以使基因组区域具有足够的同源性，以与相应的同源性区域进行同源重组。
[0116]
tal效应核酸酶(talen)是一类序列特异性核酸酶，可用于在植物或其他生物基因组的特定靶序列上产生双链断裂(miller等(2011)nature biotechnology 29:143-148)。
[0117]
内切核酸酶是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶。核酸内切酶包括在特定位点切割dna而不破坏碱基的限制性内切酶，以及与限制性内切酶一样在特定识别位点结合和切割的巨核酸酶(也称为归巢核酸内切酶(hease))，但是巨核酸酶的识别位点通常更长，约
id no:49和50)。
[0126]
表2.水稻基因名称、基因id(来自tigr)和构建体id
[0127]
基因名称loc id构建体idosdn-drt20loc_os02g51760.1dp0623osein3-1loc_os03g20790dp1804oscyp-1loc_os02g47470.1dp1365osnac67-3loc_os01g66120.1dp2253osdn-dtp21loc_os09g39370.1dp1139ossip1loc_os07g04150.1dp1448osdc1d1loc_os08g15710.1dp0865yostns1loc_os01g49890.1dp0997yossaur27loc_os06g48850.1dp0908oship1loc_os01g39290.1dp0925
[0128]
使用柱试剂盒在琼脂糖凝胶电泳后提取pcr扩增产物，然后与ta克隆载体连接。通过测序确认这些构建体中的序列和方向。除dp2253外，将每个基因克隆到camv 35s启动子下的植物二元结构中，并制备表2所示的过表达载体。dp2253是osnac67-3在根优先启动子kt630下的过度表达载体。
[0129]
实例2
[0130]
转基因水稻株系的转化和基因表达分析
[0131]
如lin和zhang(2005)plant cell rep.23:540-547)所述，通过农杆菌介导的转化，使用实施例1中制备的载体或空载体(dp0158)转化中花11号(oryza sativa l.)。将转化实验室产生的转基因苗(t0)移栽到田间，获得t1种子。筛选t1和随后的t2种子以确认转化，并在以下性状筛选中使用阳性鉴定的转基因种子。
[0132]
通过rt-pcr测定转基因水稻植株叶片中的基因表达水平。为在过量表达的转基因水稻中的使用seq id no:51和52的osdn-drt20、使用seq id no:53和54的osnac67-3、使用seq id no:55和56的ossip1、使用seq id no:57和58的ostns1、使用seq id no:59和60的oship1的rt-pcr分析设计引物。将zh11-tc(组织培养的中花11水稻)中的表达水平设置为1.00，并将转基因植株中的表达水平与zh11-tc进行比较。基因表达根据ef-1αmrna水平进行标准化，基因表达分析结果见下表3。
[0133]
表3.转基因水稻植株中相对表达水平增幅
[0134]
基因名称构建体id相对表达水平增幅osdn-drt20dp0623从36.23到28785.82osnac67-3dp2253从0.64到6.61ossip1dp1448从51.22到213.25ostns1dp0997y从0.86到200.37oship1dp0925从14.57到28.63
[0135]
实例3
[0136]
转基因水稻植株的表型
[0137]
对实施例2的转基因水稻植株和zh11-tc以及dp0158水稻植株进行测试：(a)耐旱
性，和(b)在水分充足的条件下的籽粒产量。
[0138]
实施例2获得的t2种子在32℃条件下浸泡于800ppm的多菌灵溶液中消毒8小时，然后清洗3-5遍后，在32℃条件下浸泡16个小时，随后在35-37℃烘箱中催芽18个小时。萌发的种子用于以下试验：
[0139]
耐旱试验。将萌发的种子种植在苗床上。在三叶期时，幼苗被移种到试验田，每个转基因株系种植10株并设四个重复，这四个重复都种植在相同区块。zh11-tc和dp0158幼苗作为统计分析中的对照种植在同一块试验田靠近转基因株系。水稻植株按照常规使用肥料和杀虫剂进行管理。在穗分化初期停止浇水，以便根据气候条件(温度和湿度)在开花期给与干旱胁迫。每四天在每个田块的大约10个点使用tdr30(spectrum technologies，inc.)测量土壤水分含量。在试验期间观察并记录植株表型。这些表型包括始穗日、叶片卷曲度、敏旱性和耐旱性。特别需要注意的是中午的叶片卷曲度。在种植季结束的时候，从每个株系的每行的中间收获6个典型植株，并测定每株的籽粒产量。这些籽粒产量的数据使用混合线性模型进行统计分析。
[0140]
水分充足条件下籽粒产量。萌发的种子种植在苗床上，在三叶期将幼苗转种到试验田中，设计四个重复，每个重复40株，四个重复种植在同一区块。zh11-tc和dp0158幼苗作为统计分析中的对照种植在同一块试验田靠近转基因株系。水稻植株按照常规使用肥料和杀虫剂进行管理。在种植季结束的时候，每个株系收获每行中间的转基因水稻植株，并测定每株的籽粒产量。这些籽粒产量的数据使用混合线性模型进行统计分析
[0141]
在种植季结束的时候，每个转基因株系从每行的中间收获6株代表性植株并测定每株的籽粒产量。单株籽粒产量的数据用asreml软件以混合线性模型进行统计分析。根据分析结果(p《0.1)挑选出阳性转基因株系。
[0142]
这些研究的结果在表4中提供，其提供了每种构建体的转基因系的组合数据。
[0143]
表4.转基因水稻株系的农艺性状
[0144][0145]
dp0623转基因水稻植株两年分别在海南和宁夏田间进行了四次试验。这些实验结果显示，在田间干旱条件下，与对照植物相比，dp0623转基因水稻的平均单株产量是减少的；在观察到高表达株系出现了叶片卷曲和叶片坏死表型的同时，低表达株系表现出良好的结实率且没有叶片卷曲表型。这些结果表明dp0623转基因株系的产量和敏旱性与osdn-drt20基因的表达水平有相关性。如表4所述，在宁夏田间实验中，与两个对照相比较，12个
株系中有9个株系表现出单株产量的显著减少(p《0.1)。平均单株产量分别比zh11-tc和dp0158减少了51％和43％。产量和观察表型都表明osdn-drt20是一个水稻敏旱基因。
[0146]
dp1804转基因水稻植株两年分别在海南和宁夏田间进行了两次试验。这些实验结果显示，在田间干旱条件下，与对照植物相比，dp1804转基因水稻的平均单株产量是减少的，且在田间干旱条件下观察到osein3-1高表达株系出现了叶片卷曲和叶片坏死的表型。在宁夏田间实验中，13个株系的单株产量的显著低于对照zh11-tc和dp0158。这13个株系的平均单株产量分别比zh11-tc和dp0158减少了64％和59％(表4)。产量和观察表型都表明osein3-1是一个水稻敏旱基因。
[0147]
dp1365转基因水稻植株两年分别在海南和宁夏田间进行了两次试验。这些实验验证的7个株系一致显示，oscyp-1水稻的平均单株产量是显著低于对照植株的，且在田间干旱条件下观察到oscyp-1株系出现了叶片卷曲和叶片坏死的表型。这7个株系的平均单株产量的显著低于对照zh11-tc和dp0158。这7个株系的平均单株产量分别比zh11-tc和dp0158少33％和31％。产量和观察表型都表明oscyp-1是一个水稻敏旱基因。
[0148]
dp2253转基因植株一年内在海南和宁夏进行了两次验证。试验验证的14个株系一致地表明，与对照植株相比，dp2253转基因株系中osnac67-3基因的过量表达显著地减少了单株的产量；且在田间干旱条件下观察到了叶片卷曲和叶片坏死的表型。在宁夏田间试验中，这14个株系的平均单株产量分别比对照zh11-tc和dp0158低86％和83％(表4)。产量和观察到的表型都显示osnac67-3是一个水稻敏旱基因。
[0149]
dp1139转基因水稻植株一年内在海南和宁夏进行了两次验证。试验验证的14个株系一致地表明，与对照植株相比，dp1139转基因株系中osdn-dtp21基因的过量表达显著地减少了单株的产量；且在田间干旱条件下观察到了叶片卷曲和叶片坏死的表型。在宁夏田间试验的结果表明，这14个株系的平均单株产量分别比对照zh11-tc和dp0158低50％和44％(表4)。这些数据一致表明osdn-dtp21是一个水稻敏旱基因。
[0150]
dp1448转基因水稻植株一年内分别在海南和宁夏进行了两次验证。这两次试验验证的13个株系一致地表明，与对照植株相比，ossip1基因的过量表达显著地减少了单株的产量；且在田间干旱条件下观察到了叶片卷曲和叶片坏死的表型。在宁夏田间试验的结果表明，这13个株系的平均单株产量分别比对照zh11-tc和dp0158低74％和59％(表4)。这些数据一致表明ossip1是一个水稻敏旱基因。
[0151]
dp0865y转基因水稻植株三年分别在海南和宁夏进行了四次验证。所有试验一致表明osdc1d1基因的过量表达与对照植株相比，显著地减少了单株的产量，且在田间干旱条件下观察到了叶片卷曲和叶片坏死的表型。在海南田间，7个株系中的4个株系的单株产量分别与对照zh11-tc和dp0158相比，表现出显著的减少。这7个株系的平均单株产量分别比对照zh11-tc和dp0158低60％和49％，如表4所示。这些数据一致表明osdc1d1是一个水稻敏旱基因。
[0152]
dp0997y转基因水稻植株一年内分别在海南和宁夏进行了两次验证。试验验证的12个株系一致地表明，osnac67-3基因的过量表达显著地减少了单株的产量，且在田间干旱条件下观察到了叶片卷曲和叶片坏死的表型。在海南田间，这12个株系的平均单株产量分别比对照zh11-tc和dp0158低75％和53％(表4)。这些数据一致表明ostns1是一个水稻敏旱基因。
[0153]
dp0908转基因水稻植株一年内分别在海南和宁夏进行了两次验证。试验验证的12个株系一致地表明，ossaur27基因的过量表达显著地减少了单株的产量，且在田间干旱条件下观察到了叶片卷曲和叶片坏死的表型。在海南田间，这12个株系的平均单株产量分别比对照zh11-tc和dp0158低63％和64％(表4)。这些数据一致表明ossaur27是一个水稻敏旱基因。
[0154]
dp0925转基因水稻植株一年内分别在海南和宁夏进行了两次验证。试验验证的12个株系一致地表明，oship1基因的过量表达显著地减少了单株的产量，且在田间干旱条件下观察到了叶片卷曲和叶片坏死的表型。在宁夏田间，这12个株系的平均单株产量分别比对照zh11-tc和dp0158低70％和70％(表4)。这些数据一致表明oship1是一个水稻敏旱基因。
[0155]
综上，这些结果都表明dn-drt20、ein3-1、cyp-1、nac67-3、dn-dtp21、sip1、dc1d1、tns1、saur27或hip1转基因水稻植株在营养生长阶段表现出了敏旱表型，且在干旱胁迫后与对照相比产生了更少的单株籽粒产量。
[0156]
实例4
[0157]
水稻敏旱基因低表达同源基因在玉米中的转化和评价
[0158]
如本文所述，可以对玉米植株进行改良(例如，抑制dna构建体或靶向基因修饰)，以降低玉米同源物的表达和/或活性。玉米转化载体中抑制元件的表达可以在组成型启动子的控制下进行，例如玉米泛素启动子(christensen等，(1989)plant mol.biol.，12:619-632和christensen等人，(1992)plant mol.biol.，18:675-689)或在另一个启动子的控制下，如应激反应启动子或组织优选启动子。如国际专利出版物wo 2009/006276所述，可通过粒子轰击将抑制dna构建体引入玉米细胞。或者，玉米植株可以通过农杆菌介导转化的方法转化抑制dna构建体，如zhao等人在meth.mol.biol.318:315-323(2006)和zhao等人在mol.breed.8:323-333(2001)以及1999年11月9日在公开的美国专利5981840所述。或者可以使用本领域已知的方法在编码同源蛋白质的基因组位点引入靶向基因修饰。
[0159]
可再生植株的后代，如t1植株，可能受到基于土壤的干旱胁迫。通过图像分析，可以在干旱胁迫之前和期间多次测量植物的面积、体积、生长速率和颜色。与对照相比，在干旱胁迫期间，叶片萎蔫或叶面积减少的显著延迟、黄色积累的减少和/或生长速率的增加将被视为玉米中该基因增强耐旱性的证据。
[0160]
实例5
[0161]
水稻敏旱基因低表达同源基因在高粱中的评价
[0162]
如本文所述，高粱可以进行改良(例如，抑制dna构建体或靶向基因修饰)以降低来自于高粱的同源物的表达量和/或活性。
[0163]
可再生植物的后代，如t1植株，可能受到基于土壤的干旱胁迫。通过图像分析，可以在干旱胁迫之前和期间多次测量植物的面积、体积、生长速率和颜色与对照相比，在干旱胁迫期间，叶片萎蔫或叶面积减少的显著延迟、黄色积累的减少和/或生长速率的增加将被视为玉米中该基因增强耐旱性的证据。
[0164]
实例6
[0165]
水稻敏旱基因低表达同源基因在大豆中的评价
[0166]
如本文所述，大豆可以进行改良(例如，抑制dna构建体或靶向基因修饰)以降低来
自于大豆的同源物的表达量和/或活性。
[0167]
可再生植物的后代，如t1植株，可能受到基于土壤的干旱胁迫。通过图像分析，可以在干旱胁迫之前和期间多次测量植物的面积、体积、生长速率和颜色与对照相比，在干旱胁迫期间，叶片萎蔫或叶面积减少的显著延迟、黄色积累的减少和/或生长速率的增加将被视为玉米中该基因增强耐旱性的证据。
[0168]
实例7
[0169]
水稻敏旱基因在拟南芥中的实验室干旱筛选
[0170]
为了解水稻耐旱基因能否提高双子叶植物耐旱性或其它的性状，本文所述的水稻载体使用花浸法通过农杆菌介导的转化程序转化到拟南芥(columbia)中，并鉴定转基因植物(clough、s.t.和bent、a.f.，(1998)the plant journal 16，735
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743；zhang、x.等，(2006)nature protocols，1:641-646)。
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可再生植物的后代，如t1植株，可能受到基于土壤的干旱胁迫。通过图像分析，可以在干旱胁迫之前和期间多次测量植物的面积、体积、生长速率和颜色与对照相比，在干旱胁迫期间，叶片萎蔫或叶面积减少的显著延迟、黄色积累的减少和/或生长速率的增加将被视为双子叶植物中该基因增强耐旱性的证据。