一种副干酪乳杆菌CICC6277及其在新疆特色辣椒发酵中的应用的制作方法

本发明涉及食品微生物领域，特别涉及到一种具有快速降解亚硝酸盐，低产生物胺且具有抑制致病微生物的副干酪乳杆菌cicc6277及其在新疆特色辣椒发酵中的应用。

背景技术：

乳酸菌是指革兰氏染色呈阳性、无运动性或很少有运动性、厌氧或兼性厌氧、以乳酸作为发酵代谢中主要或唯一产物等一类微生物的总称。乳酸菌广泛分布于自然界中，包括乳杆菌属，乳球菌属，链球菌属，片球菌属等属的菌株。大部分乳酸菌都具有益生功能，在发酵过程中能够产生多种有机酸，具有耐酸和耐盐特性，亚硝酸盐降解能力，抑制致病微生物特性以及低产生物胺等特性，广泛应用于果蔬发酵生产中。

果蔬发酵是利用有益微生物，控制生产条件对果蔬进行加工的一种方式，能够最大程度的保持蔬菜的营养和色香味，又具有良好的感官品质，深受消费者喜爱。果菜发酵体系实质上是多种微生物相互作用的微生态环境，其中乳酸菌发挥着至关重要的作用。本发明筛选得到的副干酪乳杆菌cicc6277，够抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和沙门氏菌等致病微生物的生长，能够快速降解亚硝酸盐，且具有低产生物胺的特性，通过微生物强化技术将该菌种应用于新疆特色辣椒发酵生产中，能够抑制发酵辣椒中致病微生物的生长，降低产品中亚硝酸盐和生物胺的含量，提高发酵辣椒的食用安全性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株副干酪乳杆菌cicc6277，其特征在于能够高效的降解亚硝酸盐，低产生物胺，并且抑制致病微生物的生长。

本发明的另一个目的是提供一种接种上述副干酪乳杆菌cicc6277的亚硝酸盐和生物胺含量低的新疆特色发酵辣椒。

本发明在于克服现有技术的不足，通过接种能够抑制致病微生物生长，快速高效的降解亚硝酸盐，低产生物胺的副干酪乳杆菌cicc6277，即可生产出亚硝酸盐和生物胺含量低的新疆特色发酵辣椒。

本发明的具体技术方案如下：

副干酪乳杆菌cicc6277为实验室从新疆特色辣椒中分离得到的乳酸菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc17812，保藏日期为2019年5月15日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏分类命名为副干酪乳杆菌lactobacillusparacasei。该菌株菌落乳白色，圆形，表面光滑，不透明，边缘整齐。菌体呈短杆状，0.5-0.6μm×1.2-2.6μm，单个或成对排列，革兰氏染色呈阳性，过氧化氢酶阴性。

副干酪乳杆菌cicc6277具有快速亚硝酸盐降解能力，在改良mrs液体培养基中培养24h，亚硝酸盐降解率能够达到94.82％，培养36h，降解率达到100％。副干酪乳杆菌cicc6277氨基酸脱羧酶为阴性，表明该菌株在生长代谢过程中产生生物胺的能力较弱。此外，副干酪乳杆菌cicc6277具有较强的抑制致病微生物的能力，能够抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和沙门氏菌四种常见致病菌的生长。

将副干酪乳杆菌cicc6277应用于新疆特色辣椒的发酵生产过程中，所得到的发酵辣椒亚硝酸盐的含量0.81mg/kg,生物胺的含量为4.22mg/kg，降低了发酵辣椒中亚硝酸盐和生物胺，在一定程度上解决了亚硝酸盐和生物胺带来的食品安全问题。此外，接种该菌株的发酵辣椒的总酸含量达到2.54％。

附图说明

图1示发明所述副干酪乳杆菌cicc6277的扫描电镜形态

图2示发明所述副干酪乳杆菌cicc6277的16srrna基因系统发育树

图3示发明所述副干酪乳杆菌cicc6277亚硝酸盐降解特性

具体实施方案

下面结合实施例对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1菌株cicc6277的鉴定

本发明中的的菌株cicc6277是从新疆传统发酵辣椒中分离筛选得到，利用多相鉴定学技术，从表型和基因型水平将该菌种鉴定为副干酪乳杆菌。

1、形态学鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》对菌株cicc6277进行形态特征进行鉴定，并对其进行扫描电镜观察(图1)。mrs培养基，37℃培养24h，菌株菌落乳白色，圆形，表面光滑，不透明，边缘整齐。菌体呈短杆状，0.5-0.6μm×1.2-2.6μm，单个或成对排列，革兰氏染色呈阳性，过氧化氢酶阴性。

2、生理生化特征鉴定

使用api50chl鉴定系统进行菌株cicc6277的生理生化特征鉴定。菌株cicc6277鉴定为类干酪乳杆菌类干酪(lactobacillusparacasei)，鉴定值为99.1％，t值为0.99，鉴定结果可信。该菌株能够利用d-核糖、甘露醇、七叶灵、水杨苷、山梨醇、d-纤维二糖、d-麦芽糖、d-蔗糖、d-海藻糖、d-龙胆二糖、d-松三糖、d-棉籽糖、d-葡萄糖、d-果糖、d-甘露糖、d-乳糖、d-半乳糖和n-乙酰葡糖胺产酸。

3、16srrna基因的pcr扩增

使用细菌基因组dna提取试剂盒提取乳酸菌的基因组。利用引27f(5’-agagtttgatcctggctcag-3’)和1492r(5’-ggttaccttgttacgactt-3’)对16srrna基因进行扩增。pcr反应体系为：模板10×pcrbuffer5μl、dntp(2.5mmol/l)4μl、模板2μl、taqdna聚合酶1μl、引物各1μl,补充去离子水至50μl。反应条件:94℃5min，94℃50s，52℃50s，72℃50s，33个循环，72℃7min。

4、序列分析

将所得的16srrna基因序列用blast软件与ncbi数据库进行相似性比对，运用mega5.0软件采用neighborjoining方法构建系统发育树。菌株cicc6277与副干酪乳杆菌处于同一个分支(图2)，再结合表型特征，鉴定为副干酪乳杆菌。其16srrna基因序列登录号为mn315539。

实施例2副干酪乳杆菌cicc6277的特性研究

1、亚硝酸盐降解能力

按照gb5009.33-2010：《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》测定副干酪乳杆菌cicc6277亚硝酸盐降解能力。1％接种量接种到含0.125mg/mlnano2的mrs培养基中，37℃培养36h，亚硝酸盐降解率能够达到100％(图3)。

2、氨基酸脱羧酶试验

微生物代谢过程中，在氨基酸脱羧酶作用下，生成生物胺类物质。筛选氨基酸脱羧酶为阴性的菌株作为发酵剂，会降低果蔬发酵生产中生物胺的含量。氨基酸脱羧酶试验结果表明，副干酪乳杆菌cicc6277色氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶活性均为阴性。

3、抑菌能力

利用滤纸片法测定副干酪乳杆菌cicc6277对肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的抑制程度。副干酪乳杆菌cicc6277过夜培养物对肠炎沙门氏菌的抑菌直径达到22.3mm，对大肠杆菌的抑菌直径达到13.5mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌直径达到14.4mm，对单增李斯特菌抑菌直径达到11.3mm。

实施例3副干酪乳杆菌cicc6277在新疆特色辣椒发酵中的应用

选择新鲜的新疆辣椒，清洗，破碎后，加入3％蔗糖和3％盐，接种1％副干酪乳杆菌cicc6277(约10⁸cfu/ml)，30℃恒温发酵7天，即得到发酵辣椒。将未接种乳酸菌的辣椒为对比试验组。按照gb5009.33-2010：《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》，测定发酵辣椒的亚硝酸盐含量。按照gb/t5009.208-2008：《食品中生物胺含量的测定》，使用hplc法对接种副干酪乳杆菌cicc6277的发酵辣椒和自然发酵辣椒中生物胺的种类和含量进行测定。按照gb/t12456-2008：《食品中总酸的测定》中酸碱滴定法测定发酵辣椒的总酸含量。通过构建有机酸分析模型，使用hplc法对接种副干酪乳杆菌cicc6277的发酵辣椒和自然发酵辣椒中的有机酸种类和含量进行测定。具体测定结果见表1。

表1发酵辣椒测定指标

副干酪乳杆菌cicc6277用于新疆特色辣椒发酵，所得到的发酵辣椒亚硝酸盐的含量0.81mg/kg,低于对照组亚硝酸盐含量(2.63mg/kg)，远远低于国家标准20mg/kg。接种菌株cicc6277的发酵辣椒中生物胺主要为腐胺，其含量为4.22mg/kg，与对照组相比，生物胺含量下降了78.2％。因此接种副干酪乳杆菌cicc6277，能够显著降低了发酵蔬菜中残留亚的硝酸盐和生物胺含量，解决了亚硝酸盐和生物胺带来的食品安全问题。此外，接种副干酪乳杆菌cicc6277的发酵辣椒总酸含量2.54％，高于自然发酵辣椒，并且乳酸、琥珀酸和乙酸的含量菌明显增加，这表明副干酪乳杆菌cicc6277的强化提升了发酵辣椒的品质。