本发明属于生物制药和生物化工
技术领域：
，具体涉及一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。
背景技术：
：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，也称为二磷酸吡啶核苷酸(缩写为dpn)，或辅脱氢酶i或辅酶i。在哺乳动物体内存在氧化型(nad+)和还原型(nadh)两种状态，氧化型(nad+)在260nm处具有最大紫外吸收光谱，通过各种脱氨酶，从底物中接受一个氢原子和一个电子，变成还原型(nadh)，在340nm处有最大吸收。研究表明，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸参与细胞物质代谢、能量合成、细胞dna修复等多种生理活动，能促进物质代谢、能量代谢、抵抗细胞衰老和抗氧化作用(ying,w.2008:antioxidredoxsignal10(2):179-206)，对机体免疫能力有重要作用。在健康状态下，人体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度稳定，维持各项细胞正常功能。体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度决定了细胞衰老的过程和程度，浓度下降会加速细胞衰老的过程。此外，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与疾病的发生密切相关(sauve,a.a.2008.jpharmacolexpther324(3):883-893)。目前，nad的合成主要有化学法、化学酶法和生物发酵法。化学法以烟酰胺为原料，经多步合成nad，反应路线长，用到昂贵的试剂和大量有机溶剂造成环境污染。化学酶法以烟酰胺核糖为原料，同样会用到昂贵试剂和易爆试剂，成本高，且容易发生危险事故。生物发酵法工艺技术成熟，但是原料耗费巨大，消耗能源大，且产量有限。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：一种酶组合物，由腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶组成。本发明所述酶组合物中腺苷激酶(ak)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(aprt)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(nmprt)和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(nmnat)四种酶合理组合可以用于酶解催化合成nad。在一些实施方案中，所述的酶组合物中所述腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的质量比为1:(1-3):(1-2):1。在一些具体实施例中，所述腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的比例为1:1:1:1。在一些具体实施例中，所述腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的比例为1:2:1:1。在一些具体实施例中，所述腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的比例为1:1:2:1。在一些具体实施例中，所述腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的比例为1:3:1:1。本发明所述酶组合物中所述腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶为采用基因工程技术通过pcr扩增目的片段、与载体连接转入宿主菌后诱导蛋白表达获得的相关酶制剂。所述酶制剂可以是粗酶液或者干粉，也可以是再经固定化处理后的固定化酶或者固定化重组细胞。所述固定化的酶制剂或固定化重组细胞可以通过离心方式分离，也可通过过滤方式分离回收。回收的固定化酶或固定化重组细胞可重复利用，用于酶促反应。本发明还提供了利用上述酶组合物制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，在ph7.0磷酸缓冲溶液中加入腺苷、烟酰胺、六偏磷酸钠、atp、mgcl2·6h2o混匀，加入上述的酶组合物，催化制得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。本发明所述方法以腺苷为底物，通过添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产用酶组合物，在生物催化体系中进行酶促反应，可以低成本、安全可靠制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。具体反应式如下：在一些实施方案中，本发明所述酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法中，所述腺苷的终浓度为18g/l～22g/l，烟酰胺的终浓度为12g/l～15g/l，六偏磷酸钠的终浓度为58g/l～68g/l，atp的终浓度为56g/l～64g/l，mgcl2·6h2o的终浓度为20g/l～24g/l。在一些具体实施例中，所述腺苷的终浓度为20g/l，烟酰胺的终浓度为13.7g/l，六偏磷酸钠的终浓度为66g/l，atp的终浓度为60g/l，mgcl2·6h2o的终浓度为22g/l。在本发明中，所述酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法中，所述催化反应条件为在ph7.0、反应温度30-35℃条件下反应9～15小时。催化反应后分离的反应液可通过离子交换层析、浓缩、结晶和干燥等制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸成品。由上述技术方案可知，本发明提供了一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产用酶组合物及一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。本发明所述酶组合物由腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶组成。四种酶合理组合可以高效催化制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。本发明所述酶组合物可循环利用，成本低，节能环保。本发明所述酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法以腺苷为底物，通过添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产用酶组合物，可以低成本、安全可靠制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，降低现有路线的成本，使其适应规模化生产，为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在生物催化和药品领域的使用提供保证。具体实施方式本发明公开了一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。腺苷激酶(ak)酶活测定方法：反应体系如下：1ml0.1mmgac2，1ml1mgly-naoh(ph9.0)，2ml0.1％溴麝香草酚蓝，48mgatp和53mg腺甘酸，并加超纯水至总体积20ml获得反应混和液，其各组分浓度如下：5mmmgac2(醋酸镁)，50mmgly-naoh(甘氨酸-氢氧化钠)，0.01％溴麝香草酚蓝，4.7mmatp，和10mm腺苷。用0.5mnaoh调节614nm处的吸光值约为2.2±0.3，使反应混合液ph值接近7.4±0.3，反应混合物需现配现用。将ak(3.68mg/ml)用tris-buffer(20mmtrishcl，500mmnacl，5％glycerol，ph8.0)进行梯度稀释，然后取5μl稀释后的bmadk加入995μl反应混合物中，利用光程为1cm的塑料比色皿，在du800核酸/蛋白分析仪(beckman，usa)上记录反应体系在180s内614nm处的吸光度。反应速度定义为反应前10s在614nm处吸光值变化直线的斜率。腺嘌呤磷酸核糖转移酶(aprt)酶活测定方法：酶反应体系及反应条件如下：100mmtris-hcl(ph7.0)，20mmmgcl2，1mmamp，1mm六偏磷酸钠，30℃反应15min，沸水煮5min灭酶，离心，上清液过膜。采用hplc检测腺嘌呤的含量，具体为c18hplc色谱柱，250mm×4.6mm；流动相：磷酸三乙胺水溶液(其中磷酸含量0.6％(v/v)，用三乙胺调节ph至6.6)：甲醇＝90:10；紫外检测器，波长254nm，柱温30℃，流速1ml/min，进样量5μl。烟酰胺磷酸核糖转移酶(nmprt)酶活测定方法：酶反应体系及反应条件如下：100mmtris-hcl(ph7.0)，1mmatp，1mm烟酰胺，1mm5-phospho-α-d-ribose1-diphosphate，30℃反应15min，用盐酸水灭酶，离心，上清液过膜。采用hplc检测nmn的含量，具体为c18hplc色谱柱，250mm×4.6mm；流动相：0.1％tfa，甲醇；紫外检测器，波长260nm，柱温25℃，流速0.8ml/min，进样量5μl。烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(nmnat)酶活测定方法：酶反应体系及反应条件如下：100mmtris-hcl(ph7.0)，300mmmgcl2，5mmatp，5mmnmm，37℃反应10min，用盐酸水灭酶，离心，上清液过膜。采用hplc检测nad的含量，具体为c18hplc色谱柱，150mm×4.6mm；流动相：25mmph＝7.0tris-hac，甲醇；紫外检测器，波长260nm，柱温30℃，流速0.8ml/min，进样量5μl。为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中，种子培养基配方为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l。发酵培养基配方为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl8g/l，甘油10g/l，磷酸一氢钾1.2g/l，磷酸二氢钾1.8g/l，硫酸镁1g/l。实施例1、制备nadp+生产用酶根据4种酶基因的序列，设计4对扩增引物。提取大肠杆菌(escherichiacoli)菌株基因组dna，以其为模板，pcr扩增ak片段，并将其连接至pet28a载体(购于novagene公司)；提取大肠杆菌(escherichiacoli)菌株基因组dna，以其为模板，pcr扩增aprt片段，并将其连接至pet28a载体(购于novagene公司)；提取杜克雷氏嗜血杆菌(haemophilusducreyi)(购于上海捷瑞生物工程有限公司)基因组dna，以其为模板，pcr扩增nmprt基因片段，并将其连接至pet28a载体(购于novagene公司)；提取詹氏甲烷球菌(methanococcusjannaschii)菌株基因组dna，以其为模板，pcr扩增nmnat基因片段，并将其连接至pet28a载体(购于novagene公司)；4种基因片段连接成功经测序正确后，分别转入e.colibl21(de3)菌株(上海唯地生物技术有限公司)。其中，腺苷激酶(ak)的序列为：atgcgtatcattctgcttggcgctccgggcgcggggaaagggactcaggctcagttcatcatggagaaatatggtattccgcaaatctccactggcgatatgctgcgtgctgcggtcaaatctggctccgagctgggtaaacaagcaaaagacattatggatgctggcaaactggtcaccgacgaactggtgatcgcgctggttaaagagcgcattgctcaggaagactgccgtaatggtttcctgttggacggcttcccgcgtaccattccgcaggcagacgcgatgaaagaagcgggcatcaatgttgattacgttctggaattcgacgtaccggacgaactgatcgttgaccgtatcgtcggtcgccgcgttcacgcgccgtctggtcgtgtttatcacgttaaattcaatccgccgaaagtagaaggtaaagacgacgttaccggtgaagaactgactacccgtaaagacgatcaggaagaaaccgtacgtaaacgtctggttgaataccatcagatgacagcaccgctgatcggctactactccaaagaagcggaagcgggtaacaccaaatacgcgaaagttgacggcaccaagccggttgctgaagttcgcgctgatctggaaaaaatcctcggc；扩增引物序列为ak-f:5’-3’:agtcgcatcatatgcgtatcattctgctt，划线为酶切位点ndei；ak-r:3’-5’:gcgcgatagaattcgccgaggattttttcc，划线为酶切位点ecori。腺嘌呤磷酸核糖转移酶(aprt)的序列为atgaccgcgactgcacagcagcttgagtatctcaaaaatagcatcaaaagcattcaggactacccaaaacccggcattcttttccgcgatgtcaccagcttactggaagacccgaaagcttacgctctcagcatcgacttgctggttgagcgttacaaaaatgcgggcattaccaaagttgtcggcaccgaagcgcgtggcttcttgtttggcgctccggtagctctgggtctgggcgttggctttgtaccggtccgtaaaccgggcaaactgccgcgtgaaaccatcagtgaaacttacgacctggaatacggcaccgatcagctggagatccacgttgatgccatcaaaccgggcgacaaagttctggtggtggacgacctgctggcaaccggcggcactatcgaagcgaccgttaaactgatccgtcgtctgggtggtgaagtggctgacgctgcgttcattatcaacctgttcgatctcggcggcgaacagcgtctcgaaaaacagggcattaccagctacagccttgtcccgttcccgggccattaa；扩增引物序列为aprt-f:5’-3’:agtcgcatcatatgaccgcgactgcacag，划线为酶切位点ndei；aprt-r:3’-5’:gcgcgatagaattcttaatggcccgggaacggg，划线为酶切位点ecori。烟酰胺磷酸核糖转移酶(nmprt)的序列为atggataacctattaaattatagtagtcgtgctagtgctataccatcattattatgcgatttttacaaaacatctcatcgaataatgtatcccgaatgttcacaaattatttatagtacatttacacctcgtagcaatgaacaagcgccttatttaacacaagttgtgtcatttggttttcaagcctttatcattaaatatttaattcattattttaatgataactttttttctcgagataaacatgatgttgtgactgaatactctgcatttattgagaaaaccttacagttagaggatacgggtgaacacattgcaaaattacatgagttgggttatttgcctatccggattaaagctattcctgaaggaaaaacggtggcaattaaagttccggtgatgacgattgaaaatacgcattctgatttcttttggcttactaactatttagaaacattaattaatgtatcactttggcagccgatgacttctgcctcgattgcttttgcttatcggacagcattaattaaatttgctaatgaaacttgtgataatcaagaacatgtgccatttcaatcgcatgatttttcaatgcgtggtatgagttctttagaatccgcagaaacttcaggtgctggccatttaacttcttttttaggtacagacactattcctgcactctcttttgttgaagcgtattatggttcaagcagtctaattggcacgtctatacccgcttctgagcattcagtaatgagttcacatggtgtcgatgaattatcaacatttcgttatttaatggcaaaatttccgcataatatgttgtcaattgtgtcagatactacagacttttggcataacattaccgttaatttgccgttattaaagcaagaaattatagcaaggccagaaaatgcccgtttagtcattcgtccagatagcggtaacttttttgcgattatttgtggtgatccaaccgctgatactgagcatgaacgtaaaggactcattgaatgtttatgggatatttttggtggtacagttaatcagaaaggttataaagtgatcaatccacatattggggcaatttatggtgatggcgtgacttatgaaaaaatgtttaagatcttagaaggattacaagccaaaggatttgcctcaagtaatattgtgtttggcgttggtgcacaaacctatcaacgtaatacacgtgatacgttgggctttgcgcttaaagcgacatctatcactattaatggcgaagaaaaagctattttcaaaaatcctaaaaccgatgatggttttaaaaaatcgcaaaaaggtcgtgttaaagtgctttctcgtgatacttacgttgatggtttaacttcagcggatgattttagtgatgatttattagagctgttatttgaagatggtaagttattacgccaaacagactttgatgaaattcggcaaaacttgttagttagtcgcactacgctatga；扩增引物序列为nmprt-f:5’-3’:agtcgcatcatatggataacctattaaattatag，划线为酶切位点ndei；nmprt-r:3’-5’:gcgcgatagaattctcatagcgtagtgcgactaactaac，划线为酶切位点ecori。烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(nmnat)的序列为atgagagggtttataattggtaggtttcagccattccataagggacatttagaagtaataaaaaagatagctgaggaggttgatgaaataattattggaataggtagtgctcaaaaaagtcataccttagaaaatccattcacagctggtgagagaatcttaatgataacacaatcgcttaaagattatgatttaacctattatccaatccctataaaagatattgagttcaactctatctgggtttcttatgttgaatctttaacccctccatttgatattgtgtatagtggaaacccattagttagagttttgtttgaggagaggggatatgaggtaaaaaggccagagatgtttaataggaaagaatattcaggaactgaaattaggagaaggatgttaaatggagagaaatgggagcatttggttcctaaagcagttgttgatgttattaaagaaataaaaggtgttgaacggcttagaaaattagctcagacagacaaataa；扩增引物序列为nmnat-f:5’-3’agtcgcatcatatgagagggtttataattggtag:，划线为酶切位点ndei；nmnat-r:3’-5’:gcgcgatagaattcttatttgtctgtctgagctaattttc，划线为酶切位点ecori。菌株在无菌条件下接入种子培养基，培养至对数生长期后接入5l发酵培养基的发酵罐中，继续培养至对数生长期后接入含50l发酵培养基的发酵罐中，培养5小时后加入1mmiptg25℃诱导20小时，离心收集菌体。收获的菌体分别经超声或高压均质破碎后，离心收集上清并用镍离子亲和柱进行纯化，获得高质量纯化的酶。制备固定化生产用酶或细胞：将4.0克聚乙二醇溶解在45m1的水中，加入6.0克聚乙烯醇(pva)并将温度升到90-95℃溶解。待聚乙烯醇完全溶解后，将温度降至25-30℃，加入重组细胞或纯化的酶，混合均匀，用一次性吸管吸取混合液，并注在平面上形成圆片状，并在30℃温浴1小时。移入0.1m硫酸钠溶液稳定2-3小时，滤干并用灭菌水洗涤两次，置于磷酸缓冲液中待用。使用上述测定酶活性的方法，检测到1mg/ml腺苷激酶(ak)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(aprt)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(nmprt)和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(nmnat)酶液活性分别约为50u、20u、10u和50u，其中1个活性单位(u)定义为将1μm底物在1分钟内完全转化为产物所需要的酶量。实施例2、制备nad底物腺苷100g、烟酰胺68.5g、六偏磷酸钠330g、atp300g、mgcl2·6h2o110g，加入5lph7.0磷酸缓冲溶液中，搅拌均匀，调节ph至7.0。在反应液中加入ak、aprt、nmprt和nmnat四种酶组成的酶组合物，其中酶组合物中ak:aprt:nmprt:nmnat的质量比为1:1:1:1，反应期间控制ph保持在7.0，反应温度30-35℃，振荡反应13小时后，hplc检测反应上清液中nad生成量为35g/l，纯度70％，腺苷转化率为94％。hplc检测条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相a相为25mmtris-hac，b相为甲醇，检测波长260nm，柱温25℃，洗脱程序如表1所示。表1洗脱程序过滤收集的上清液通过大孔强碱性阴离子交换树脂离子交换层析、浓缩、结晶、干燥后制得成品nad175g，纯度98.7％，总收率75％。实施例3、制备nad底物腺苷100g、烟酰胺68.5g、六偏磷酸钠330g、atp300g、mgcl2·6h2o110g，加入5lph7.0磷酸缓冲溶液中，搅拌均匀，调节ph至7.0。在反应液中加入ak、aprt、nmprt和nmnat四种酶组成的酶组合物，其中酶组合物中ak:aprt:nmprt:nmnat的质量比为1:2:1:1，反应期间控制ph保持在7.0，反应温度30-35℃，振荡反应12小时后，hplc检测反应上清液中nad生成量为37.7g/l，纯度75％，腺苷转化率为95％。hplc检测条件同实施例2。过滤收集的上清液通过大孔强碱性阴离子交换树脂离子交换层析、浓缩、结晶、干燥后制得成品nad188.7g，纯度99.0％，总收率80％。实施例4、制备nmn底物腺苷100g、烟酰胺68.5g、六偏磷酸钠330g、atp300g、mgcl2·6h2o110g，加入5lph7.0磷酸缓冲溶液中，搅拌均匀，调节ph至7.0。在反应液中加入ak、aprt、nmprt和nmnat四种酶组成的酶组合物，其中酶组合物中ak:aprt:nmprt:nmnat的质量比为1:1:2:1，反应期间控制ph保持在7.0，反应温度30-35℃，振荡反应11小时后，hplc检测反应上清液中nad生成量为36.8/l，纯度72％，腺苷转化率为95％。hplc检测条件同实施例2。过滤收集的上清液通过大孔强碱性阴离子交换树脂离子交换层析、浓缩、结晶、干燥后制得成品nad184g，纯度98.9％，总收率78％。实施例5、制备nad底物腺苷100g、烟酰胺68.5g、六偏磷酸钠330g、atp300g、mgcl2·6h2o110g，加入5lph7.0磷酸缓冲溶液中，搅拌均匀，调节ph至7.0。在反应液中加入ak、aprt、nmprt和nmnat四种酶组成的酶组合物，其中酶组合物中ak:aprt:nmprt:nmnat的质量比为1:3:1:1，反应期间控制ph保持在7.0，反应温度30-35℃，振荡反应10小时后，hplc检测反应上清液中nad生成量为39g/l，纯度78％，腺苷转化率为96％。hplc检测条件同实施例2。过滤收集的上清液通过大孔强碱性阴离子交换树脂离子交换层析、浓缩、结晶、干燥后制得成品nad195.5g，纯度99.2％，总收率82％。实施例6、固定化酶或固定化细胞活性检测nad的四种生产用酶的固定化酶或固定化细胞可以循环使用，按照现有技术记载的公知的测定酶活性的方法对nad的四种生产用固定化酶按1:1:1:1的质量比混合循环反应20次进行跟踪检测，结果如表1。表2固定化酶循环反应或4℃储存的酶活性变化固定化酶使用次数/4℃存储时间酶活性u/mg固定化酶酶活40固定化酶使用5次38.5固定化酶使用10次36.5固定化酶使用15次33.8固定化酶使用20次30.1未使用存储15天36.1未使用存储30天30.2结果显示，nad的四种生产用固定化酶随着循环次数的增加，酶活性逐渐降低。但循环反应20次，酶活性仅降低约25％。nad的四种生产用固定化酶在4℃储存时间一月以上的酶活性也仅降低约25％。按1:1:1:1、1:2:1:1、1:2:1:1的质量比混合后循环反应20次酶活性也仅降低20-25％。此外，nad的四种生产用酶的固定化细胞的活性随着循环次数的增加或4℃储存时间的延长也仅降低20-25％。综上所述，表明本发明所述酶组合物可循环利用。当前第1页12