一种提高L-色氨酸生产效率的方法与流程

本发明属于l-色氨酸生产技术领域，具体涉及一种提高l-色氨酸生产效率的方法。

背景技术：

l-色氨酸的分子式为c11h12o2n2，分子量为204.21，含氮13.72%。l-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，呈绢丝光泽、六角片状自色晶体，无臭，有甜味，在水中溶解度1.14g/l（25℃），溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解，微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。

l-色氨酸是人和动物生命活动中八大必需氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要作用，被称为第二必需氨基酸。l-色氨酸对人、动物的生长发育及生命活动起着重要的作用，仅次于赖氨酸之后,但在人体和动物体中不能合成,必须从外部摄取以满足生理需求。在生物体内，从l-色氨酸出发可合成5一羟基色胺、吲哚乙酸、烟酸、色素、生物碱和辅酶等生物活性物质。在临床上主要用于医药，它在神经系统中的含量与神经的兴奋和抑制状态有关，从而促进睡眠和精神安定，用做保健食品和安神药。l-色氨酸也是一些植物蛋白中比较缺乏的氨基酸，用它强化食品和饲料添加剂对提高植物蛋白的利用率具有重要作用。它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸。另外，l-色氨酸还有防霉、消毒以及阻止氧化的作用，可以作为鱼类保鲜剂。

l-色氨酸的生产经历了蛋白质水解法、化学合成、酶促转化以及微生物直接发酵法四个发展历程。随着现代生物科学技术的发展，对原本受自然调控的生物逐渐有了可控性，特别是基因重组技术及代谢工程思想的提出及运用，为微生物直接发酵法进行l-色氨酸的生产创造了新的机遇。微生物直接发酵法生产氨基酸具有原料便宜、产物易于分离等优点受到了广泛关注。

由于色氨酸在微生物中的代谢流错综复杂，其合成受制于极其严格酶调控机制，导致流向色氨酸的代谢流受阻，从而使色氨酸在微生物很难积累。通过分析l-色氨酸生物合成的研究机制，在此基础上对相关基因进行合理调控，促使代谢流流向l-色氨酸的合成。l-色氨酸代谢调控机制包含多种底物或中间产物的反馈抑制及阻遏效应，同时还伴有操纵子的弱化效应，多样复杂的细胞调控对于直接通过微生物直接发酵法进行l-色氨酸的生产带来极大的挑战。近年来,对氨基酸转运系统的研究结果表明，通过提高胞内目的氨基酸的分泌速率同时降低胞外目的氨基酸的吸收速率，使胞内目的氨基酸浓度保持在较低水平，促进菌体合成目氨基酸。氨基酸转运系统分为分泌系统和吸收系统，由于关于l-色氨酸分泌系统基因还未得到鉴定。用基因工程手段构建的工程菌株虽能解除色氨酸合成过程中的负反应反馈抑制且增强一些关键酶的表达，但实际发酵中又出现一些新问题，如发酵中后期l-色氨酸合成速率明显下降、工艺控制中的糖点要求精度高、乙酸等代谢副产物积累等。

文献“琥珀酸对大肠杆菌发酵生产l-色氨酸的影响，发酵科技通讯2017年”，在30l发酵罐上进行实验，在发酵10h后随糖外源流加1g/l的琥珀酸，以降低代谢抑制物质的积累量，提高l-色氨酸的产量，结果发现：外源流加1g/l的琥珀酸发酵与未流加琥珀酸发酵相比，菌体生物量与l-色氨酸产量分别提高了5.4%和10%，乙酸积累量下降了9.5%，糖酸转化率提高了4.0%。这表明外源流加1g/l琥珀酸发酵可以提高l-色氨酸的产量，降低乙酸的积累量，提高糖酸转化率。

申请人对于l-色氨酸发酵作了深入的研究，例如，“cn201711289822”公开了采用单一菌株发酵的方式，通过添加电气石以及使用透析培养基来提高发酵产酸量；该方法提高了发酵产酸量，但是需要更换培养基，操作难度较大，容易造成部分菌株死亡。“cn2018115428142”公开了一种发酵生产l-色氨酸的工艺，其中在发酵培养基中添加了氯化胆碱，并且在发酵中期流加含有吲哚的营养液，提高了色氨酸的发酵产量，最高可达到50g/l。在现有技术的基础上，需要对发酵条件进行进一步优化，以提高l-色氨酸的产量。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种提高l-色氨酸生产效率的方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的。

一种提高l-色氨酸生产效率的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

当发酵至12h时，将营养液a流加进发酵罐内，直至发酵结束；

当发酵至24h时，将营养液b流加进发酵罐内，直至发酵结束；

所述营养液a的组分包括六水合氯化钴；

营养液b的组分包括葡萄糖，吲哚，肌醇，苯丙氨酸以及酪氨酸。

优选地，所述营养液a的组分包括六水合氯化钴和脲。

优选地，所述营养液a的组分为：六水合氯化钴10-30mg/l，脲5-20g/l，其余为水。

优选地，所述营养液b的组分为：葡萄糖100g/l，吲哚1g/l，肌醇0.5g/l，苯丙氨酸0.3-0.8g/l，酪氨酸0.2-0.7g/l，其余为水。

更优选地，所述营养液a的组分为：六水合氯化钴20mg/l，脲10g/l，其余为水。

更优选地，所述营养液b的组分为：葡萄糖100g/l，吲哚1g/l，肌醇0.5g/l，苯丙氨酸0.5g/l，酪氨酸0.4g/l，其余为水。

具体地，所述方法包括如下步骤：

以5-12%的接种量将产l-色氨酸的大肠杆菌种子液接入到装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度36-37℃，溶氧量为20-30%，通过数控自动流加氨水维持罐内系统ph在6.8-7.2，流加消泡剂消泡；总发酵时间为40-42h，得到l-色氨酸发酵液；

当发酵至12h时，将营养液a流加进发酵罐内，按每l发酵液计，流加速度为0.005-0.015ml/min，直至发酵结束；

当发酵至24h时，将营养液b流加进发酵罐内，维持罐内糖浓度为0.8-1.5g/l，直至发酵结束。

优选地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/l，磷酸氢二钾9g/l，酵母膏5g/l，柠檬酸4.6g/l，硫酸铵1.8g/l，七水硫酸镁1.6g/l，氯化胆碱0.4g/l，七水硫酸亚铁65mg/l，生物素0.2mg/l。

本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性：

本发明从大肠杆菌合成芳香族氨基酸的通路出发，采用多种方式对代谢途径进行调节，相互协同，提高了色氨酸的产量和产酸速率；

本发明通过在发酵中期添加苯丙氨酸和酪氨酸，此时芳香族氨基酸的产量处于快速积累过程中，会对分枝酸向预苯酸转化产生反馈抑制作用，从而使得分枝酸更多地流向邻氨基苯甲酸途径，使得色氨酸产量提高；

与其他金属离子相比较，钴离子对dahp合成酶构象的影响更大，可作为酶的激活剂来使用，本研究发现，发酵初期添加钴离子对dahp合成酶的活性影响有限，并不能提高色氨酸的产量，可能是发酵初期，芳香族氨基酸合成途径并未启动，此时酶的分泌量也相对较少，选择在色氨酸大量合成的时间点来添加钴离子，能够有效提高色氨酸的产量。

在发酵初期添加脲，其主要作为无机氮源供菌株增殖使用，并不会对dahp合成酶的活性造成影响，而发酵至12h时，菌株增殖放缓，此时以合成代谢物为主，通过添加脲，能够提高dahp合成酶的活性，从而促进芳香族氨基酸合成途径的代谢流增大，进而促进色氨酸产量的增加。

说明书附图

图1：苯丙氨酸和酪氨酸对色氨酸产量的影响；

图2：苯丙氨酸和酪氨酸对发酵产酸速率的影响；

图3：六水合氯化钴浓度对色氨酸产量的影响；

图4：脲浓度对色氨酸产量的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种提高l-色氨酸生产效率的方法，其包括如下步骤：

发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/l，磷酸氢二钾9g/l，酵母膏5g/l，柠檬酸4.6g/l，硫酸铵1.8g/l，七水硫酸镁1.6g/l，氯化胆碱0.4g/l，七水硫酸亚铁65mg/l，生物素0.2mg/l；营养液a的组分为：六水合氯化钴20mg/l，脲10g/l；

营养液b的组分为：葡萄糖100g/l，吲哚1g/l，肌醇0.5g/l，苯丙氨酸0.5g/l,酪氨酸0.4g/l；

以大肠杆菌菌株e.colitrth为例，以8%的接种量将种子液（od600值为11.2）接入到装有600l发酵培养基的1000l发酵罐中，培养温度36.8℃，溶氧量为20%，通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统ph在7.0-7.2，流加消泡剂消泡；总发酵时间为42h，得到l-色氨酸发酵液。

当发酵至12h时，将营养液a流加进发酵罐内，按每l发酵液计，流加速度为0.01ml/min，直至发酵结束；

当发酵至24h时，将营养液b流加进罐内，维持罐内糖浓度为1g/l，直至发酵结束。

实施例2

一种提高l-色氨酸生产效率的方法，其包括如下步骤：

发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/l，磷酸氢二钾9g/l，酵母膏5g/l，柠檬酸4.6g/l，硫酸铵1.8g/l，七水硫酸镁1.6g/l，氯化胆碱0.4g/l，七水硫酸亚铁65mg/l，生物素0.2mg/l；

营养液a的组分为：六水合氯化钴30mg/l，脲15g/l；

营养液b的组分为：葡萄糖100g/l，吲哚1g/l，肌醇0.5g/l，苯丙氨酸0.4g/l,酪氨酸0.3g/l；

以大肠杆菌菌株e.colitrth为例，以8%的接种量将种子液（od600值为11.8）接入到装有600l发酵培养基的1000l发酵罐中，培养温度36.8℃，溶氧量为20%，通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统ph在7.0-7.2，流加消泡剂消泡；总发酵时间为40h，得到l-色氨酸发酵液。

当发酵至12h时，将营养液a流加进发酵罐内，按每l发酵液计，流加速度为0.008ml/min，直至发酵结束；

当发酵至24h时，将营养液b流加进罐内，维持罐内糖浓度为1g/l，直至发酵结束。

对比例1

一种提高l-色氨酸生产效率的方法，其包括如下步骤：

发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/l，磷酸氢二钾9g/l，酵母膏5g/l，柠檬酸4.6g/l，硫酸铵1.8g/l，七水硫酸镁1.6g/l，氯化胆碱0.4g/l，七水硫酸亚铁65mg/l，生物素0.2mg/l；

营养液的组分为：葡萄糖100g/l，吲哚1g/l，肌醇0.5g/l；

以大肠杆菌菌株e.colitrth为例，以8%的接种量将种子液（od600值为11.2）接入到装有600l发酵培养基的1000l发酵罐中，培养温度36.8℃，溶氧量为20%，通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统ph在7.0-7.2，流加消泡剂消泡；总发酵时间为42h，得到l-色氨酸发酵液。

当发酵至24h时，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为1g/l，直至发酵结束。

实施例3

在已有研究成果对比文件1的基础上进行研究。

验证苯丙氨酸和酪氨酸对色氨酸产量和发酵产酸速率的影响，方式1：在发酵培养基中添加苯丙氨酸0.5g/l,酪氨酸0.4g/l；方式2：在营养液中添加苯丙氨酸0.5g/l,酪氨酸0.4g/l；如图1所示，方式2选择在营养液中添加苯丙氨酸和酪氨酸，色氨酸产量和发酵产酸速率均高于方式1，该营养液是在发酵中期添加，此时，芳香族氨基酸的产量处于快速积累过程中，通过添加苯丙氨酸和酪氨酸，会对分枝酸向预苯酸转化产生反馈抑制作用，从而使得分枝酸更多地流向邻氨基苯甲酸途径，使得色氨酸产量提高；而方式1在发酵培养基中添加，发酵初期芳香族氨基酸的积累较少，苯丙氨酸和酪氨酸对分枝酸向预苯酸转化的反馈抑制并未启动，此时添加苯丙氨酸和酪氨酸会被菌体细胞吸收利用，对色氨酸合成的正向调节效果并不明显。

在上述研究的基础上，选择在营养液b中添加苯丙氨酸和酪氨酸；进一步探讨六水合氯化钴对色氨酸产量的影响；钴离子能够影响dahp合成酶的构象，作为酶的激活剂来使用，本研究发现，发酵初期添加钴离子对dahp合成酶的活性影响有限，并不能提高色氨酸的产量，可能是发酵初期，芳香族氨基酸合成途径并未启动，此时酶的分泌量也相对较少；因此，我们选择在色氨酸大量合成的时间点来添加钴离子，考虑到过大量营养液的添加会对发酵液造成稀释作用，设定每l发酵液计，流加速度为0.01ml/min较为合适，在该流速下，设置浓度分别为1,2.5,5,10,20,30,40,60,80（mg/l）；如图3所示，随着六水合氯化钴浓度的增加，色氨酸产量也所有提高，20-30mg/l时对色氨酸影响最大，继续增大浓度并没有明显改变，当浓度为60mg/l以上后，色氨酸产量反而有所下降，过大量的钴离子可能对菌株生长造成抑制。

选择六水合氯化钴的浓度为20mg/l，添加时机为发酵至12h时，按每l发酵液计，流加速度为0.01ml/min；验证脲添加时机和添加浓度对色氨酸产量的影响，申请人尝试在发酵培养基中添加脲，对色氨酸产量没有明显影响，发酵初期添加脲，其主要作为无机氮源供菌株增殖使用，并不会对dahp合成酶的活性造成影响，而发酵至12h时，菌株增殖放缓，此时以合成代谢物为主，通过添加脲，能够提高dahp合成酶的活性，从而促进芳香族氨基酸合成途径的代谢流增大，进而促进色氨酸产量的增加，设置脲的浓度分别为1,5,10,15,20,25,30（g/l）；如图4所示，随着脲浓度的增加，色氨酸产量也所有提高，当增大10g/l后，增幅放缓，然后趋于平稳。

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，这对本领域技术人员而言应该很明确，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明保护的范围。