一种E-ASV多肽及其在制备非小细胞肺癌新抗原疫苗中的用途的制作方法

本发明涉及肿瘤新抗原领域，具体是一种e-asv多肽及其在制备非小细胞肺癌新抗原疫苗中的用途。

背景技术：

肺癌是最常见的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(nsclc)可高达85％，目前在全世界范围内发病率及病死率均位居前列，5年生存率仅15.6％。驱动基因与nsclc的发生发展密切相关，其中egfr是最常见的肺癌驱动基因。近年来以egfr为靶点的分子靶向治疗已成为nsclc治疗的标准方案，而egfr突变是其靶向治疗的重要疗效预测因子。egfr突变类型主要包括点突变、插入、缺失以及拷贝数变异等，多集中在exon18～21。稀有egfr突变中最常见突变是20外显子插入突变。egfrexon20编码的氨基酸部位是从762到823位，包括c-螺旋终止点。而egfr20外显子插入突变的不同位置可导致nsclc细胞对egfr-tki敏感性不同。据报道，仅4％的egfr20外显子插入突变位于c-螺旋内，携带此类egfr20外显子插入突变的nsclc患者对egfr-tki治疗敏感。相反，90％的egfr20外显子插入突变位于c-螺旋终止点之后，携带此类egfr20外显子插入突变的nsclc患者表现为对egfr-tki的原发性耐药。因此大多数携带egfr20外显子插入突变的nsclc具有先天的tki抗性，导致其分子靶向治疗的整体临床疗效差强人意。

近年来，虽然以免疫检查点抑制剂为代表的免疫治疗在nsclc治疗上发挥了越来越重要的作用，但对egfr突变阳性nsclc患者而言，免疫检查点抑制剂的效果并不理想，需要寻求新的免疫治疗方案。而肿瘤新抗原(tumorneoantigen,tna)为部分egfr突变阳性的nsclc提供了潜在的抗肿瘤治疗靶点。tna指肿瘤细胞恶性转化过程中由于基因变异而产生的，仅表达与肿瘤细胞表面而不存在于正常细胞表面的新抗原。基因突变产生的新抗原蛋白在细胞内被降解成短肽，与mhc分子结合，并以复合物形式呈递到细胞表面，被t淋巴细胞识别，引起t淋巴细胞扩增和活化，进而攻击并杀伤肿瘤细胞。肿瘤新抗原特异性针对肿瘤细胞，对正常组织没有毒性，因此毒副作用轻微。

肿瘤新抗原常规通过基因组学方法筛选具有抗原性的肿瘤内源性基因变异，鉴定出该基因变异对应的tna，然后用该抗原刺激自体抗原特异性t淋巴细胞大量增殖活化，以达到杀灭肿瘤细胞，使肿瘤消退的目的。大多tna来源于罕见的非同义单核苷酸突变(non-synonymoussingle-nucleotidevariant)，框移突变(frameshiftmutation)、剪接变异(splicevariant)和基因融合(genefusion)，人群中发生频率极低，不利于通用型tna疫苗的开发。但目前关于发生频率较高的热点基因变异，如egfr20外显子插入突变是否可制备tna疫苗尚未有报道。

egfr的20外显子插入突变属框内突变(in-framemutation)，框内突变会造成基因的氨基酸序列和空间结构发生改变，与原编码序列差异越明显的框内突变越容易产生被t淋巴细胞识别的新抗原，诱导特异性t淋巴细胞的扩增和活化，识别并杀伤携带相应基因变异的肿瘤细胞。egfr20外显子插入突变v769_d770insasv是nsclc中最常见的egfr框内突变(19.02％)，因此本发明设计靶向上述突变的tna多肽e-asv-10和e-asv-19，通过细胞实验和动物模型首次证实e-asv-10和e-asv-19具备诱导特异性t淋巴细胞扩增和活化，识别并杀伤携带相应egfr20外显子插入突变nsclc细胞的活性，并提出tna多肽e-asv-10和e-asv-19可作为一种新的肿瘤疫苗用于治疗携带相应基因变异的nsclc的潜在临床应用前景。

技术实现要素：

本发明为了解决上述技术问题，所提出的一种e-asv多肽及其在制备非小细胞肺癌新抗原疫苗中的用途。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种e-asv多肽，氨基酸序列为seqid:no1。

一种e-asv多肽，氨基酸序列为seqid:no2。

进一步的，所述e-asv多肽包含egfr20外显子插入突变v769_d770insasv翻译后的核心序列(yvmasvasv)。

进一步的，所述e-asv多肽能够诱导和扩增特异性t淋巴细胞，识别并杀伤携带相应egfr20外显子插入突变nsclc细胞。

进一步的，所述nsclc细胞为携带能够翻译出特定核心序列的egfr20外显子插入突变的hla-a^*02型nsclc细胞。

一种e-asv多肽在制备非小细胞肺癌新抗原疫苗中的用途。

进一步的，所述e-asv多肽包含egfr20外显子插入突变v769_d770insasv翻译后的核心序列(yvmasvasv)。

进一步的，所述e-asv多肽的氨基酸序列为seqid:no1。

进一步的，所述e-asv多肽的氨基酸序列为seqid:no2。

进一步的，非小细胞肺癌细胞为携带能够翻译出特定核心序列的egfr20外显子插入突变的hla-a^*02型nsclc细胞。

本发明获得了如下的有益效果。

本发明的e-asv-10和e-asv-19多肽能够在体内外诱导特异性t淋巴细胞扩增和活化，识别并杀伤携带能够翻译出核心序列yvmasvasv的egfr20外显子插入突变的nsclc细胞。这表明本发明的e-asv-19和e-asv-10多肽可作为tna疫苗，用于治疗携带特定egfr20外显子插入突变的nsclc的潜在临床应用价值。

附图说明

图1是本发明用生物信息学算法预测不同egfr20外显子插入突变多肽与hla-a^*02分子的结合力图；

图2是本发明e-asv-10合成多肽的高效液相色谱及质谱分析图；

图3是本发明e-asv-19合成多肽的高效液相色谱及质谱分析图；

图4是本发明用流式细胞术检测e-asv-10和e-asv-19诱导hla-a^*02型人t淋巴细胞的扩增和活化图；

图5是本发明用酶联免疫斑点法检测e-asv-10和e-asv-19刺激hla-a^*02型人t淋巴细胞分泌ifn-γ图；

图6是本发明构建的携带egfrv769_d770insasv突变的小鼠nsclc细胞系llc^asv细胞图；

图7是本发明用酶联免疫斑点法检测e-asv-10刺激balb/c和c57bl/6小鼠t淋巴细胞分泌ifn-γ图；

图8是本发明e-asv-10多肽预免疫小鼠的特异性t淋巴细胞对llc^asv细胞的体外杀伤活性图。

图9是本发明e-asv-10多肽预免疫小鼠的特异性t淋巴细胞对llc^asv细胞的体内抑瘤活性图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步说明。

一、多肽序列

e-asv-10：ayvmasvasv(seqid:no1)

e-asv-19：ldeayvmasvasvdnphvc(seqid:no2)

二、实验方法

1.筛选egfrexon20插入突变的tna多肽

根据ncbi数据库提供的egfr蛋白序列(np_005219.2)，针对egfr20外显子插入突变v769_d770insasv插入位置的核酸序列设计多肽序列，以突变位点为中心，两端各扩展10肽，并利用生物信息学软件(iedbhttp://tools.iedb.org/mhci/)、netmhc4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/netmhc/)和syfpeithi(http://www.syfpeithi.de/bin/mhcserver.dll/epitopeprediction.htm)对多肽序列进行打分，通过计算机模拟tna多肽与不同mhc-i分子的结合过程，根据afnd(http://www.allelefrequencies.net/hla.asp)数据库预测其与主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,mhc)-i类分子的亲和力，结合iedb数据库netmhcpan4.0算法进行蛋白质结合和解离速度的计算，选取ic50较小的多肽进行后续功能验证。参数设定：ctl表位限制性mhc类型选取中国人群最常见类型hla-a*02型(31％)中高频亚型hla-a*02:01(49.72％)型和hla-a*02:06(24.65％)型；预测表位长度为9-10aa。

2.tna多肽的合成和溶液制备

tna多肽由上海生工生物工程有限公司合成，合成后进行脱盐处理，其纯度≥95％，高效液相色谱及质谱分析以明确其相对分子质量符合理论值。将合成多肽干粉加dmso溶解后，用无菌水配制成1mg/ml的无菌溶液备用。

3.外周血单核细胞分离和树突细胞培养

本发明主要与hla-a*02型的mhc-i类分子结合，所收集样本为hla-a*02型健康供者新鲜外周血。

(1)外周血单核细胞(pbmc)分离

①收集外周血与等体积的无血清培养基混匀稀释。

②在离心管中加入淋巴细胞分离液，与全血稀释液的比例为1:2。全血稀释液缓慢加入淋巴细胞分离液管中，保持液面分界明显。室温，水平转子1800rpm离心18min，设置较慢的加速度和减速度。

③分离后的液体分为四层，最上层为血浆层，往下云雾状白膜层为所需要的淋巴细胞层，第三层为含有分离液的过度层，最下层是红细胞。将白膜层小心的吸出，用pbs，1500rpm离心5分钟洗涤2遍。

(2)树突细胞(dc)培养

①吸取的白膜层细胞用无血清培养基调整浓度至2×10⁶/ml，37℃5％co2培养箱中孵育2h，使单核细胞贴壁，弃上清。

②在贴壁细胞中加入含ril-4(1000u/ml)、gm-csf(1000u/ml)的无血清培养基，37℃5％co2培养箱中培养，诱导单核细胞向dc细胞分化。

③每日观察细胞生长状态，在第3天进行半量换液，加入含ril-4(1000u/ml)、gm-csf(1000u/ml)的无血清培养基继续培养。

④在培养第6天，加入tnf-α(1000u/ml)诱导dc细胞成熟。

⑤在培养第7天收获成熟dc细胞，台盼蓝染色，计数。

4.流式细胞术检测特异性t细胞扩增活化

(1)特异性t细胞扩增

①收集外周血与等体积的无血清培养基混匀稀释。

②在离心管中加入ficoll分离液，与全血稀释液的比例为1:2。将全血稀释液缓慢加到分离液上面，1800rpm离心18min。

③分离后将白膜层小心的吸出，用pbs，1500rpm离心5分钟洗涤2遍，获得pbmc细胞备用。

④pbmc细胞加入无血清培养基，调整细胞浓度为2×10⁶/ml，按1:5比例将成熟dc与t细胞混合，分别加入il-21000u/ml，e-asv-10(20μg/ml)或e-asv-19(20μg/ml)，37℃5％co2条件下培养48h，继续加入上述dcs、rhil-2和多肽重复刺激一次。第5天收获t细胞，台盼蓝染色，计数。

(2)流式细胞术检测t细胞活化表型

①样本制备：将多肽刺激的特异性t细胞加至流式细胞管中，用pbs洗涤2遍，1500rpm，离心5min，弃上清，加入抗体染色。

②细胞表面染色：实验组加入荧光标记的抗人cd25和4-1bb单克隆抗体，对照组加入荧光标记的同型对照抗体，震荡混匀，室温避光孵育30min。

③用pbs洗涤细胞，300g，5min，弃上清。

④pbs重悬细胞，流式检测4-1bb⁺cd25⁺t细胞比例。

(3)流式细胞术检测t细胞分泌ifn-γ

①样本制备：将多肽刺激的特异性t细胞加至流式细胞管中，加入高尔基体阻断剂，放入37℃5％co2孵箱中培养4-6小时。

②细胞表面染色：细胞用pbs洗涤2遍，1500rpm，离心5min，弃上清，加入cd3-percp/cd4-fitc/cd8-pe单克隆抗体，室温避光20min。

③用pbs洗涤细胞2遍，1500rpm，离心5min，弃上清，加入1mlperm/wash洗涤细胞。

④弃上清，加入cytofix/cytoperm200μl，室温避光孵育20min后离心，弃上清。

⑤加入perm/wash500μl洗涤细胞后加入ifn-γ-apc抗体，室温避光孵育20min。

⑥perm/wash洗涤并重悬细胞，流式检测ifn-γ分泌细胞比例。

5.elispot检测tna诱导的t细胞特异性ifn-γ释放

(1)预包被板的活化：每孔加入200μl无血清培养基，室温静置5-10分钟后弃去。

(2)加入刺激后淋巴细胞：调整细胞浓度2.5×10⁶/ml，100μl/孔。

(3)tna多肽共孵：加入e-asv-10(20μg/ml)或e-asv-19(20μg/ml)，37℃，5％co2培养48h。

(4)裂解细胞：弃去孔内培养基，加入冰冷的去离子水，200μl/孔，4℃冰箱放置10min裂解细胞。

(5)洗板：甩出孔内液体，加入washingbuffer，200μl/孔，停留1min后弃去孔内液体，重复五次，每一次在吸水纸上扣干。

(6)抗体孵育：加入生物素标记的ifn-γ抗体工作液，100μl/孔。37℃，5％co2孵育1h。

(7)洗板：重复步骤5。

(8)酶联亲和素孵育：加入酶标亲和素工作液，100μl/孔，37℃，5％co2孵育1h。

(9)洗板：重复步骤5。

(10)显色：加入aec显色液，100μl/孔。室温避光静置10-20min，根据斑点生成情况选择终止显色时间，每隔5-10分钟检查一次。

(11)终止显色：弃去孔内液体，揭开板底座，用自来水洗涤正反面及底座3-5遍，终止显色。将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座。

(12)elispot板斑点计数：应用ctl酶联免疫斑点分析仪进行斑点计数。

6.构建携带v769_d770insasv突变的小鼠nsclc细胞系llc^asv

gv492质粒经bamhi/agei酶切，通过基因重组插入含有v769_d770insasv的小鼠egfr全长序列，重组产物经大肠杆菌dh5α转化，挑取单克隆进行pcr鉴定，对阳性克隆进行测序，选正确克隆菌液扩大培养并抽提高浓度质粒，包装慢病毒，浓缩和纯化后备用。将llc细胞铺于96孔板中，每孔约5000细胞，铺板时细胞融合率为10％左右，37℃，5％co2培养24小时，直至细胞融合率为20％～30％。将冻存的携带v769_d770insasv突变的慢病毒在冰上融化备用。感染试剂hitransgp用常规培养基稀释成1×，取处于对数生长期的llc细胞进行慢病毒转染，加入hitransgp(1×)97μl，慢病毒(1×10⁸)3μl，轻摇混匀，37℃，5％co2培养12h后换液，感染后72h检测感染效率。抗性筛选v769_d770insasv突变阳性细胞克隆，有限稀释法建立稳转细胞系llc^asv细胞，用于后续功能实验。

7.rt-pcr检测llc^asv携带v769_d770insasv突变

(1)提取总rna

①收集llc^asv，加入trizol，吹打后移入无酶eppendorf管。确保细胞完全裂解，液体基本澄清。

②将上述eppendorf管室温静置5min，加入氯仿(200μl/1mltrizol)，上下颠倒混匀，室温静置10min，4℃，12000g，离心15min。

③小心吸取上层水相置于另一个新的无酶eppendorf管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min，4℃，12000g，离心10min，弃上清。

④用75％乙醇(1ml/1mltrizol)清洗沉淀，4℃，7500g，离心5min，弃上清，室温静置数分钟，使沉淀自然干燥。加入适量depc处理的ddw使其溶解，-80℃保存备用。

⑤紫外分光光度法测定rna的浓度和纯度；1％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性。

(2)反转录实验

①配制如下反应体系，70℃，5min，立即置于冰上。体系如下：

oligo-(dt)15primer(500μg/ml)1μl

totalrnasample1μg

sterilewater补足到10μl

②在反应体系中加入以下试剂，置于pcr仪中，42℃，1h。

(3)普通pcr反应

pcr扩增反应体系：

上游检测引物：5’-gatggctagtgtggctagtgtg-3’，下游检测引物：5’-gaggtactgggagccaatgt-3’。

扩增条件：预变性94℃，5min，变性94℃，30s，退火30s，延伸72℃，30s，35个循环，72℃延伸7min。根据预测的序列，通过primerpremier5.0设计检测引物，并由生工公司合成。用β-actin做为内参。pcr产物进行1.5％琼脂糖电泳，纯化pcr产物并进行测序验证。

8.体外实验检测llc^asv细胞的生物学活性

(1)llc^asv细胞的增殖能力

收集处于对数生长期的llcasv细胞和llc细胞，按4×10³个/孔接种至96孔板，每组设置3个复孔，37℃，5％co2培养24h，待细胞贴壁后，弃去培养基，每孔加入100μl新鲜配制的含10μlcck-8的培养液，继续培养2h后，酶标仪检测od450nm值。实验重复3次取平均值作为最终实验结果，并计算增殖率。

(2)llc^asv细胞的凋亡活性

收集处于对数生长期的llc^asv细胞和llc细胞，pbs洗涤细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml，将5μlannexin-v和10μlpi加入到100μl细胞悬液中，将混合物避光孵育15分钟。流式细胞仪检测annexin-v⁺pi-的凋亡细胞比例。实验重复3次取平均值作为最终实验结果。

(3)llc^asv细胞在小鼠体内成瘤能力

收集处于对数生长期的llcasv细胞和llc细胞，按5×10⁵细胞/100μl/只，皮下接种c57小鼠(雌性，6-8周龄，18-22g)，构建荷瘤鼠模型。每3天观察肿瘤生长情况，连续观察3-4周，比较llc^asv细胞和llc细胞接种小鼠的成瘤率和成瘤时间，成瘤后每天测量肿瘤长短径，按照肿瘤体积＝πab²/6计算肿瘤大小(a为长径，b位短径)，绘制小鼠肿瘤生长曲线。

9.e-asv-10多肽体外诱导小鼠特异性t淋巴细胞

(1)小鼠品系的筛选

小鼠egfr基因(np_997538.1)与人egfr基因(np_005219.2)同源性达90.35％，在egfr20外显子v769_d770insasv突变前后90aa范围内(l704-p794)碱基序列为100％同源，生物分析软件预测e-asv-10多肽可同小鼠h-2k^b和h-2k^d分子发生结合，提示e-asv-10可刺激c57bl/6小鼠(h-2k^b)和balb/c小鼠(h-2k^d)产生特异性杀伤t细胞，识别并杀伤携带相应egfr20外显子插入突变nsclc细胞llc^asv。

(2)dc细胞培养

①取c57bl/6和balb/c小鼠，脱颈处死，75％酒精浸泡消毒，转移至无菌超净台，无菌取股骨骨髓，pbs冲洗骨髓腔4-6遍，反复吹打细胞，过70μm滤网收集骨髓单细胞悬液，300g，6min，弃上清。

②用pbs将骨髓细胞重悬，用无血清培养基rpmi1640调整细胞浓度为1-3×10⁶/ml，放37℃5％co2孵箱中孵育2h。

③贴壁细胞弃上清，加入含il-41000u/ml、gm-csf1000u/ml的10％fbs完全培养基，于37℃5％co2孵箱中继续培养5天，每三天进行半量换液，补足il-4和gm-csf后连续培养6天，加入tnf-α(1000u/ml)诱导dc细胞成熟。

④收获成熟dcs，用无血清培养基1640以800rpm离心5min洗涤2遍，计数备用。

(2)t细胞扩增

①取c57bl/6和balb/c小鼠，脱颈处死，75％酒精浸泡消毒，转移至无菌超净台，取脾置于培养皿中，倒入生理盐水用10ml注射器活塞研磨，吸取研磨液，过70μm滤网，1300rpm，5min离心。

②弃上清，加入10ml红细胞裂解液，充分震荡，加20mlpbs终止反应，400g，5min离心，收集细胞，计数。

③调整t细胞浓度为2×10⁶/ml，并按10:1加入成熟dcs。同时加入il-21000u/ml，e-asv-10多肽50μg/ml，37℃5％co2培养。

④培养3天后补充适量dcs和il-2、多肽，进行第二轮共孵，结束后收集t细胞，计数。

(3)e-asv-10多肽诱导t细胞的特异性ifn-γ释放

步骤如上5.

(4)e-asv-10多肽诱导t细胞的特异性杀瘤活性

①将靶细胞llc^asv接种于6孔板，加入csfe(5μm)，室温避光共孵20min，用含2％fbs的培养基洗涤细胞，去除残留染料。

②收集e-asv-10多肽诱导t细胞，与llc^asv细胞按10:1、20:1共培养，每组设置三个复孔。共孵4h后将每孔上清转移至对应流式管中。加入胰酶消化孔板中细胞，待消化完全再放入与上清对应的同一个流式管中。

③1500rpm离心5分钟，弃上清，pbs洗涤细胞后加入100μlnir-zombie染液，室温避光孵育20min，pbs洗涤细胞后弃上清，1％多聚甲醛重悬细胞，待上机检测。

10.e-asv-10和e-asv-19多肽体内诱导小鼠特异性杀伤t细胞

(1)取e-asv-10和e-asv-19多肽混合后用dmso溶解后，并用无菌水配制成1mg/ml的溶液，分装成100ul/瓶，-80℃保存。

(2)选取c57bl/6小鼠(雌性，6-8周龄，18-22g)腹股沟注射e-asv-19和e-asv-10混合多肽溶液进行预免疫，每只小鼠100μl/次，每周2次，连续4周。预免疫小鼠脱颈处死，75％酒精浸泡消毒，转移至无菌超净台，取脾制备单细胞悬液，计数备用。

(3)将处于对数生长期的llc^asv细胞按2×10⁶细胞/100μl/只，皮下接种c57bl/6小鼠(雌性，6-8周龄，18-22g)构建荷瘤动物模型。治疗组在注射第三天，瘤周注射e-asv-10和e-asv-19多肽预免疫小鼠脾细胞悬液(1×10⁷/100μl/只)，对照组注射等量生理盐水。每3天观察肿瘤生长情况，连续观察3周，比较对照组和实验组小鼠的成瘤率和成瘤时间，成瘤后每天测量肿瘤长短径，计算肿瘤大小，绘制小鼠肿瘤生长曲线，并记录小鼠的体重变化。

三、实验结果

1.针对v769_d770insasv突变利用生物信息学算法iedb(netmhcpan4.0)预测可与hla-a^*02结合的多肽片段，结果显示v769_d770insasv的yvmasvasv与hla-a^*02:01、hla-a^*02:06均有较强的结合力(图1)。鉴于tna短肽对cd8⁺t细胞识别很重要，但在结合mhc-ii类和通过cd4⁺t细胞途径激发免疫应答方面不如长肽有效；而长肽在细胞内可被剪切成多种短肽，从而兼具短肽的抗原表位，所以分别选择e-asv-10和e-asv-19两种多肽疫苗进行实验。e-asv-10和e-asv-19多肽的高效液相色谱及质谱分析见图2和图3。

2.本发明采用流式细胞术检测e-asv-10和e-asv-19多肽与人dc细胞共孵后刺激人t淋巴细胞活化的情况。4-1bb是t细胞协同刺激分子，主要表达在活化的t细胞，其配体为4-1bbl，二者结合可刺激t细胞活化和增殖。cd25分子是il-2r的α链，对形成高亲和力受体有重要意义，主要分布于活化的t细胞表面。以单克隆抗体cd25和4-1bb标记t细胞以检测其活化程度。同时以cd3/4/8抗体标记不同t细胞亚群，检测e-asv-10和e-asv-19多肽诱导的t细胞特异性ifn-γ释放。流式细胞术分析结果显示经e-asv-10刺激后的te-asv-10细胞和e-asv-19刺激后的te-asv-19细胞比未接触抗原肽刺激的t细胞活化水平均增高(p<0.05)，即4-1bb⁺/cd25⁺细胞数量增加(图4a)，且cd4⁺和cd8⁺t细胞活化比例亦增多(图4b)，ifn-γ的分泌增加(p<0.05)，表明e-asv-10和e-asv-19均可在体外刺激t淋巴细胞的扩增和活化(图4a：t细胞中cd25和4-1bb表达；4b：cd4+t和cd8+t细胞中ifn-γ合成)。

3.本发明利用elispot法检测e-asv-10和e-asv-19多肽与人dc细胞共孵后刺激人t淋巴细胞分泌ifn-γ的情况。elispot是用抗ifn-γ的单克隆抗体包被在检测孔的底部，检测样本的淋巴细胞放入检测孔中，在培养期间，对tna有反应的t淋巴细胞就会被激活，开始分泌ifn-γ因子，这些细胞因子同时被板底的单克隆抗体捕获；对tna没有反应的细胞则不受刺激，也不分泌ifn-γ因子。移出细胞，板底留下细胞因子的潜在影像，这种潜在影像可以通过酶联显色的方式变成真正的斑点。每一个斑点代表了一个对tna有反应的特异性t淋巴细胞。elispot检测ifn-γ分泌的情况，结果显示，e-asv-10刺激后的te-asv-10细胞和e-asv-19刺激后的te-asv-19细胞均可特异性分泌ifn-γ(图5)。并且随着t细胞抗原负载次数的增加，t淋巴细胞分泌ifn-γ量也随之增加，即e-asv-10抗原负载3次的te-asv-10-3细胞比e-asv-10抗原负载2次的te-asv-10-2细胞分泌ifn-γ增多(p<0.05)，同样的e-asv-19刺激的te-asv-19-3比te-asv-19-2细胞分泌ifn-γ增多(p<0.05),表明e-asv-10和e-asv-19均可在体外诱导出识别相应egfr20外显子插入突变翻译出的tna抗原的特异性t淋巴细胞。

4.小鼠egfr基因(np_997538.1)和人egfr基因(np_005219.2)高度同源，在egfr20外显子v769_d770insasv突变前后90aa范围内(l704-p794)碱基序列为100％同源，生物分析软件预测e-asv-10多肽可同小鼠h-2k^b和h-2k^d分子发生结合，提示e-asv-10可刺激c57bl/6小鼠(h-2k^b)和balb/c小鼠(h-2k^d)产生特异性杀伤t细胞。为探讨e-asv-10多肽体外诱导小鼠特异性t细胞扩增的能力，本发明将小鼠骨髓来源dc细胞与e-asv-10共孵体外诱导小鼠t细胞扩增，并通过elispot法检测e-asv-10诱导小鼠t淋巴细胞的特异性活化。结果表明e-asv-10均可以刺激balb/c(图6a)和c57bl/6(图6b)小鼠t淋巴细胞的活化，并分泌ifn-γ(p<0.05)。

5.为研究e-asv-10多肽诱导的特异性t淋巴细胞对携带相应egfr20外显子插入突变的nsclc细胞的杀伤活性，本发明构建了表达egfrv769_d770insasv的慢病毒颗粒，经一代测序验证包含正确的目的基因序列(图7a)。将携带egfrv769_d770insasv的慢病毒颗粒转染llc细胞构建llc^asv细胞，经rt-pcr证实egfrv769_d770insasv仅在llc^asv细胞表达，而在llc细胞不表达(图7b)。进一步细胞功能实验表明llc^asv细胞与llc细胞的凋亡活性(图7c)和增殖能力(图7d)无明显差异。但在体内成瘤实验中，llc^asv细胞较llc细胞成瘤率下降，成瘤时间延长，肿瘤体积缩小(p<0.05)，提示llc^asv细胞较llc细胞诱导更强的抗肿瘤免疫反应(图7e)(图7a：目的片段测序；7b：egfrv769_d770insasv在不同细胞系中的表达；7c：llc^asv细胞凋亡；7d：llc^asv细胞增殖；7e：llc^asv细胞体内成瘤)。

6.本发明检测e-asv-10多肽预免疫小鼠的特异性t淋巴细胞体外对携带相应egfr20外显子插入突变的nsclc细胞llc^asv的杀伤活性。在c57bl/6小鼠(雌性，6-8周龄，18-22g)腹股沟部位皮下注射e-asv疫苗，2次/周，连续4周。制备脾脏单细胞悬液，体外与靶细胞llc^asv细胞共孵，比较不同效靶比(10:1，20:1)下对携带egfrv769_d770insasv突变llc^asv细胞的杀伤活性。结果显示e-asv-10多肽预免疫小鼠脾脏t淋巴细胞较e-asv-10体外诱导小鼠t淋巴细胞的杀伤力更强，且在不同效靶比都有显著差异(p<0.05)，表明e-asv-10多肽在体内可诱导特异性靶向携带相应egfr20外显子插入突变的nsclc细胞的杀伤性t细胞(图8)。

7.本发明分析e-asv-10多肽预免疫小鼠的特异性t淋巴细胞体内对携带相应egfr20外显子插入突变的nsclc细胞llc^asv的杀伤活性。将处于对数生长期的llc^asv细胞，皮下接种c57bl/6小鼠(雌性，6-8周龄，18-22g)腹股沟部位，构建荷瘤鼠模型。设置未处理组和治疗组。治疗组在注射第三天，瘤周注射e-asv-10多肽预免疫小鼠的脾细胞悬液(1×10⁷/只)，观察肿瘤生长情况，连续观察3周，计算成瘤率和绘制肿瘤生长曲线。比较未处理组和治疗组小鼠的成瘤率和肿瘤体积，发现预免疫小鼠脾细胞治疗组小鼠成瘤率较未处理组明显下降(图9a，p<0.05)，肿瘤体积也显著小于未处理组(图9b，p<0.05)，但治疗组小鼠与未处理小鼠的体重无显著差异(图9c，p>0.05)(图9a：小鼠llc^asv成瘤率；9b：小鼠llc^asv生长曲线；9c：小鼠体重变化)。

序列表

<110>天津医科大学肿瘤医院

<120>一种e-asv多肽及其在制备非小细胞肺癌新抗原疫苗中的用途

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

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<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

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