一种编码甲状旁腺素蛋白或其片段的核酸分子的制作方法

本申请涉及一种核酸分子，其包含编码甲状旁腺素(pth)蛋白或其片段的核苷酸序列和编码终止区。本申请还涉及包含所述核酸分子的载体和宿主细胞。本申请还涉及含有所述核酸分子的药物组合物，以及所述药物组合物的用途。
背景技术：
：骨质疏松症(osteoporosis，op)常见于老年人与绝经后的妇女。表现为骨质脆性增加，并容易发生骨折。原因是体内的骨量降低和骨组织微结构遭到破坏。骨质疏松症在各个年龄均可发病，可分为原发性、继发性和特发性骨质疏松症。目前，骨质疏松症的治疗药物主要从两方面入手，一种促进骨钙形成，另外一种抑制骨的吸收。促进骨钙形成的药物主要有钙制剂及维生素d类药物。而抑制骨吸收的药物主要有雌激素、孕激素、雌激素受体调节剂、降钙素、双磷酸盐和唾嗓类药物等。这些药物防治效果不尽理想，并且伴随副作用或不能长期使用。研究表明，甲状旁腺激素可以促进骨形成，明显减轻骨质疏松患者的患病情况，降低骨质疏松症患者的骨折发生率，使患者全身骨密度获得增加。甲状旁腺素(parathyroidhormone,pth)是由甲状旁腺主细胞分泌的含84个氨基酸残基的直链多肽。人甲状旁腺激素可调节钙、磷代谢及骨转换，降血压，调节维生素d受体表达，促进维生素代谢，调节碱性磷酸酯酶的活性。天然甲状旁腺素含84个氨基酸(在本文中也简称pth(1-84aa))。已报道，pth的n端片段(即，pth蛋白的第1-34个氨基酸，简称pth(1-34aa))也具有全长蛋白的生物学活性。当前，pth(1-34aa)和pth(1-84aa)均有上市品种。然而，由于pth不含半胱氨酸，pth(1-34aa)和pth(1-84aa)在体内很不稳定，且其分子量小，易被肾小球滤过，因而在体内的半衰期较短。为了达到治疗效果，一般需要频繁大剂量用药(通常每天皮下注射一次，连续几个月)，但如此频繁的用药方式再加上较长的治疗周期使得病人较难承受，并且在临床上会造成头疼、呕吐、发烧等不良反应，病人的顺应性差。因此，需要开发新的pth药剂。技术实现要素：为了解决上述问题，本申请的发明人经过大量实验，开发了一种编码甲状旁腺素蛋白或其片段的核酸分子，其能够显著提高甲状旁腺素(pth)蛋白或其片段在细胞内或体内的表达水平。由此，本申请提供了一种编码甲状旁腺素(pth)蛋白或其片段的核酸分子，还提供了包含该核酸分子的重组载体、宿主细胞及药物组合物，并由此提高了患者用药的顺从性，降低了治疗成本。因此，在本申请的第一方面，提供了一种核酸分子，其包含编码甲状旁腺素(pth)蛋白或其片段的核苷酸序列，以及，编码终止区；所述编码终止区的5’端连接于所述编码pth蛋白或其片段的核苷酸序列的3’端；其中，所述编码终止区包含或由至少两个终止密码子组成，并且所述编码终止区的前两个终止密码子为tgatag(seqidno:18)。在某些优选的实施方案中，所述编码终止区的5’端直接连接于所述编码pth蛋白或其片段的核苷酸序列的3’端。在某些优选的实施方案中，所述编码终止区的5’端通过核苷酸接头连接于所述编码pth蛋白或其片段的核苷酸序列的3’端，并且，所述核苷酸接头不改变所述编码终止区的开放阅读框。如本领域技术人员所通常理解的，在蛋白质的翻译过程中，从起始密码子开始，核酸链上每三个连续核苷酸即构成一个密码子，并且对应于一种氨基酸或终止密码子。因此，在本申请中，表述“所述核苷酸接头不改变所述编码终止区的开放阅读框”是指，所述核苷酸接头的长度是3n个核苷酸，n为大于或等于0的整数，由此，所述编码终止区的阅读框不会发生改变，其与编码pth蛋白或其片段的核苷酸序列仍然是符合读框的。在某些优选的实施方案中，所述核苷酸接头的长度是3n个核苷酸，n为整数且0≤n≤9；例如，n为0，1，2，3，4，5，6，7，8，或9。在某些优选的实施方案中，所述甲状旁腺素蛋白为人甲状旁腺素蛋白。在某些优选的实施方案中，所述pth蛋白的片段包含或由pth蛋白的第1-34位氨基酸残基组成。在某些优选的实施方案中，所述pth蛋白的片段包含或由pth蛋白的第1-35位、第1-40位、第1-45位、第1-50位、第1-55位、第1-60位、第1-65位、第1-70位、第1-75位、第1-80位、或第1-84位氨基酸残基组成。在某些优选的实施方案中，所述pth蛋白的氨基酸序列如seqidno：1所示。在某些优选的实施方案中，所述pth蛋白的片段的氨基酸序列如seqidno：2所示。在某些优选的实施方案中，所述编码pth蛋白或其片段的核苷酸序列根据宿主细胞(例如大肠杆菌或人细胞)的密码子偏好性进行了密码子优化或未进行优化。在某些优选的实施方案中，所述编码pth蛋白或其片段的核苷酸序列根据人细胞(例如hek-293t细胞)的密码子偏好性进行了密码子优化。在某些优选的实施方案中，所述编码pth蛋白的核苷酸序列如seqidno：5或6所示。在某些优选的实施方案中，所述编码pth蛋白的片段的核苷酸序列如seqidno：3或4所示。在某些实施方案中，所述核酸分子的编码终止区包含2个、3个、4个、5个或更多个终止密码子。如本申请已显示的，双终止密码子tgatag(seqidno:18)能够显著提高pth蛋白或其片段的表达水平。在此基础上，不拘于理论限制，可以容易地理解，在所述双终止密码子之后添加或连接一个或多个额外的终止密码子(例如，tga、tag、taa或其任何组合)，也不会不利地影响所述双终止密码子提高pth蛋白或其片段的表达水平的效果。因此，在某些实施方案中，所述核酸分子的编码终止区可以包含或者由2个、3个、4个、5个或更多个终止密码子组成，并且所述编码终止区的前两个终止密码子为双终止密码子tgatag(seqidno:18)。因此，在某些优选的实施方案中，所述编码终止区包含或者由下述序列组成：tgatagtga(seqidno:19)、tgatagtaa(seqidno:20)、tgatagtag(seqidno:21)或tgatagtgatag(seqidno:22)。在某些优选的实施方案中，本发明所述的核酸分子包含如seqidno：7-16所示的序列。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子还包含编码信号肽的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述编码信号肽的核苷酸序列位于所述编码pth蛋白或其片段的核苷酸序列的5’端。在某些优选的实施方案中，所述编码信号肽的核苷酸序列的3’端连接于所述编码pth蛋白或其片段的核苷酸序列的5’端。在某些优选的实施方案中，所述编码信号肽的核苷酸序列的3’端直接连接于所述编码pth蛋白或其片段的核苷酸序列的5’端。在某些优选的实施方案中，所述编码信号肽的核苷酸序列的3’端通过核苷酸接头连接于所述编码pth蛋白或其片段的核苷酸序列的5’端，并且，所述核苷酸接头不改变所述编码pth蛋白或其片段的核苷酸序列的开放阅读框。在本申请中，表述“所述核苷酸接头不改变所述编码pth蛋白或其片段的核苷酸序列的开放阅读框”是指，所述核苷酸接头的长度是3n个核苷酸，n为大于或等于0的整数，由此，所述编码pth蛋白或其片段的核苷酸序列的阅读框不会发生改变，其与编码信号肽的核苷酸序列仍然是符合阅读框的。在某些优选的实施方案中，所述核苷酸接头的长度是3n个核苷酸，n为整数且0≤n≤9；例如，n为0，1，2，3，4，5，6，7，8，或9。如本领域技术人员所通常理解的，信号肽用于使细胞表达的蛋白分泌至胞外，并且在分泌的过程中，信号肽通常会被切除。各种已知的信号肽可用于本发明，包括但不限于pth蛋白的天然信号肽，人生长激素信号肽，人肝细胞生长因子信号肽等。在某些优选的实施方案中，所述信号肽选自pth蛋白的天然信号肽，人生长激素信号肽，人肝细胞生长因子信号肽等。在某些优选的实施方案中，所述信号肽为pth蛋白的天然信号肽。在某些优选的实施方案中，所述信号肽具有如seqidno：24所示的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，所述编码信号肽的核苷酸序列具有如seqidno：23所示的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，本发明所述的核酸分子具有如seqidno：25-34所示的序列。在本申请的第二方面，提供了一种载体，其包含第一方面所述的核酸分子。在某些优选的实施方案中，所述载体选自质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体；以及，病毒载体，例如逆转录酶病毒载体(例如慢病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体(如单纯疱疹病毒载体)、痘病毒载体、杆状病毒载体、乳头瘤病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体。在某些优选的实施方案中，所述载体为质粒，例如裸质粒。在某些优选的实施方案中，所述载体用于表达(例如，在细胞中体外表达，或者在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达)所述核酸分子编码的蛋白。在某些优选的实施方案中，本发明的载体用于基因治疗。在某些优选的实施方案中，本发明的载体能够用作基因治疗载体，用于在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达所述pth蛋白或其片段并进行基因治疗。在某些优选的实施方案中，本发明的载体为包含所述核酸分子的质粒，例如裸质粒。在一些优选的实施方案中，本发明的载体可以是pcdna3.1(+)载体。pcdna3.1(+)是衍生自pcdna3的5.4kb的载体，用于在哺乳动物宿主中高水平稳定表达和瞬时表达目的蛋白，可通过市售购买获得。在另一些优选的实施方案中，本发明的载体是pck载体。pck载体公开于中国专利cn99815368.0中，序列如seqidno：17所示。该载体为高效真核表达载体，能够在人和动物细胞中驱动高水平基因表达。在本申请的第三方面，提供了一种宿主细胞，其包含第一方面所述的核酸分子或第二方面所述的载体。在某些实施方案中，所述宿主细胞选自原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌dh5α或jm109细胞。在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞是人细胞，例如hek-293t细胞。本发明的核酸分子、载体和宿主细胞能够以显著更高的水平表达pth蛋白或其片段，从而对于治疗可受益于pth蛋白或其片段的施用的疾病是特别有利的。因此，本发明的核酸分子、载体和宿主细胞可用于治疗可受益于pth蛋白或其片段的施用的疾病，例如骨质疏松症，甲状旁腺素功能低下，特发性甲状旁腺功能减退症，低镁血症性甲状旁腺功能减退症。因此，在本申请的第四方面，提供了一种药物组合物，其含有第一方面所述的核酸分子或第二方面所述的载体或第三方面所述的宿主细胞，以及任选地，药学上可接受的载体和/或赋形剂。本申请所述的药物组合物可通过本领域公知的方法进行施用，例如但不限于通过注射进行施用。在某些优选的实施方案中，本申请所述的药物组合物为注射液或冻干粉剂。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子或载体或宿主细胞以治疗有效量存在。在某些优选的实施方案中，本申请所述的药物组合物以单位剂量形式存在。在本申请的第五方面，提供了第一方面所述的核酸分子或第二方面所述的载体或第三方面所述的宿主细胞在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于治疗疾病，其中，所述疾病能够受益于pth蛋白或其片段的施用，例如骨质疏松症，甲状旁腺素功能低下，特发性甲状旁腺功能减退症，低镁血症性甲状旁腺功能减退症。在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物通过注射来进行施用。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物为注射液或冻干粉剂。在本申请的第六方面，提供了第一方面所述的核酸分子或第二方面所述的载体或第三方面所述的宿主细胞用于表达或产生pth蛋白或其片段的用途。在本申请的第七方面，提供了一种表达或产生pth蛋白或其片段的方法，所述方法包括，在允许蛋白质表达的条件下，培养第三方面的宿主细胞，以及任选地，回收或纯化所表达的pth蛋白或其片段。在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞为原核细胞，例如大肠杆菌。在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞为真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在本申请的第八方面，提供了一种治疗疾病的方法，其包括，给有此需要的受试者施用第一方面所述的核酸分子或第二方面所述的载体或第三方面所述的宿主细胞，其中，所述疾病能够受益于pth蛋白或其片段的施用，例如骨质疏松症，甲状旁腺素功能低下，特发性甲状旁腺功能减退症，低镁血症性甲状旁腺功能减退症。在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。在某些优选的实施方案中，通过注射来施用所述核酸分子或载体或宿主细胞。术语定义如本文中所使用的，术语“pth蛋白”或“甲状旁腺素蛋白”是指天然存在的、具有生物学活性的甲状旁腺素(parathyroidhormone,pth)蛋白，它们具有相同的含义，可互换使用。如本领域技术人员已知的，pth蛋白是甲状旁腺主细胞分泌的多肽类激素，其主要功能是调节脊椎动物体内钙和磷的代谢，促使血钙水平升高，血磷水平下降。在本申请中，当提及“pth蛋白”或“甲状旁腺素蛋白”时，除非特别指明或上下文明确指出，否则，其是指分泌形式的成熟蛋白，不含有信号肽。在本申请中，未分泌的含有信号肽的pth蛋白通常称为pth前体蛋白。可方便地从各种公共数据库(例如，genbank数据库)获得pth蛋白(例如人pth蛋白)的氨基酸序列。例如，天然人pth蛋白的氨基酸序列可见于genbank数据库登录号：aaa60215。如本文中所使用的，术语“pth蛋白的片段”是指pth蛋白中能够发挥或具有pth蛋白生物学活性的部分。如之前已经报道的，由pth蛋白的第1-34位氨基酸残基构成的片段本身即能够发挥和具有全长pth蛋白的生物学活性。因此，在本申请的某些优选实施方案中，pth蛋白的片段可以包含或由pth蛋白的第1-34位氨基酸残基组成。不拘于理论限制，pth蛋白的更长的片段也能够发挥或具有与上述片段(pth蛋白的第1-34位氨基酸残基)相同或类似的功能。因此，在本申请的某些优选实施方案中，pth蛋白的片段可以包含或由pth蛋白的第1-35位、第1-40位、第1-45位、第1-50位、第1-55位、第1-60位、第1-65位、第1-70位、第1-75位、第1-80位、或第1-84位氨基酸残基组成。在本申请中，pth蛋白的示例性氨基酸序列提供于seqidno：1中。因此，在本发明中，当涉及pth蛋白的序列时，其使用seqidno：1所示的序列来进行描述。例如，表述“pth蛋白的第1-34位氨基酸残基”中的第1-34位氨基酸残基是指，seqidno：1的第1-34位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，可在seqidno：1中天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加)，而不影响pth蛋白的生物学活性。因此，在本发明中，术语“pth蛋白”意欲包括所有此类多肽和变体，包括seqidno：1所示的多肽以及其天然或人工的变体，所述变体保留了pth蛋白的生物学活性。并且，当描述pth蛋白的序列片段时，其不仅包括seqidno：1所示的多肽的序列片段，还包括该多肽的天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“pth蛋白的第1-34位氨基酸残基”意欲包括，seqidno：1的第1-34位氨基酸残基，以及seqidno：1所示的多肽的变体(天然或人工)中的相应片段。如本文中所使用的，术语“信号肽”是指，引导细胞表达或合成的蛋白质向分泌通路转移，并分泌至细胞外的一段肽链，其长度通常为5-35个氨基酸。在一般情况下，在蛋白质的分泌过程中，信号肽将会被切除。因此，在已被分泌到细胞外的成熟蛋白质中，通常不再含有所述信号肽。如本文中所使用的，术语“pth蛋白的天然信号肽”是指，天然pth前体蛋白中所含有的信号肽；也即，生物体中天然存在的、引导pth蛋白从甲状旁腺主细胞分泌的信号肽。可方便地从各种公共数据库(例如，genbank数据库)获得pth蛋白的天然信号肽的氨基酸序列。例如，pth蛋白的天然信号肽可具有如seqidno：24所示的氨基酸序列。然而，可以理解的是，本申请所用的信号肽并不局限于pth蛋白的天然信号肽(例如，如seqidno：24所示的信号肽)，其可以是任何已知的信号肽，例如人生长激素信号肽，人肝细胞生长因子信号肽等。如本文中所使用的，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。根据本发明，当在蛋白/多肽的背景中使用时，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与参照蛋白/多肽(例如，本发明的pth蛋白)的氨基酸序列相比，具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个)氨基酸差异(例如，保守氨基酸置换)，或者具有至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，并且其保留了参照蛋白/多肽的生物学活性。如之前所报道的，pth蛋白的生物学活性包括，增加肾脏对ca2+的重吸收，促进血钙升高。因此，pth蛋白可在多个方面具有应用前景，包括但不限于：(1)促进骨骼成骨；(2)增加肾脏对ca2+的重吸收，促进血钙升高，血磷降低；(3)治疗骨质疏松症；(4)治疗甲状旁腺素功能低下；(5)治疗特发性甲状旁腺功能减退症；(6)治疗低镁血症性甲状旁腺功能减退症。在本申请中，pth蛋白的生物学活性如上所述。如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学活性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。如本领域技术人员所知晓的，密码子存在简并性。即，在蛋白质的翻译过程中，每个氨基酸可对应1种或多种密码子，例如可对应多达6种密码子。不同的物种在使用编码某一氨基酸的简并密码子时存在着很大的差异，有着不同的偏好。这种偏好现象即被称为“密码子偏好性”。因此，如本文中所使用的，术语“密码子偏好性”是指某一物种偏爱使用某些特定的密码子来编码氨基酸的情况。根据密码子偏好性来优化核酸分子的序列在某些情况下是特别有利的，例如，可能有助于提高核酸分子所编码的蛋白质的表达水平。例如，当使用大肠杆菌(或人细胞)来表达pth蛋白或其片段时，针对大肠杆菌(或人细胞)的密码子偏好性来优化编码pth蛋白或其片段的核酸序列将是潜在有利的。如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒(例如裸质粒)；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及病毒载体等。可用作载体的病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于扩增或表达外源基因(例如pth基因)的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293细胞，293t细胞或人细胞等的动物细胞。如本文中所使用的，术语“药学上可接受的”意指，制药领域公认的可用于动物，特别是可用于人的。如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：ph调节剂(包括但不限于磷酸盐缓冲液)，表面活性剂(包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80)，佐剂，离子强度增强剂(包括但不限于氯化钠)，稀释剂，赋形剂，用于容纳或施用治疗剂的介质，以及其任何组合。如本文中所使用的，药学上可接受的载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括源自石油、动物、植物的或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当静脉内施用药用组合物时，生理盐水是优选的载体。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液态载体，特别是用于可注射溶液。如本文中所使用的，药学上可接受的赋形剂可包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。如果需要，药物组合物还可以包含润湿剂，或乳化剂例如透明质酸钠，或ph缓冲剂。药物组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释配方等形式。如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于，人，啮齿类动物(小鼠，大鼠，豚鼠)，狗，马，牛，猫，猪，猴，黑猩猩等。优选地，受试者是人。如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。发明的有益效果与现有技术相比，本发明提供了一种编码pth蛋白或其片段的核酸分子，其能够在细胞内以显著更高的水平高效表达甲状旁腺素。这对于能够受益于pth蛋白或其片段的施用的疾病(例如骨质疏松症，甲状旁腺素功能低下，特发性甲状旁腺功能减退症，低镁血症性甲状旁腺功能减退症)的治疗是特别有利的，例如，其能够提高患者用药的顺从性，降低治疗成本。附图说明图1显示了使用琼脂糖凝胶电泳检测pck-pth(1-34)和pck-pth(1-84)重组载体的结果，其中，marker表示分子量标记，泳道1为pck-pth(1-84)重组载体，泳道2为pck-pth(1-34)重组载体。图2显示了使用hplc分析pck-pth(1-34)重组载体原液的结果。图3显示了使用hplc分析pck-pth(1-84)重组载体原液的结果。序列信息本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中，而其他序列的信息则提供于实施例中。表1：序列信息下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不是对本申请的范围的限定。根据优选实施方案的下列详细描述，本申请的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。具体实施方式现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照j.sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及f.m.ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，johnwiley&sons，inc.，1995中所述的方法进行。实施例中未注明来源的试剂均是本领域的常规试剂或市售可得的试剂。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。实施例1：重组载体的构建(1)目的基因的合成以编码天然人pth蛋白的核苷酸序列为模板，合成如seqidno：25或seqidno：27所示的核苷酸序列，其中，序列seqidno：25从5’至3’包含：编码信号肽的核苷酸序列(seqidno:23)，编码pth(1-34aa)的核苷酸序列(seqidno:3)及终止密码子tgatag(seqidno:18)；序列seqidno：27从5’至3’包含：编码信号肽的核苷酸序列(seqidno:23)，编码pth(1-84aa)的核苷酸序列(seqidno:5)及终止密码子tgatag(seqidno:18)。(2)重组载体的构建将上述合成的序列seqidno：25和seqidno：27分别克隆入pck载体，即得到pck-pth(1-34)和pck-pth(1-84)重组载体。pck载体序列如seqidno：17所示(参见中国专利cn99815368.0)。该载体为高效真核表达载体，其能够在人和动物细胞中驱动高水平基因表达。(3)工程菌的制备将pck-pth(1-34)和pck-pth(1-84)重组载体分别转化到大肠杆菌jm109中。经扩增培养后，从大肠杆菌中提取重组载体，并进行测序验证。将经测序验证的重组载体转化到dh5α大肠杆菌中，即获得工程菌。实施例2：工程菌的发酵(1)菌种活化从工作种子库中取出工程菌，用接种环从冻存管中蘸取菌液，在含硫酸卡那霉素溶液的lb固体平板上进行划线，37℃培养过夜。(2)菌液制备与发酵从平板中挑取菌落，将菌落转接到含硫酸卡那霉素溶液的lb培养基中，置于摇床中，37℃培养约4-8h，所得液体培养物即为一级种子液。将一级种子液转接至含硫酸卡那霉素溶液的lb培养基中，置于摇床，37℃培养约15-20h，所得液体培养物即为二级种子液。将二级种子液，接种至30l发酵罐中，当菌体浓度od600达到5-8时，将30l发酵罐中的发酵液移入100l发酵罐中，进行发酵。待碳源与氮源耗尽，结束发酵。(3)菌体收集收集发酵液，采用连续流离心机，以9500rpm离心收集沉淀物(即为菌体)。将收集的菌体分装，于-20℃冰箱保存。实施例3：重组载体的纯化(1)前处理与浓缩：称取冻存菌体1200g，经碱裂解和中和后，过滤，收集上清液，并浓缩至1-2l，6000rpm离心20min，收集离心后的上清液。(2)层析：采用分子筛层析、亲和层析、离子交换层析，进一步分离pck-pth(1-34)和pck-pth(1-84)重组载体，并经超滤换液，分别将pck-pth(1-34)和pck-pth(1-84)重组载体保存在稳定的制剂溶液中。实施例4：重组载体的检定(1)分子量采用琼脂糖凝胶电泳法来测定所制备的重组载体的分子量。简言之，分别取20μlpck-pth(1-34)和pck-pth(1-84)重组载体，用nhei进行单酶切，与6×上样缓冲液混合，在1％琼脂糖凝胶上点样，在72v恒压电泳，约40-60min。琼脂糖凝胶电泳的检测结果如图1所示。结果显示，pck-pth(1-34)和pck-pth(1-84)重组载体的分子量分别为约3.9kb(泳道2)和4.0kb(泳道1)。(2)纯度采用高效液相法(hplc)来测定所制备的重组载体的纯度。简言之，使用安捷伦1260型高效液相仪器来进行检测，色谱柱为tosohtskgeldna-npr。检测方案如下：用50％b液平衡，待基线平衡后，上样100μl，流速为0.5ml/min，连续梯度洗脱，检测波长为260nm。检测结果如图2和图3所示。结果显示，重组载体pck-pth(1-34)和pck-pth(1-84)的hplc纯度均大于95％。(3)蛋白表达量和camp活性测定取pck-pth(1-34)和pck-pth(1-84)重组载体，转染入hek-293t细胞，在37℃、5％co2的条件下培养48-72h。培养后，收集培养物的上清，然后根据abcam的说明书，使用pth检测试剂盒，检测pth蛋白的表达量。易于理解，上清中的pth蛋白是分泌形式的成熟蛋白，不含有信号肽。检测结果显示，pck-pth(1-34)和pck-pth(1-84)重组载体的蛋白表达量分别为4.811ng/ml和5.264ng/ml。取上述上清液中的pth(1-34aa)或pth(1-84aa)蛋白，稀释至0.1ng/ml，加入到umr-106细胞中，并在37℃、5％co2的条件下培养30-60min。随后，抽提camp，根据r&d制造商的说明书，使用camp检测试剂盒，检测camp活性。检测结果显示，所表达的pth(1-34aa)或pth(1-84aa)蛋白的camp活性分别为13354iu/mg和12772iu/mg。实施例5：终止密码子对蛋白表达量的影响(1)含有不同终止密码子的重组载体的构建以编码天然人pth蛋白的核苷酸序列为模板，分别合成5’端连接有信号肽编码序列的编码pth(1-34aa)的核苷酸序列(简称为pth(1-34)；seqidno:23+seqidno:3)和5’端连接有信号肽编码序列的编码pth(1-84aa)的核苷酸序列(简称为pth(1-84)；seqidno:23+seqidno:5)，并分别与不同的终止密码子连接，合成后的序列见表2和表3。表2.pth(1-34)与不同终止密码子连接的核苷酸序列表3.pth(1-84)与不同终止密码子连接的核苷酸序列将上述序列分别克隆入pck质粒载体，并分别转化到大肠杆菌jm109中。经扩增培养后，分别提取52种重组载体，用于蛋白表达量的测定。(2)表达水平和camp活性的测定取上述重组载体，分别转染hek-293t细胞，在37℃、5％co2的条件下培养48-72h。培养后，收集培养物的上清，并测定pth蛋白或其片段的表达量。实验结果如表4和表5所示。结果显示，当pth(1-34)或pth(1-84)与tga-tag双终止密码子连接时，pth蛋白或其片段的表达量明显高于其它终止密码子的组合。并且，在双终止密码子tga-tag之后添加额外的终止密码子，不影响该双终止密码子tga-tag的效果；由此产生的重组载体的目的蛋白表达量与包含双终止密码子tga-tag的重组载体基本一致或甚至更高，并且明显高于含有其它终止密码子组合的重组载体。表4.pth(1-34aa)蛋白的表达量的测定结果表5.pth(1-84aa)蛋白的表达量的测定结果camp活性测定：如实施例4所述，将上述52个上清液中的pth(1-34aa)或pth(1-84aa)蛋白，稀释至0.1ng/ml，加入到umr-106细胞中，并在37℃、5％co2的条件下培养30-60min。随后，抽提camp，根据r&d制造商的说明书，使用camp检测试剂盒，检测camp活性。结果显示，各个重组载体所表达的pth(1-34aa)或pth(1-84aa)蛋白的camp活性基本一致。实施例6：密码子优化对蛋白表达量的影响(1)重组载体的构建根据人的密码子偏好性(如表6所示)，对编码人天然pth(1-34aa)或pth(1-84aa)的核苷酸序列进行优化，从而获得密码子经优化的核苷酸序列，即seqidno：4和seqidno：6。然后，合成如seqidno：26或seqidno：28所示的核苷酸序列，其中，序列seqidno：26从5’至3’包含：编码信号肽的核苷酸序列(seqidno:23)，密码子经优化的编码pth(1-34aa)的核苷酸序列(seqidno:4)及终止密码子tgatag(seqidno:18)；序列seqidno：28从5’至3’包含：编码信号肽的核苷酸序列(seqidno:23)，密码子经优化的编码pth(1-84aa)的核苷酸序列(seqidno:6)及终止密码子tgatag(seqidno:18)。表6.人类密码子偏好性序号氨基酸碱基序号氨基酸碱基1alagcc11leuctc2argaga12lysaag3asnaac13metatg4aspgac14phettc5cysugc15proccc6glncag16sertcc7glugag17thraca8glyggc18trptgg9hiscac19tyrtac10ileatc20valgtg将seqidno：25-28分别克隆入pck质粒载体，并分别转化到大肠杆菌jm109中，经扩增培养，得到4种重组载体：(1)含有seqidno：26的重组载体，简称pck-pth(1-34)-o；(2)含有seqidno：28的重组载体，简称pck-pth(1-84)-o；(3)含有seqidno：25的重组载体，简称pck-pth(1-34)；含有seqidno：27的重组载体，简称pck-pth(1-84)。分别提取上述4种重组载体，用于测定目的蛋白表达量。(2)目的蛋白表达量和camp活性的测定取上述4种重组载体，分别转染hek-293t细胞，在37℃、5％co2的条件下培养48-72h。培养后，收集培养物的上清，并测定pth蛋白或其片段的表达量。实验结果表明，pck-pth(1-34)-o、pck-pth(1-84)-o、pck-pth(1-34)和pck-pth(1-84)这4种重组载体的目的蛋白表达量分别为5.135、5.204、5.338和5.269ng/ml。这表明，密码子的优化不影响双终止密码子tgatag的效果，且所有重组载体均以高水平表达目的蛋白。camp活性测定：如实施例4所述，取上述4个上清液中的pth(1-34aa)或pth(1-84aa)蛋白，稀释至0.1ng/ml，加入到umr-106细胞中，并在37℃、5％co2的条件下培养30-60min。随后，抽提camp，根据r&d制造商的说明书，使用camp检测试剂盒，检测camp活性。结果显示，pck-pth(1-34)-o、pck-pth(1-84)-o、pck-pth(1-34)和pck-pth(1-84)所表达的pth(1-34aa)或pth(1-84aa)蛋白的camp活性基本一致，分别为12532、13257、12452、12785iu/mg。实施例7：不同表达载体对蛋白表达量的影响(1)重组载体的构建将seqidno：25和seqidno：27分别克隆入pck载体和pcdna3.1(+)载体(购自invitrogen，货号v79020)得到4种重组载体：pck-pth(1-34)、pck-pth(1-84)、pcdna3.1-pth(1-34)和pcdna3.1-pth(1-84)。将上述重组载体分别转化到大肠杆菌jm109中，经扩增培养，分别提取4种重组载体，用于测定目的蛋白的表达量。(2)目的蛋白表达量和camp活性的测定取上述4种重组载体，分别转染hek-293t细胞，在37℃、5％co2的条件下培养48-72h。培养后，收集培养物的上清，并测定目的蛋白表达量。实验结果表明，pck-pth(1-34)、pck-pth(1-84)、pcdna3.1-pth(1-34)和pcdna3.1-pth(1-84)这4种重组载体的目的蛋白表达量分别为4.866、4.942、4.747和4.839ng/ml。这表明，本发明的核酸分子可以适用于各种表达载体，且均能够以高水平表达目的蛋白。camp活性测定：如实施例4所述，取上述4个上清液中的pth(1-34aa)或pth(1-84aa)蛋白，稀释至0.1ng/ml，加入到umr-106细胞中，并在37℃、5％co2的条件下培养30-60min。随后，抽提camp，根据r&d制造商的说明书，使用camp检测试剂盒，检测camp活性。结果显示，pck-pth(1-34)、pck-pth(1-84)、pcdna3.1-pth(1-34)和pcdna3.1-pth(1-84)各个重组载体所表达的pth(1-34aa)或pth(1-84aa)蛋白的camp活性基本一致，分别为12965、12635、11545、12157iu/mg。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。序列表<110>北京诺思兰德生物技术股份有限公司<120>一种编码甲状旁腺素蛋白或其片段的核酸分子<130>idc190452<160>34<170>patentinversion3.5<210>1<211>84<212>prt<213>homosapiens<400>1servalsergluileglnleumethisasnleuglylyshisleuasn151015sermetgluargvalglutrpleuarglyslysleuglnaspvalhis202530asnphevalalaleuglyalaproleualaproargaspalaglyser354045glnargproarglyslysgluaspasnvalleuvalgluserhisglu505560lysserleuglyglualaasplysalaaspvalasnvalleuthrlys65707580alalyssergln<210>2<211>34<212>prt<213>homosapiens<400>2servalsergluileglnleumethisasnleuglylyshisleuasn151015sermetgluargvalglutrpleuarglyslysleuglnaspvalhis202530asnphe<210>3<211>102<212>dna<213>homosapiens<400>3tctgtgagtgaaatacagcttatgcataacctgggaaaacatctgaactcgatggagaga60gtagaatggctgcgtaagaagctgcaggatgtgcacaatttt102<210>4<211>102<212>dna<213>artificial<220><223>经密码子优化的编码pth（1-34aa）的核苷酸序列<400>4tccgtgtccgagatccagctcatgcacaacctcggcaagcacctcaactccatggagaga60gtggagtggctcagaaagaagctccaggacgtgcacaacttc102<210>5<211>252<212>dna<213>homosapiens<400>5tctgtgagtgaaatacagcttatgcataacctgggaaaacatctgaactcgatggagaga60gtagaatggctgcgtaagaagctgcaggatgtgcacaattttgttgcccttggagctcct120ctagctcccagagatgctggttcccagaggccccgaaaaaaggaagacaatgtcttggtt180gagagccatgaaaaaagtcttggagaggcagacaaagctgatgtgaatgtattaactaaa240gctaaatcccag252<210>6<211>252<212>dna<213>artificial<220><223>经密码子优化的编码pth（1-84aa）的核苷酸序列<400>6tccgtgtccgagatccagctcatgcacaacctcggcaagcacctcaactccatggagaga60gtggagtggctcagaaagaagctccaggacgtgcacaacttcgtggccctcggcgccccc120ctcgcccccagagacgccggctcccagagacccagaaagaaggaggacaacgtgctcgtg180gagtcccacgagaagtccctcggcgaggccgacaaggccgacgtgaacgtgctcacaaag240gccaagtcccag252<210>7<211>108<212>dna<213>artificial<220><223>seqidno:3+seqidno:18<400>7tctgtgagtgaaatacagcttatgcataacctgggaaaacatctgaactcgatggagaga60gtagaatggctgcgtaagaagctgcaggatgtgcacaatttttgatag108<210>8<211>108<212>dna<213>artificial<220><223>seqidno:4+seqidno:18<400>8tccgtgtccgagatccagctcatgcacaacctcggcaagcacctcaactccatggagaga60gtggagtggctcagaaagaagctccaggacgtgcacaacttctgatag108<210>9<211>258<212>dna<213>artificial<220><223>seqidno:5+seqidno:18<400>9tctgtgagtgaaatacagcttatgcataacctgggaaaacatctgaactcgatggagaga60gtagaatggctgcgtaagaagctgcaggatgtgcacaattttgttgcccttggagctcct120ctagctcccagagatgctggttcccagaggccccgaaaaaaggaagacaatgtcttggtt180gagagccatgaaaaaagtcttggagaggcagacaaagctgatgtgaatgtattaactaaa240gctaaatcccagtgatag258<210>10<211>258<212>dna<213>artificial<220><223>seqidno:6+seqidno:18<400>10tccgtgtccgagatccagctcatgcacaacctcggcaagcacctcaactccatggagaga60gtggagtggctcagaaagaagctccaggacgtgcacaacttcgtggccctcggcgccccc120ctcgcccccagagacgccggctcccagagacccagaaagaaggaggacaacgtgctcgtg180gagtcccacgagaagtccctcggcgaggccgacaaggccgacgtgaacgtgctcacaaag240gccaagtcccagtgatag258<210>11<211>111<212>dna<213>artificial<220><223>seqidno:3+seqidno:19<400>11tctgtgagtgaaatacagcttatgcataacctgggaaaacatctgaactcgatggagaga60gtagaatggctgcgtaagaagctgcaggatgtgcacaatttttgatagtga111<210>12<211>261<212>dna<213>artificial<220><223>seqidno:5+seqidno:19<400>12tctgtgagtgaaatacagcttatgcataacctgggaaaacatctgaactcgatggagaga60gtagaatggctgcgtaagaagctgcaggatgtgcacaattttgttgcccttggagctcct120ctagctcccagagatgctggttcccagaggccccgaaaaaaggaagacaatgtcttggtt180gagagccatgaaaaaagtcttggagaggcagacaaagctgatgtgaatgtattaactaaa240gctaaatcccagtgatagtga261<210>13<211>111<212>dna<213>artificial<220><223>seqidno:3+seqidno:20<400>13tctgtgagtgaaatacagcttatgcataacctgggaaaacatctgaactcgatggagaga60gtagaatggctgcgtaagaagctgcaggatgtgcacaatttttgatagtaa111<210>14<211>111<212>dna<213>artificial<220><223>seqidno:3+seqidno:21<400>14tctgtgagtgaaatacagcttatgcataacctgggaaaacatctgaactcgatggagaga60gtagaatggctgcgtaagaagctgcaggatgtgcacaatttttgatagtag111<210>15<211>114<212>dna<213>artificial<220><223>seqidno:3+seqidno:22<400>15tctgtgagtgaaatacagcttatgcataacctgggaaaacatctgaactcgatggagaga60gtagaatggctgcgtaagaagctgcaggatgtgcacaatttttgatagtgatag114<210>16<211>264<212>dna<213>artificial<220><223>seqidno:5+seqidno:22<400>16tctgtgagtgaaatacagcttatgcataacctgggaaaacatctgaactcgatggagaga60gtagaatggctgcgtaagaagctgcaggatgtgcacaattttgttgcccttggagctcct120ctagctcccagagatgctggttcccagaggccccgaaaaaaggaagacaatgtcttggtt180gagagccatgaaaaaagtcttggagaggcagacaaagctgatgtgaatgtattaactaaa240gctaaatcccagtgatagtgatag264<210>17<211>3696<212>dna<213>artificial<220><223>pck载体的核苷酸序列<400>17cactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctg60cgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccg120gatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagatacca180aatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccg240cctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcg300tgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctga360acggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatac420ctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtat480ccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcc540tggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtga600tgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttc660ctggccttttgctggccttttgctcacatgcgcgttgacattgattattgactagttatt720aatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacat780aacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaa840taatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtgg900agtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgc960cccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacct1020tacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtga1080tgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaa1140gtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttc1200caaaatgtcgtaataaccccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtggg1260aggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccac1320gctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggt1380gcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagactctata1440ggcacacccctttggctcttatgcatgctatactgtttttggcttggggcctatacaccc1500ccgcttccttatgctataggtgatggtatagcttagcctataggtgtgggttattgacca1560ttattgaccactcccctattggtgacgatactttccattactaatccataacatggctct1620ttgccacaactatctctattggctatatgccaatactctgtccttcagagactgacacgg1680actctgtatttttacaggatggggtcccatttattatttacaaattcacatatacaacaa1740cgccgtcccccgtgcccgcagtttttattaaacatagcgtgggatctccacgcgaatctc1800gggtacgtgttccggacatgggctcttctccggtagcggcggagcttccacatccgagcc1860ctggtcccatgcctccagcggctcatggtcgctcggcagctccttgctcctaacagtgga1920ggccagacttaggcacagcacaatgcccaccaccaccagtgtgccgcacaaggccgtggc1980ggtagggtatgtgtctgaaaatgagctcggagattgggctcgcaccgctgacgcagatgg2040aagacttaaggcagcggcagaagaagatgcaggcagctgagttgttgtattctgataaga2100gtcagaggtaactcccgttgcggtgctgttaacggtggagggcagtgtagtctgagcagt2160actcgttgctgccgcgcgcgccaccagacataatagctgacagactaacagactgttcct2220ttccatgggtcttttctgcagtcaccgtccttgacacgaagcttgctagcgcggccgctc2280tagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatc2340tgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcct2400ttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggg2460gggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctgg2520ggagtcgaaattcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcg2580ggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttca2640gcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggcca2700cagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcg2760ccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgctcgccttgagcctggcgaacagt2820tcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggct2880tccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggta2940gccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggca3000ggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcc3060cttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagc3120cacgatagccgcgctgcctcgtcttgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttg3180acaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccg3240attgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacct3300gcgtgcaatccatcttgttcaatcatgcgaaacgatcctcatcctgtctcttgatcagat3360cttgatcccctgcgccatcagatccttggcggcaagaaagccatccagtttactttgcag3420ggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccggttcgcttgctgtccat3480aaaaccgcccagtctagctatcgccatgtaagcccactgcaagctacctgctttctcttt3540gcgcttgcgttttcccttgtccagatagcccagtagctgacattcatccggggtcagcac3600cgtttctgcggactggctttctacgtgaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataat3660ctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttc3696<210>18<211>6<212>dna<213>artificial<220><223>双终止密码子<400>18tgatag6<210>19<211>9<212>dna<213>artificial<220><223>三终止密码子1<400>19tgatagtga9<210>20<211>9<212>dna<213>artificial<220><223>三终止密码子2<400>20tgatagtaa9<210>21<211>9<212>dna<213>artificial<220><223>三终止密码子3<400>21tgatagtag9<210>22<211>12<212>dna<213>artificial<220><223>四终止密码子<400>22tgatagtgatag12<210>23<211>93<212>dna<213>homosapiens<400>23atgatacctgcaaaagacatggctaaagttatgattgtcatgttggcaatttgttttctt60acaaaatcggatgggaaatctgttaagaagaga93<210>24<211>24<212>prt<213>homosapiens<400>24makdmakvmvmactksdgksvkkr24<210>25<211>201<212>dna<213>artificial<220><223>seqidno:23+seqidno:7<400>25atgatacctgcaaaagacatggctaaagttatgattgtcatgttggcaatttgttttctt60acaaaatcggatggga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