专利名称：基因工程生产用原核表达质粒载体——pKpL5及其构建方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体地讲是一种基因工程生产用原核表达质粒载体——pKpL5及其构建方法。
背景技术：
众所周知，近年来兴起的基因工程方法可以生产天然方法难以大量制备的目的蛋白质，广泛地用于人类医疗等方面，由于质粒载体对目的基因进行表达时受多种因素影响而呈现表达效率高低不一，下游纯化难易程度不一样，因而国内外学者纷纷通过强启动子、强转录终止子、强翻译终止密码、合理的SD区及引导序列等元件改进来提高表达目的蛋白效率，或者使用原核生物细胞偏好密码子重新改造目的基因，或改造终止密码下游序列，增强mRNA的稳定性来提高目的蛋白表达效率，上述工作虽都取得一定效果，但仍不尽如人意。同时，现有的目的蛋白纯化、收集程序繁锁复杂，得率较低，运行成本偏高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足，通过在原有基因工程生产用原核细胞表达质粒的起始密码下游选择性嵌入3个接头，改变其结构，而提供一新的高效原核表达质粒载体——pKpL5，该质粒载体能大大提高目的基因的表达效率，从而提高目的蛋白的产量，同时本发明还能简化重组蛋白的纯化程序，降低生产成本，且重组蛋白很容易还原成天然蛋白。本发明的目的通过下述技术方案来实现在含有双启动子、双SD区、rrnb转录终止子的pKpL4原核质粒载体的起始码下游嵌入人工合成的六聚组氨酸编码区、16s rRNA 3’端互补区、凝血酶识别位点编码区接头，三个接头的5’端分别含限制性核酸内切酶Nco I、Bam HI、Bam HI残存碱基。
所说的六组氨酸编码区接头接正链序列为CATGGGCCATCATCATCACCATCACAGCAGCGGATCCG，负链为CGGATCCGCTGCTGTGATGGTGATGATGGCC，六组氨酸接头N端和C端分别含有甘氨酸，六组氨酸编码区下游含Bam HI识别位点。
16s rRNA3’端匹配序列接头正链序列为GATCGCATGCCTTACAAAGCGGATCCTCTAGAG，负链序列为CGGATCCGCTGCTTTGTAAGGCATGC，其中CATGCCTTACAAAG为16s rRNA3’端互补区，3’端含有Bam HI和Xba I识别位点。
所说的凝血酶识别位点编码区序列接头正链序列为CATCGAGCGGACTGGTTCCGCGTGGATCCG，负链序列为CGGATCCACGCGGAACCAGTCCGCTC，其中GTTCCGCGTGGA编码的Val-Pro-Arg-Gly为凝血酶识别位点，序列的3’端含有Bam HI识别点。
原核表达质粒载体pKpL5的构建方法如下(1)分别将六组氨酸接头的正、负链，16s rRNA3’端匹配接头正、负链和凝血酶识别位点编码区序列接头正负链各自混合后在100℃变性与复性后，组装成构成三个接头，3个接头的5’端分别含Nco I、BamHI、Bam HI残存碱基备用；(2)制备pKpL4.1取pKpL4质粒DNA，经Bam HI消化后，以Klenow酶和dNTP修饰成平端，再以Nco I消化，1.0％琼脂糖凝胶电泳后回收载体臂DNA，再用CIP脱磷酸化后，加入的六聚组氨酸接头，用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化经CaCL2法制备的感受态大肠杆菌pop2136细胞，以六聚组氨酸接头正链和rrnb转录终止子负链为引物，PCR法筛选重组阳性克隆，阳性重组子即为pKpL4.1，以限制性核酸内切酶消化验证插入序列的正确性。(3)制备pKpL-4.2质粒DNA取pKpL4.1质粒DNA用Xba I消化后，以klenow和dNTP修饰成平端，再以Bam HI消化制成载体臂，用T4 DNA连接酶与16s rRNA3’端匹配序列接头，以16s rRNA3’端匹配序列接头正链和rrnb转录终止子负链为引物，PCR法筛选阳性重组克隆，阳性重组子即为pKpL4.2，并以相应限制性核酸内切酶法验证插入序列的正确性。(4)制备pKpL5质粒DNA以构建pKpL4.2相同的方法制备pKpL4.2质粒载体臂，与凝血酶识别位点编码区接头连接，并以凝血酶识别位点编码区接头正链和rrnb转录终止子负链为引物，PCR法筛选阳性重组子，阳性重组子即为pKpL5，并以相应限制性核酸内切酶法验证插入序列的正确性。
pKpL5构建过程中，在起始密码下游嵌入六聚组氨酸接头，使目的蛋白与金属锂盐能特异结合，仅通过含金属锂盐的凝胶或其它基质一步法进行亲和纯化，不仅减少纯化步骤，而且能显著提高目的蛋白的纯度，并且在六聚组氨酸上游引入两个甘氨酸，保护六聚组氨酸的完整性，在六聚组氨酸下游亦嵌入大量甘氨酸，这不仅能使六聚组氨酸基因更好地形成独立结构域，而且能暴露于目的蛋白分子的表面，增强基团的电荷和消除空间阻碍，有利于目的蛋白与金属锂盐层析柱间紧密结合。在六聚组氨酸接头下游，嵌入16s rRNA3’端匹配序列接头，该接头能显著提高mRNA与核糖体间的结合力，从而显著增强目的基因的翻译。在16s rRNA3’端匹配序列接头下游嵌入了凝血酶识别位点编码区接头，并在下游嵌入了Bam HI识别位点用于目的基因克隆，目的蛋白纯化后，使用凝血酶进行消化，使目的蛋白氨基酸序列还原，与天然蛋白比较，N端仅增添了Gly-Ser，这两个氨基酸不含侧链，难与下游氨基酸间形成氢键，对目的蛋白的生物活性影响较小。
与现有技术相比，本发明技术增强了目的基因的表达，提高目的蛋白产量，性能稳定可靠，为生物工程下游产品的纯化提取提供了简捷措施。基因表达试验取得令人满意的效果，具体试验结果如下(1)筛选重组阳性克隆试验本发明pKpL4载体臂与六聚组合氨酸接头连接产物、pKpL4.1载体臂与16s rRNA3’端匹配序列接头连接物及pKpL4.2载体臂与凝血酶识别位点编码区接头连接产物分别转化感受态大肠杆菌pop2136细胞后，在含氨苄青霉素LB平板上生长的细菌克隆进行小量扩增培养，饱和酚、氯仿一步法制备DNA模板，经PCR扩增筛选，并且以限制性核酸内切酶鉴定相应接头的重组方向，pKpK4.1以限制性内切酶Bam HI、KpnI进行消化，具有Bam HI而不含KpnI识别位点者正确。pKpL4.2以限制性内切酶Bam HI、XbaI消化，同时具备Bam HI与XbaI识别位点者为正确。pKpL5以限制性内切酶Bam HI、XbaI消化，仅具备Bam HI识别位者为正确。结果在每次重组后均可筛选到重组阳性克隆。
(2)目的基因的表达试验参考本研究所保存的pT survivin、pT-surviving double、pT-LACK质粒内人生存素单体、双体和利什曼原虫LACK抗原基因编码区序列(生存素单体基因编码区长429nt，编码142个氨基酸；人生存素双体编码区长为900nt，编码299个氨基酸；利什曼原虫LACK抗原基因编码区长为948nt，编码315个氨基酸)，分别设计目的基因引物进行PCR扩增，并在目的基因上游引物中嵌入Bam HI位点，在下游引物中嵌入Hind III位点，将这3个目的基因编码区分别克隆入原核表达质粒pQE32、pKpL4和pKpL5内Bam HI和Hind III位点间，pQE32-survivin、pQE32-surviving double、pQE32-LACK分别转化感受态大肠杆菌M15，分别挑取单个菌落，以含氨苄青霉素的LB培养液于37℃培养致对数生长中期，加入IPTG至终浓度1mM，高速振荡培养4小时(300转/分)，离心收集细菌，裂解后以SDS-PAGE电泳分析目的蛋白表达量。pKpL4-survivin、pKpL4-surviving double、pKpL4-LACK、pKpL5-survivin、pKpL5-surviving double及pKpL5-LACK分别转化感受态大肠杆菌pop2136，于32℃扩增培养至对数生长中期，于42℃高速震荡培养诱导目的基因表达4小时后，离心收集细菌，分析相应目的蛋白的表达量。并超声粉碎细菌，制备包涵体，进一步确认目的蛋白表达。
结果含pQE32、pQE32-survivin、pQE32-surviving double、pQE32-LACK的大肠杆菌M15进行IPTG诱导表达4小时后，SDS-PAGE电泳检测未见明显的目的蛋白条带，再将含pKpL4-survivin、pKpL4-surviving double、pKpL4-LACK的大肠杆菌pop2136进行热诱导表达4小时，与含pKpL4的大肠杆菌pop2136相比较，亦未见明显的目的蛋白表达条带，而pKpL5-survivin、pKpL5-surviving double、pKpL5-LACK的大肠杆菌pop2136经热诱导表达4小时后，均可见明显的目的蛋白表达条带，经Quantity ONE(Bio-Rab公司)软件分析，目的蛋白的表达量分别占全菌总蛋白量的5.1％，19％和35％。将pKpL5-survivin、pKpL5-surviving double、pKpL5-LACK进行大量表达后，超声粉碎细菌制备包涵体，将包涵体进行SDS-PAGE电泳分析，可见相应目的蛋白条带进一步增强，一方面说明目的蛋白表达的真实性，另一方面证明了相应目的蛋白以包涵体形式表达，详见图2。如图2所示，通过SDS-PAGE电泳蛋白质检测，本发明的原核载体pKpL5对目的基因的表达真实可靠，可大大提高目的蛋白质的产量，图2中MS竖向为分子量，横向数字说明如下1、蛋白质分子量；2、pQE32对照；3、pQE32-Survivin；4、pQE32-Survivin double；5、pQE32-LACK；6、pKpL4对照；7、pKpL4-Survivin；8、pKpL4-Survivin double；9、pKpL4-LACK；10、pKpL5-Survivin；11、pKpL5-Survivin包涵体；12、pKpL5-Survivin double；13、pKpL5-Survivindouble包涵体；14、pKpL5-LACK；15、pKpL5-LACK包涵体。
原核表达质粒载体——pKpL5可用作通用原核高效表达质粒载体表达各种目的的基因。
图1为本发明原核表达载体pKpL5构建流程图图2为本发明目的基因表达效果图
具体实施例方式实施例1如图1所示，按下列步骤进行原核表达质粒载体——pKpL5构建，(1)首先根据发明目的设计并人工合成出六聚组氨酸编码区、16s rRNA3’端互补区、凝血酶识别位点编码区接头，三个接头的5’端分别含限制性核酸内切酶Nco I、Bam HI、Bam HI残存碱基，上述三个接头可以自行合成，也可委托相关生物工程公司合成，本实施例三个接头均系委托上海生工公司人工合成。
所说的六组氨酸编码区接头接正链序列为CATGGGCCATCATCATCACCATCACAGCAGCGGATCCG，负链为CGGATCCGCTGCTGTGATGGTGATGATGGCC，六组氨酸接头N端和C端分别含有甘氨酸，六组氨酸编码区下游含Bam HI识别位点。
16s rRNA3’端匹配序列接头正链序列为GATCGCATGCCTTACAAAGCGGATCCTCTAGAG，负链序列为CGGATCCGCTGCTTTGTAAGGCATGC，其中CATGCCTTACAAAG为16s rRNA3’端互补区，3’端含有Bam HI和Xba I识别位点。
所说的凝血酶识别位点编码区序列接头正链序列为CATCGAGCGGACTGGTTCCGCGTGGATCCG，负链序列为CGGATCCACGCGGAACCAGTCCGCTC，其中GTTCCGCGTGGA编码的Val-Pro-Arg-Gly为凝血酶识别位点，序列的3’端含有Bam HI识别点；(2)分别将六组氨酸接头的正、负链，16s rRNA3’端匹配接头正、负链和凝血酶识别位点编码区序列接头正负链各自混合后在100℃变性与复性后，组装构成三个接头，3个接头的5’端分别含NcoI、Bam HI、Bam HI残存碱基备用；(3)制备pKpL4.1取pKpL4质粒DNA(含双启动子、双SD区、rrnb转录终止子，由北京大学医学部分子免疫室提供，中华基因网2004.06.12曾予报道)，经Bam HI消化后，以Klenow酶和dNTP修饰成平端，再以Nco I消化，1.0％琼脂糖凝胶电泳后，以美国生命技术公司产DNA凝胶回收试剂盒，按操作说明回收载体臂DNA，再用小牛肠磷酸脂酶(CIP)脱磷酸化后，加入的六聚组氨酸接头，用T4DNA连接酶连接，连接产物转化经CaCL2法制备的感受态大肠杆菌pop2136细胞，以六聚组氨酸接头正链和rrnb转录终止子负链为引物，PCR法筛选重组阳性克隆，阳性重组子即为pKpL4.1，以限制性核酸内切酶消化试验验证插入序列的正确性；(4)制备pKpL-4.2质粒DNA取pKpL4.1质粒DNA用Xba I消化后，以大肠杆菌大片段聚合酶(klenow)和dNTP修饰成平端，再以Bam HI消化制成载体臂，用T4DNA连接酶与16s rRNA3’端匹配序列接头，以16srRNA3’端匹配序列接头正链和rrnb转录终止子负链为引物，PCR法筛选阳性重组克隆，阳性重组子即为pKpL4.2，并以相应限制性核酸内切酶消化实验验证插入序列的正确性；(5)制备pKpL5质粒DNA以构建pKpL4.2相同的方法制备pKpL4.2质粒载体臂，与凝血酶识别位点编码区接头连接，并以凝血酶识别位点编码区接头正链和rrnb转录终止子负链为引物，PCR法筛选阳性重组子，阳性重组子即为pKpL5，并以相应限制性核酸内切酶法验证插入序列的正确性。本发明中插入的3个接头拼接后的核酸序列及编码蛋白质序列为ATG GGC CAT CAT CAT CAC CAT CAC AGC AGCGGA TCC CAT GCC TTA CAA AGC GGA TCC AGC GGA CTG GTTCCG CGTGGA TCCGBamH IMet Gly His His His His His His Ser Ser Gly Ser HisPro Leu Glu Ser Gly Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser本发明所用酶如内切酶、Taq酶和连接酶等，购自美国基因公司和美国Invitrogen公司，大肠杆菌pop2136(含C1857温度敏感阻遏子)由北京大学医学部分子免疫室提供。
核苷酸氨基酸序列表<110>川北医学院<120>基因工程生产用原核表达质粒载体pKpL及其构建方法<160>4<210>1<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<400>1catgggccat catcatcacc atcacagcag cggatccg38<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>RBS<400>2gatcgcatgc cttacaaagc ggatcctcta gag 33<210>3<211>30<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>CDS<400>3catcgagcgg actggttccg cgtggatccg30<210>4<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(37...57)<400>4atg ggc cat cat cat cac cat cac agc agc ggatcc cat gcc tta caa agc gga tcc agc gga ctggtt ccg cgtgga tccgBamH IMet Gly His His His His His His Ser Ser Gly Ser His1 5 10Pro Leu Glu Ser Gly Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser15 20 2权利要求
1.一种基因工程生产用原核表达质粒载体——pKpL5，其特征在于在含有双启动子、双SD区、rrnb转录终止子的pKpL4原核质粒载体的起始码下游嵌入人工合成的六聚组氨酸编码区、16s rRNA3’端互补区、凝血酶识别位点编码区接头，三个接头的5’端分别含限制性核酸内切酶Nco I、Bam HI、Bam HI残存碱基。
2.根据权利要求1所述的一种基因工程生产用原核表达质粒载体——pKpL5，其特征在于所说的六组氨酸编码区接头接正链序列为CATGGGCCATCATCATCACCATCACAGCAGCGGATCCG，负链为CGGATCCGCTGCTGTGATGGTGATGATGGCC，六组氨酸接头N端和C端分别含有甘氨酸，六组氨酸编码区，其下游含Bam HI识别位点。
3.根据权利要求1所述的一种基因工程生产用原核表达质粒载体——pKpL5，其特征在于16s rRNA3’端匹配序列接头正链序列为GATCGCATGCCTTACAAAGCGGATCCTCTAGAG，负链序列为CGGATCCGCTGCTTTGTAAGGCATGC，其中CATGCCTTACAAAG为16srRNA3’端互补区，3’端含有Bam HI和Xba I识别位点。
4.根据权利要求1所述的一种基因工程生产用原核表达质粒载体——pKpL5，其特征在于所说的凝血酶识别位点编码区序列接头正链序列为CATCGAGCGGACTGGTTCCGCGTGGATCCG，负链序列为CGGATCCACGCGGAACCAGTCCGCTC，其中GTTCCGCGTGGA编码的Val-Pro-Arg-Gly为凝血酶识别位点，序列的3’端含有Bam HI识别点。
5.权利1所述的一种基因工程生产用原核表达质粒载体—pKpL5构建方法，其特征在于按下列步骤进行；(1)分别将六组氨酸接头的正、负链，16s rRNA3’端匹配接头正、负链和凝血酶识别位点编码区序列接头正负链各自混合后在100℃变性与复性后，组装成构成三个接头，3个接头的5’端分别含Nco I、Bam HI、Bam HI残存碱基备用；(2)制备pKpL4.1取pKpL4质粒DNA，经Bam HI消化后，以Klenow酶和dNTP修饰成平端，再以Nco I消化，1.0％琼脂糖凝胶电泳后回收载体臂DNA，再用CIP脱磷酸化后，加入的六聚组氨酸接头，用T4DNA连接酶连接，连接产物转化经CaCL2法制备的感受态大肠杆菌pop2136细胞，以六聚组氨酸接头正链和rrnb转录终止子负链为引物，PCR法筛选重组阳性克隆，阳性重组子即为pKpL4.1，以限制性核酸内切酶消化验证插入序列的正确性；(3)制备pKpL-4.2质粒DNA取pKpL4.1质粒DNA用Xba I消化后，以klenow和dNTP修饰成平端，再以Bam HI消化制成载体臂，用T4DNA连接酶与16s rRNA3’端匹配序列接头，以16srRNA3’端匹配序列接头正链和rrnb转录终止子负链为引物，PCR法筛选阳性重组克隆，阳性重组子即为pKpL4.2，并以相应限制性核酸内切酶法验证插入序列的正确性；(4)制备pKpL5质粒DNA以构建pKpL4.2相同的方法制备pKpL4.2质粒载体臂，与凝血酶识别位点编码区接头连接，并以凝血酶识别位点编码区接头正链和rrnb转录终止子负链为引物，PCR法筛选阳性重组子，阳性重组子即为pKpL5，并以相应限制性核酸内切酶法验证插入序列的正确性。
全文摘要
本发明公开了一种基因工程生产用原核表达质粒载体——pKpL5及其构建方法，其特征在于在含有双启动子、双SD区、rrnb转录终止子的pKpL4原核质粒载体的起始码下游嵌入人工合成的六聚组氨酸编码区、16s rRNA3’端互补区、凝血酶识别位点编码区接头，三个接头的5’端分别含限制性核酸内切酶Nco I、Bam HI、Bam HI残存碱基。该质粒载体能大大提高目的基因的表达效率，从而提高目的蛋白的产量，我们使用该质粒载体表达人生存素单体、双体和利什曼原虫LACK抗原，经SDS－PAGE电泳后用Quantity ONE(Bio－Rad公司)软件分析，目的蛋白的表达量分别占全菌总蛋白量的5.1％，19％和35％。同时本发明还能简化目的蛋白的纯化程序，降低目的蛋白的生产成本。原核表达质粒载体——pKpL5可用作原核高效表达通用质粒载体表达各种目的的基因。
文档编号C12N15/63GK1966690SQ20061002154
公开日2007年5月23日 申请日期2006年8月5日 优先权日2006年8月5日
发明者敬保迁, 马大龙, 张洁 申请人:川北医学院