本发明属于基因工程
技术领域：
，具体地说，涉及通过点突变法构建的一种热稳定性高的头孢菌素c酰化酶突变体、及其用于一步酶法生产7-氨基头孢烷酸(7-aca)的应用。
背景技术：
：目前占全球抗生素市场40％的头孢类抗生素大部分是通过7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanicacid，简称为7-aca)合成的7-aca衍生物。7-aca一般通过化学法或生物酶法裂解头孢菌素c(cephalosporinc，简称为cpc)，脱去分子侧链而获得。生物酶法一般是利用头孢菌素c酰化酶(cpc酰化酶)催化cpc脱去侧链，生成7-aca。参见专利文献pct/cn2017/076688，发明人通过之前的研究，对pseudomonassp.130来源的cpc酰化酶进行基因工程改造，开发了一系列cpc酰化酶的突变体，这些突变体克服了pseudomonassp.se83来源cpc酰化酶等在催化反应过程中遇到的产物抑制问题，同时大大提升了pseudomonassp.130来源的cpc酰化酶对头孢菌素c钠盐的酶活力。但在规模化生产7-aca时，发现cpc酰化酶突变体比如130-ed2等的稳定性不高，尤其是热稳定性较差，长时间反应后酶活力会明显下降甚至失活，需要补加酶来维持反应，导致7-aca生产成本仍然较高，影响了工业应用。技术实现要素：为了提高cpc酰化酶的热稳定性和酶活性，本发明利用基因工程技术对现有的cpc酰化酶进行改造和筛选，构建高热稳定性和酶活性的cpc酰化酶突变体，从而促进实现酶法生产7-aca的工业化。通过随机突变技术继续对pct/cn2017/076688中的130-ed2突变体seqidno:1进行改造，获得了以cpc作为特异性底物的高酶活、高热稳定性的cpc酰化酶突变体。具体而言，本发明包括如下技术方案。一种头孢菌素c酰化酶(cpc酰化酶)突变体，其为氨基酸序列seqidno:1第12位a、第199位d、第306位a、第494位v中一个、两个、三个或四个发生改变所产生的突变体，所述改变包括但不限于被其他氨基酸取代、缺失、化学修饰；或者与所述氨基酸序列具有85％以上、优选90％以上、优选95％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性的多肽。优选上述改变是指被其他氨基酸取代。比如，a被c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w、y或z取代；d被a、c、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w、y或z取代；或者v被a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、w、y或z取代。在一种实施方式中，上述改变是指第12位a替换为n(即a12n)、第199位d替换为n(即d199n)、第306位a替换为t(即a306t)、第494位v替换为m(即v494m)或者它们两种以上的组合。优选地，上述头孢菌素c酰化酶突变体的氨基酸序列选自下组：seqidno:3，其为seqidno:1第199位的d替换为n，第494位的v替换为m的突变体：meptstpqapiaaykprsneilwddygvphiygvdapsafygygwaqarshgdnilrlygeargkgaeywgpdyeqttvwlltngvperaqqwyaqqspdfranldafaaginayaqqnpddispdvrqvlpvsgadvvahahrlmnflyvaspgrtlgegdppdladqgsnswavapgktangnalllqnphlswttnyftyyeahlvtpdfevygatqiglpvirvafnqrmgitntfngmvgatnyrltlqdggylydgqvrpferrqasyrlrqadgttvdkpleirssvhgpvferadgtavavrvagldrpgmleqtfdmitadsfddyeaalarmqvptlnivyadregtinysfngvapkraegdiafwqglvpgdssrylwtethplddlprvtnppggfvqnsndppwtptwpvtytpkdfpsylapqtphslraqqsvrlmsenddltlerfmalqlshravmadrtlpdlipaalidpdpemqaaarllaawdreftsdsraallfeewarlfagqnfagqagfatpwsldkpvstpygvrdpkaavdqlrtaiantkrkygaidrpfgdasrmilndvnvpgaagygnlgsfrvftwsdpdengvrtpvhgetwvamiefstpvrayglmsygnsrqpgtthysdqiervsradfrelllrreqveaavqertpfnfkp(seqidno:3)；seqidno:4，其为seqidno:1第494位的v替换为m的突变体：meptstpqapiaaykprsneilwddygvphiygvdapsafygygwaqarshgdnilrlygeargkgaeywgpdyeqttvwlltngvperaqqwyaqqspdfranldafaaginayaqqnpddispdvrqvlpvsgadvvahahrlmnflyvaspgrtlgegdppdladqgsnswavapgktangnalllqnphlswttdyftyyeahlvtpdfevygatqiglpvirvafnqrmgitntfngmvgatnyrltlqdggylydgqvrpferrqasyrlrqadgttvdkpleirssvhgpvferadgtavavrvagldrpgmleqtfdmitadsfddyeaalarmqvptlnivyadregtinysfngvapkraegdiafwqglvpgdssrylwtethplddlprvtnppggfvqnsndppwtptwpvtytpkdfpsylapqtphslraqqsvrlmsenddltlerfmalqlshravmadrtlpdlipaalidpdpemqaaarllaawdreftsdsraallfeewarlfagqnfagqagfatpwsldkpvstpygvrdpkaavdqlrtaiantkrkygaidrpfgdasrmilndvnvpgaagygnlgsfrvftwsdpdengvrtpvhgetwvamiefstpvrayglmsygnsrqpgtthysdqiervsradfrelllrreqveaavqertpfnfkp(seqidno:4)；seqidno:5，其为seqidno:1第12位的a替换为n，第199位的d替换为n，第494位的v替换为m的突变体：meptstpqapinaykprsneilwddygvphiygvdapsafygygwaqarshgdnilrlygeargkgaeywgpdyeqttvwlltngvperaqqwyaqqspdfranldafaaginayaqqnpddispdvrqvlpvsgadvvahahrlmnflyvaspgrtlgegdppdladqgsnswavapgktangnalllqnphlswttnyftyyeahlvtpdfevygatqiglpvirvafnqrmgitntfngmvgatnyrltlqdggylydgqvrpferrqasyrlrqadgttvdkpleirssvhgpvferadgtavavrvagldrpgmleqtfdmitadsfddyeaalarmqvptlnivyadregtinysfngvapkraegdiafwqglvpgdssrylwtethplddlprvtnppggfvqnsndppwtptwpvtytpkdfpsylapqtphslraqqsvrlmsenddltlerfmalqlshravmadrtlpdlipaalidpdpemqaaarllaawdreftsdsraallfeewarlfagqnfagqagfatpwsldkpvstpygvrdpkaavdqlrtaiantkrkygaidrpfgdasrmilndvnvpgaagygnlgsfrvftwsdpdengvrtpvhgetwvamiefstpvrayglmsygnsrqpgtthysdqiervsradfrelllrreqveaavqertpfnfkp(seqidno:5)；seqidno:6，其为seqidno:1第199位的d替换为n，第306位的a替换为t，第494位的v替换为m的突变体：meptstpqapiaaykprsneilwddygvphiygvdapsafygygwaqarshgdnilrlygeargkgaeywgpdyeqttvwlltngvperaqqwyaqqspdfranldafaaginayaqqnpddispdvrqvlpvsgadvvahahrlmnflyvaspgrtlgegdppdladqgsnswavapgktangnalllqnphlswttnyftyyeahlvtpdfevygatqiglpvirvafnqrmgitntfngmvgatnyrltlqdggylydgqvrpferrqasyrlrqadgttvdkpleirssvhgpvferadgttvavrvagldrpgmleqtfdmitadsfddyeaalarmqvptlnivyadregtinysfngvapkraegdiafwqglvpgdssrylwtethplddlprvtnppggfvqnsndppwtptwpvtytpkdfpsylapqtphslraqqsvrlmsenddltlerfmalqlshravmadrtlpdlipaalidpdpemqaaarllaawdreftsdsraallfeewarlfagqnfagqagfatpwsldkpvstpygvrdpkaavdqlrtaiantkrkygaidrpfgdasrmilndvnvpgaagygnlgsfrvftwsdpdengvrtpvhgetwvamiefstpvrayglmsygnsrqpgtthysdqiervsradfrelllrreqveaavqertpfnfkp(seqidno:6)；或者seqidno:7，其为seqidno:1第12位的a替换为n、第199位的d替换为n、第306位的a替换为t、第494位的v替换为m的突变体：meptstpqapinaykprsneilwddygvphiygvdapsafygygwaqarshgdnilrlygeargkgaeywgpdyeqttvwlltngvperaqqwyaqqspdfranldafaaginayaqqnpddispdvrqvlpvsgadvvahahrlmnflyvaspgrtlgegdppdladqgsnswavapgktangnalllqnphlswttnyftyyeahlvtpdfevygatqiglpvirvafnqrmgitntfngmvgatnyrltlqdggylydgqvrpferrqasyrlrqadgttvdkpleirssvhgpvferadgttvavrvagldrpgmleqtfdmitadsfddyeaalarmqvptlnivyadregtinysfngvapkraegdiafwqglvpgdssrylwtethplddlprvtnppggfvqnsndppwtptwpvtytpkdfpsylapqtphslraqqsvrlmsenddltlerfmalqlshravmadrtlpdlipaalidpdpemqaaarllaawdreftsdsraallfeewarlfagqnfagqagfatpwsldkpvstpygvrdpkaavdqlrtaiantkrkygaidrpfgdasrmilndvnvpgaagygnlgsfrvftwsdpdengvrtpvtgetwvamiefstpvrayglmsygnsrqpgtthysdqiervsradfrelllrreqveaavqertpfnfkp(seqidno:7)。优选上述头孢菌素c酰化酶突变体为seqidno:7。本发明的第二个方面在于提供编码上述cpc酰化酶突变体的基因。当所述头孢菌素c酰化酶突变体为seqidno:7时，优选编码基因的核苷酸序列为seqidno:8：atggaaccgacctccaccccgcaggctccgatcaacgcttacaaaccgcgttccaacgaaatcctgtgggacgactacggtgttccgcacatctacggtgttgacgctccgtccgctttctacggttacggttgggctcaggctcgttcccacggtgacaacatcctgcgtctgtacggtgaagctcgtggtaaaggtgctgaatactggggtccggactacgaacagaccaccgtttggctgctgaccaacggtgttccggaacgtgctcagcagtggtacgctcagcagtccccggacttccgtgctaacctggacgctttcgctgctggtatcaacgcttacgctcagcagaacccggacgacatctccccggacgttcgtcaggttctgccggtttccggtgctgacgttgttgctcacgctcaccgtctgatgaacttcctgtacgttgcttccccgggtcgtaccctgggtgaaggtgacccgccggacctggctgaccagggttccaactcctgggctgttgctccgggtaaaaccgctaacggtaacgctctgctgctgcagaacccgcacctgtcctggaccaccaactacttcacctactacgaagctcacctggttaccccggacttcgaagtttacggtgctacccagatcggtctgccggttatccgtgttgctttcaaccagcgtatgggtatcaccaacaccttcaacggtatggttggtgctaccaactaccgtctgaccctgcaggacggtggttacctgtacgacggtcaggttcgtccgttcgaacgtcgtcaggcttcctaccgtctgcgtcaggctgacggtaccaccgttgacaaaccgctggaaatccgttcctccgttcacggtccggttttcgaacgtgctgacggtaccactgttgctgttcgtgttgctggtctggaccgtccgggtatgctggaacagaccttcgacatgatcaccgctgactccttcgacgactacgaagctgctctggctcgtatgcaggttccgaccctgaacatcgtttacgctgaccgtgaaggtaccatcaactactccttcaacggtgttgctccgaaacgtgctgaaggtgacatcgctttctggcagggtctggttccgggtgactcctcccgttacctgtggaccgaaacccacccgctggacgacctgccgcgtgttaccaacccgccgggtggtttcgttcagaactccaacgacccgccgtggaccccgacctggccggttacctacaccccgaaagacttcccgtcctacctggctccgcagaccccgcactccctgcgtgctcagcagtccgttcgtctgatgtccgaaaacgacgacctgaccctggaacgtttcatggctctgcagctgtcccaccgtgctgttatggctgaccgtaccctgccggacctgatcccggctgctctgatcgacccggacccggaaatgcaggctgctgctcgtctgctggctgcttgggaccgtgaattcacctccgactcccgtgctgctctgctgttcgaagaatgggctcgtctgttcgctggtcagaacttcgctggtcaggctggtttcgctaccccgtggtccctggacaaaccggtttccaccccgtacggtgttcgtgacccgaaagctgctgttgaccagctgcgtaccgctatcgctaacaccaaacgtaaatacggtgctatcgaccgtccgttcggtgacgcttcccgtatgatcctgaacgacgttaacgttccgggtgctgctggttacggtaacctgggttccttccgtgttttcacctggtccgacccggacgaaaacggtgttcgtaccccggttaccggtgaaacctgggttgctatgatcgaattctccaccccggttcgtgcttacggtctgatgtcctacggtaactcccgtcagccgggtaccacccactactccgaccagatcgaacgtgtttcccgtgctgacttccgtgaactgctgctgcgtcgtgaacaggttgaagctgctgttcaggaacgtaccccgttcaacttcaaaccg(seqidno:8)。本发明的第三个方面在于提供包含上述基因的质粒。该质粒是pet系列载体，比如载体是pet24a(+)，但并不受限于此。本发明的第四个方面在于提供表达上述编码基因的微生物，其转化了上述质粒。优选地，上述微生物选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌、顶头孢霉、产黄青霉，优选大肠杆菌、顶头孢霉，更优选大肠杆菌bl21(de3)。本发明的第五个方面在于提供上述cpc酰化酶突变体或微生物在生产7-aca中的用途。上述头孢菌素c酰化酶突变体或者微生物可以用于生产7-aca、尤其是一步酶法生产7-aca。在生产7-aca中，以头孢菌素c(即cpc)为底物原料，用上述头孢菌素c酰化酶突变体或者微生物作为催化剂来催化反应。生产7-aca可采用常规的工艺条件，比如，头孢菌素c的浓度可选择1～3wt％，优选2.5wt％；反应温度选择10～37℃，优选12～35℃，更优选12～30℃，更优选14～25℃，最优选15±0.5℃。在一种可选的实施方式中，当使用上述头孢菌素c酰化酶突变体催化反应时，头孢菌素c酰化酶突变体呈固定化酶形式，从而更进一步提高cpc酰化酶蛋白的稳定性和使用寿命。相较初始酶seqidno:1，本发明的cpc酰化酶突变体seqidno:3-7的热稳定性和酶活性都显著提高，酶活力最高提升了2.9倍，热稳定性最高提升了约2.7倍。用突变体seqidno:7纯酶制成固定化酶并作为催化剂进行一步酶法生产7-aca时，在15±0.5℃温度下反应40-60min，连续反应50个批次，cpc的转化率均超过97％。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。为简要起见，本文中的氨基酸缩写既可以使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员熟知的，这些缩写列于下表中：表1、氨基酸中英文对照及缩写丙氨酸alaninea或ala脂肪族类精氨酸argininer或arg碱性氨基酸类天冬酰胺asparaginen或asn酰胺类天冬氨酸asparticacidd或asp酸性氨基酸类半胱氨酸cysteinec或cys含硫类谷氨酰胺glutamineq或gln酰胺类谷氨酸glutamicacide或glu酸性氨基酸类甘氨酸glycineg或gly脂肪族类组氨酸histidineh或his碱性氨基酸类异亮氨酸isoleucinei或ile脂肪族类亮氨酸leucinel或leu脂肪族类赖氨酸lysinek或lys碱性氨基酸类蛋氨酸methioninem或met含硫类苯丙氨酸phenylalaninef或phe芳香族类脯氨酸prolinep或pro亚氨基酸丝氨酸serines或ser羟基类苏氨酸threoninet或thr羟基类色氨酸tryptophanw或trp芳香族类酪氨酸tyrosiney或tyr芳香族类缬氨酸valinev或val脂肪族类作为构建头孢菌素c酰化酶突变体的基础模板，其为pct/cn2017/076688中的cpc酰化酶130-ed2，即本发明序列表中的seqidno:1：meptstpqapiaaykprsneilwddygvphiygvdapsafygygwaqarshgdnilrlygeargkgaeywgpdyeqttvwlltngvperaqqwyaqqspdfranldafaaginayaqqnpddispdvrqvlpvsgadvvahahrlmnflyvaspgrtlgegdppdladqgsnswavapgktangnalllqnphlswttdyftyyeahlvtpdfevygatqiglpvirvafnqrmgitntfngmvgatnyrltlqdggylydgqvrpferrqasyrlrqadgttvdkpleirssvhgpvferadgtavavrvagldrpgmleqtfdmitadsfddyeaalarmqvptlnivyadregtinysfngvapkraegdiafwqglvpgdssrylwtethplddlprvtnppggfvqnsndppwtptwpvtytpkdfpsylapqtphslraqqsvrlmsenddltlerfmalqlshravmadrtlpdlipaalidpdpevqaaarllaawdreftsdsraallfeewarlfagqnfagqagfatpwsldkpvstpygvrdpkaavdqlrtaiantkrkygaidrpfgdasrmilndvnvpgaagygnlgsfrvftwsdpdengvrtpvtgetwvamiefstpvrayglmsygnsrqpgtthysdqiervsradfrelllrreqveaavqertpfnfkp(seqidno:1)。seqidno:1的编码基因是本发明序列表中的seqidno:2：atggaaccgacctccaccccgcaggctccgatcgccgcttacaaaccgcgttccaacgaaatcctgtgggacgactacggtgttccgcacatctacggtgttgacgctccgtccgctttctacggttacggttgggctcaggctcgttcccacggtgacaacatcctgcgtctgtacggtgaagctcgtggtaaaggtgctgaatactggggtccggactacgaacagaccaccgtttggctgctgaccaacggtgttccggaacgtgctcagcagtggtacgctcagcagtccccggacttccgtgctaacctggacgctttcgctgctggtatcaacgcttacgctcagcagaacccggacgacatctccccggacgttcgtcaggttctgccggtttccggtgctgacgttgttgctcacgctcaccgtctgatgaacttcctgtacgttgcttccccgggtcgtaccctgggtgaaggtgacccgccggacctggctgaccagggttccaactcctgggctgttgctccgggtaaaaccgctaacggtaacgctctgctgctgcagaacccgcacctgtcctggaccaccgactacttcacctactacgaagctcacctggttaccccggacttcgaagtttacggtgctacccagatcggtctgccggttatccgtgttgctttcaaccagcgtatgggtatcaccaacaccttcaacggtatggttggtgctaccaactaccgtctgaccctgcaggacggtggttacctgtacgacggtcaggttcgtccgttcgaacgtcgtcaggcttcctaccgtctgcgtcaggctgacggtaccaccgttgacaaaccgctggaaatccgttcctccgttcacggtccggttttcgaacgtgctgacggtaccgctgttgctgttcgtgttgctggtctggaccgtccgggtatgctggaacagaccttcgacatgatcaccgctgactccttcgacgactacgaagctgctctggctcgtatgcaggttccgaccctgaacatcgtttacgctgaccgtgaaggtaccatcaactactccttcaacggtgttgctccgaaacgtgctgaaggtgacatcgctttctggcagggtctggttccgggtgactcctcccgttacctgtggaccgaaacccacccgctggacgacctgccgcgtgttaccaacccgccgggtggtttcgttcagaactccaacgacccgccgtggaccccgacctggccggttacctacaccccgaaagacttcccgtcctacctggctccgcagaccccgcactccctgcgtgctcagcagtccgttcgtctgatgtccgaaaacgacgacctgaccctggaacgtttcatggctctgcagctgtcccaccgtgctgttatggctgaccgtaccctgccggacctgatcccggctgctctgatcgacccggacccggaagtgcaggctgctgctcgtctgctggctgcttgggaccgtgaattcacctccgactcccgtgctgctctgctgttcgaagaatgggctcgtctgttcgctggtcagaacttcgctggtcaggctggtttcgctaccccgtggtccctggacaaaccggtttccaccccgtacggtgttcgtgacccgaaagctgctgttgaccagctgcgtaccgctatcgctaacaccaaacgtaaatacggtgctatcgaccgtccgttcggtgacgcttcccgtatgatcctgaacgacgttaacgttccgggtgctgctggttacggtaacctgggttccttccgtgttttcacctggtccgacccggacgaaaacggtgttcgtaccccggttaccggtgaaacctgggttgctatgatcgaattctccaccccggttcgtgcttacggtctgatgtcctacggtaactcccgtcagccgggtaccacccactactccgaccagatcgaacgtgtttcccgtgctgacttccgtgaactgctgctgcgtcgtgaacaggttgaagctgctgttcaggaacgtaccccgttcaacttcaaaccg(seqidno:2)。为了获得热稳定性高、且酶活性更高的cpc酰化酶突变体，本发明对cpc酰化酶130-ed2即seqidno:1的编码基因序列seqidno:2继续进行点突变。通过易错pcr技术获得一个或多个氨基酸位点改变比如发生取代的突变体氨基酸序列，筛选出4个可提高cpc酰化酶稳定性或者提高酶活力的位点，然后以定点组合突变的方式，获得本发明中具有氨基酸序列seqidno:4的突变体，最后再以本发明中具有氨基酸序列seqidno:4突变体的基因为模板，进行第二轮易错pcr技术，获得本发明中具有氨基酸序列seqidno:3-7的突变体。其中，seqidno:1是这些氨基酸序列seqidno:3-7的共同序列，这些氨基酸序列都是在seqidno:1的基础上进行1个、2个、3个或4个氨基酸的替换而获得的突变体，这些突变体氨基酸序列保持了99％以上的同源性。在本发明中，术语“cpc酰化酶突变体”、“突变体cpc酰化酶”、“突变cpc酰化酶”和“突变酶”表示相同的意义，都是指以初始型头孢菌素c酰化酶130-ed2为基础通过氨基酸改变所形成的突变体。在本发明中，术语“初始(型)酶”、“初始型”表示相同的意义，都是指cpc酰化酶130-ed2(seqidno:1)。本发明的cpc酰化酶突变体的氨基酸数量只有692个，且结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。为了在不同微生物中进行蛋白质seqidno:3-7的最佳表达，可以针对特定的微生物比如大肠杆菌或者顶头孢霉进行密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组trna库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的dna序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。在本文中所提供的基因序列seqidno:8是针对cpc酰化酶突变体seqidno:7经过密码子优化的核苷酸序列，但本发明的cpc酰化酶突变体seqidno:7表达基因不限于此。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。上述转化体宿主可以是任何适合表达cpc酰化酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌、顶头孢霉或者产黄青霉，优选大肠杆菌或者顶头孢霉，更优选大肠杆菌bl21(de3)。当作为生物催化剂用于生产7-aca时，本发明的cpc酰化酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。本发明的cpc酰化酶突变体分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。比如，酶固定化可以采用传统的载体固定法例如吸附法、包埋法、载体偶联法、双功能或多功能交联试剂交联法，也可以采用无载体固定法例如交联溶解酶、交联酶晶体、交联酶聚合体等等，但不限于此。以便将cpc酰化酶突变体固定下来、最大程度保持其酶活力，从而进一步提高酶蛋白的稳定性和使用寿命。实施例实施例中的全基因合成、引物合成及测序委托苏州金唯智公司完成。实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。pcr扩增实验根据质粒或dna模板供应商提供的反应条件或说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。pcr扩增实验根据质粒或dna模板供应商提供的反应条件或说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。lb培养基：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化钠，ph7.2。(lb固体培养基另加20g/l琼脂粉。)tb培养基：24g/l酵母提取物、12g/l胰蛋白胨、16.43g/lk2hpo4.3h2o、2.31g/lkh2po4、5g/l甘油，ph7.0-7.5。(tb固体培养基另加20g/l琼脂粉。)实施例1初始cpc酰化酶130-ed2表达菌株的构建根据pct/cn2017/076688中公布的cpc酰化酶130-ed2编码基因(原seqidno:13)，进行全基因合成，本文中为序列seqidno:2。在该基因两端设计限制性内切酶位点ndei和xhoi，亚克隆到载体pet24a(novagen)的相应位点，获得重组质粒pet24a-130ed2，转化表达宿主大肠杆菌bl21(de3)，得到表达初始cpc酰化酶的重组大肠杆菌，编号仍为130-ed2。实施例2易错pcr法构建随机突变点库及筛选2.1易错pcr法构建随机突变点库以seqidno:2为模板，应用易错pcr技术构建随机突变体库。正向引物c-f：5’-catatggaaccgacctccaccccgcag-3’，反向引物c-r：5’-ctcgagcggtttgaagttgaacggggtacgttc-3’。50μl易错pcr反应体系包括：50ng质粒模板pet24a-13ed2，30pmol一对引物c-f和c-r，1xtaqbuffer，0.2mmdgtp，0.2mmdatp，1mmdctp，1mmdttp，7mmmgcl2，(0mm、0.05mm、0.1mm、0.15mm、0.2mm)mncl2，2.5个单位的taq酶(fermentas)。pcr反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp；30个循环；72℃10min。胶回收2.0kb随机突变片段作为大引物，用kod-plusdna聚合酶做megaprimerpcr：94℃5min，；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。dpni消化质粒模板，电转化大肠杆菌e.colibl21(de3)，得到超过104个克隆的随机突变库。2.2突变体库的高通量筛选选取突变体库中的转化子接种到含700μllb培养基的96孔深孔培养板中，培养基中含100μg/ml卡那霉素和0.1mmiptg，37℃培养6h后，降温至25℃，培养过夜。5000rpm离心10min，弃上清，置于-70℃冷冻1h，室温融化30min。加入200μl含1mg/ml溶菌酶的0.1m磷酸钾盐缓冲液(ph8.0)，重悬菌体，37℃孵育1h，4℃，5000rpm离心20min，取20μl上清，40℃加热处理10min，然后用于cpc活力测定。2.3高通量酶活力测定底物1反应液：含2wt％cpc钠盐的0.1m磷酸钾盐缓冲液(ph8.0)，底物2反应液：含2wt％gl-7aca钠盐的0.1m磷酸钾盐缓冲液(ph8.0)，终止反应液：0.05mnaoh，20％v/v冰醋酸，显色剂：含0.5wt％的pdab(p-二甲氨基苯甲醛，p-dimethylaminobenzaldehyde)甲醇溶液。酶活力定义：在37℃下每分钟催化底物产生1微摩尔(μmol)7-aca所需要的酶量定义为1个单位(u)。将上述步骤2.2中的上清20μl加入20μl底物反应液，在37℃的条件下反应3h，加入200μl终止反应液，然后5000rpm离心10min。取200μl离心上清，加入40μl显色剂，室温反应10min后，检测415nm下的吸光度。2.4酶的热处理取上述步骤2.2中的上清，于70℃恒温水浴中保温48h。然后测定酶活力。通过对随机突变库筛选，结果显示至少d199n、v494m两个突变点能显著提高酶的热稳定性。结果显示于表2中。表2、随机突变菌的发酵粗酶液在37℃下的相对比活测试结果注：所有相对比活均指相对于出发菌株130-ed2未热处理条件下的酶活力百分比。实施例3第二轮易错pcr法构建随机突变点库及筛选3.1易错pcr法构建随机突变点库参照实施例2的方法，提取实施例2中获得的cpc酰化酶突变菌株130-v1菌株的质粒作为模板，应用易错pcr技术构建随机突变体库。易错pcr体系与实施例2中的步骤2.1相同，采用正向引物c-f、反向引物为c-r继续进行易错pcr。3.2突变体库的高通量筛选、热处理及活力测定方法同实施例2的步骤2.2、步骤2.3、步骤2.4。通过对随机突变库筛选，结果筛选出两株相对cpc钠盐底物活力明显提高，但热稳定性没有改善的菌株130-v3和130-v4，经测序结果显示130-v3中发生了a12n的突变，130-v4中发生了a306t的突变，结果显示于表3中。表3、随机突变菌的发酵粗酶液在37℃下的相对比活测试结果注：所有相对比活均指相对于出发菌株130-v1未热处理条件下的酶活力百分比。实施例4构建定点组合突变cpc酰化酶菌株根据实施例3中筛选出的a12n、a306t这2个位点，设计突变点引物，以pet24a-130-v3质粒为模板，构建定点组合库。4.1通过定点突变技术构建定向组合突变菌株以pet24a-130-v3质粒为模板，以306-f和306-r引物对进行环状pcr，构建定点组合库。引物序列为306-f：5’-cgtgctgacggtaccactgttgctgttcgtgttg-3’；306-r：5’-caacacgaacagcaacagtggtaccgtcagcacg-3’。第三轮pcr以片段p作为大引物，用kod-plusdna聚合酶做megaprimerpcr。50μl环状pcr反应体系包括：100ng质粒模板，30pmol306-f，30pmol306-r，1xkodplusbuffer，0.2mmdntp，1.5mmmgso4，5个单位的kod-plusdna聚合酶。pcr反应条件为：94℃2min；98℃10s，57℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。dpni消化质粒模板，化学转化大肠杆菌e.colibl21(de3)，随机挑取克隆测序鉴定获得组合突变菌株130-v34。4.2突变体库的高通量筛选、热处理及活力测定方法同实施例2的步骤2.2、步骤2.3、步骤2.4，结果如表4所示。表4、组合突变菌的发酵粗酶液在37℃下的相对比活测试结果注：所有相对比活均指相对于出发菌株130-v1未热处理条件下的酶活力百分比。实施例5菌株发酵、酶提取及纯酶比活测定5.1摇瓶发酵挑取130-v34单菌落，接种至5ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的lb液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。取2ml过夜培养物接种至200mltb培养基中，37℃，250rpm摇床培养2-3h，至od600约0.6-0.8时，加入0.1mmiptg，28℃，200rpm培养过夜。4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体。5.2酶的提取菌体用50ml平衡缓冲液(50mm磷酸钾盐缓冲液，200mmnacl，ph8.0)重悬，然后超声破碎，破碎后的菌体4℃，12000rpm，离心20min，收集上清。上清以1ml/min的速率加入含10mlni-nat基质的亲和层析柱中，然后用含有30mm咪唑的平衡缓冲液冲洗柱料，洗脱杂质。最后用含有500mm咪唑的平衡缓冲液冲洗脱目的蛋白，收集峰值洗脱液。洗脱液经截留分子量为10kda的超滤管进行脱盐处理，得纯酶。5.3纯酶比活力测定该步骤所用溶液与实施例2中步骤2.3所用试剂相同。将步骤5.2中的脱盐溶液20μl加入20μl底物反应液，在37℃的条件下反应5min后，加入200μl终止反应液，然后5000rpm离心10min。取200μl离心上清，加入40μl显色剂，室温反应10min后，检测415nm下的吸光度，与7-aca定量标准曲线进行比较定量。同时采用thermoscientific公司的bcaproteinassaykit试剂盒测定纯酶的蛋白浓度，从而获得纯酶的比活力。表5、酶在37℃下的酶活力对比结果注：所有相对比活均指相对于初始酶130-ed2在未热处理条件下的酶活力百分比。由表5可以看出，相比初始型cpc酰化酶seqidno:1，本发明的头孢菌素c酰化酶突变体seqidno:7的热稳定性提升了约2.7倍，并且酶活力也提高了2.9倍。实施例6cpc酰化酶突变体的固定化取1.50g纯酶，溶于水中至蛋白浓度18-20mg/ml，然后向此溶液中加入约5.4g磷酸二氢钾和16.5g磷酸氢二钾固体，并使用磷酸氢二钾固体校正酶溶液ph在8.0±0.2，然后加入10glx-1000ep环氧载体通过共价连接进行固定化，固定化条件：25℃、150rpm固定48小时，然后静置24小时后去除上清，用3倍体积的纯水清洗3次，抽干备用。实施例77-aca的生产称取2.8gcpc钠盐，加水溶解，降温至15℃，调整ph至8.2，加入实施例6中制备的3000u的固定化酶，搅拌反应。反应过程中控制温度15±0.5℃，ph8.0±0.2，反应40-80min，检测反应样品，当样品中cpc钠盐残留低于2wt％时，抽滤分离固定化酶，抽滤后的固定化酶直接加入底物进行下一批次反应，检测固定化酶连续使用50批次的反应情况。样品hplc检测方法为：精确量取100μl反应后的样品，用水定容至10ml，进行hplc分析，分析条件：c18200mm×4.6柱，波长262nm，流动相为0.02m醋酸钠ph5.5:乙腈(＝93:7)，温度25℃。结果显示，在15±0.5℃，ph8.0±0.2条件下，连续反应50个批次，反应40-60min，cpc钠盐的转化率均超过97％。综上所述，相比初始cpc酰化酶seqidno:1，本发明构建的cpc酰化酶突变体seqidnos:3-7的酶活力和热稳定性均有了提高，其中突变体seqidno:7酶活力最高提升了2.9倍，热稳定性提升了约2.7倍。用固定化突变酶seqidno:7催化cpc钠盐反应生产7-aca时，在15±0.5℃温度下反应40-60min，连续反应50个批次，cpc的转化率均超过97％，取得了良好效果。序列表<110>上海陶宇晟生物技术有限责任公司<120>一种热稳定性高的头孢菌素c酰化酶突变体<130>shpi2010062<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>692<212>prt<213>人工序列()<400>1metgluprothrserthrproglnalaproilealaalatyrlyspro151015argserasngluileleutrpaspasptyrglyvalprohisiletyr202530glyvalaspalaproseralaphetyrglytyrglytrpalaglnala354045argserhisglyaspasnileleuargleutyrglyglualaarggly505560lysglyalaglutyrtrpglyproasptyrgluglnthrthrvaltrp65707580leuleuthrasnglyvalprogluargalaglnglntrptyralagln859095glnserproasppheargalaasnleuaspalaphealaalaglyile100105110asnalatyralaglnglnasnproaspaspileserproaspvalarg115120125glnvalleuprovalserglyalaaspvalvalalahisalahisarg130135140leumetasnpheleutyrvalalaserproglyargthrleuglyglu145150155160glyaspproproaspleualaaspglnglyserasnsertrpalaval165170175alaproglylysthralaasnglyasnalaleuleuleuglnasnpro180185190hisleusertrpthrthrasptyrphethrtyrtyrglualahisleu195200205valthrproaspphegluvaltyrglyalathrglnileglyleupro210215220valileargvalalapheasnglnargmetglyilethrasnthrphe225230235240asnglymetvalglyalathrasntyrargleuthrleuglnaspgly245250255glytyrleutyraspglyglnvalargprophegluargargglnala260265270sertyrargleuargglnalaaspglythrthrvalasplysproleu275280285gluileargserservalhisglyprovalphegluargalaaspgly290295300thralavalalavalargvalalaglyleuaspargproglymetleu305310315320gluglnthrpheaspmetilethralaaspserpheaspasptyrglu325330335alaalaleualaargmetglnvalprothrleuasnilevaltyrala340345350asparggluglythrileasntyrserpheasnglyvalalaprolys355360365argalagluglyaspilealaphetrpglnglyleuvalproglyasp370375380serserargtyrleutrpthrgluthrhisproleuaspaspleupro385390395400argvalthrasnproproglyglyphevalglnasnserasnasppro405410415protrpthrprothrtrpprovalthrtyrthrprolysaspphepro420425430sertyrleualaproglnthrprohisserleuargalaglnglnser435440445valargleumetsergluasnaspaspleuthrleugluargphemet450455460alaleuglnleuserhisargalavalmetalaaspargthrleupro465470475480aspleuileproalaalaleuileaspproaspprogluvalglnala485490495alaalaargleuleualaalatrpasparggluphethrseraspser500505510argalaalaleuleuphegluglutrpalaargleuphealaglygln515520525asnphealaglyglnalaglyphealathrprotrpserleuasplys530535540provalserthrprotyrglyvalargaspprolysalaalavalasp545550555560glnleuargthralailealaasnthrlysarglystyrglyalaile565570575aspargpropheglyaspalaserargmetileleuasnaspvalasn580585590valproglyalaalaglytyrglyasnleuglyserpheargvalphe595600605thrtrpseraspproaspgluasnglyvalargthrprovalthrgly610615620gluthrtrpvalalametileglupheserthrprovalargalatyr625630635640glyleumetsertyrglyasnserargglnproglythrthrhistyr645650655seraspglnilegluargvalserargalaaspphearggluleuleu660665670leuargarggluglnvalglualaalavalglngluargthrprophe675680685asnphelyspro690<210>2<211>2076<212>dna<213>人工序列()<400>2atggaaccgacctccaccccgcaggctccgatcgccgcttacaaaccgcgttccaacgaa60atcctgtgggacgactacggtgttccgcacatctacggtgttgacgctccgtccgctttc120tacggttacggttgggctcaggctcgttcccacggtgacaacatcctgcgtct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