一种能同时降解手性除草剂2,4-滴丙酸两种异构体的降解菌株及其生产的菌剂的制作方法

本发明涉及一种能同时降解手性除草剂2,4-滴丙酸两种异构体的降解菌株及其生产的菌剂，属于生物高技术领域。

背景技术：

化学农药是世界农业迅速发展和粮食安全的重要保障，在农业生产的现代化进程中起了不可估量的作用。我国目前正在使用的化学农药中具有手性结构的农药(手性农药)约占40％。同时，随着化学农药品种的不断发展，农药类手性化合物的数量显著增加。而在各大农用化合物中，除草剂的使用量已居首位。研究表明，具有手性结构的除草剂(手性除草剂)在药效、环境安全性等方面存在不可忽视的对映异构体差异。虽然手性化合物的对映异构体具有相同的理化性质，但其异构体间却可能具有不同的生物活性和生态毒理。手性化合物的不彻底认识已给人类带来了惨痛的教训，如曾在医学领域轰动一时的“反应停”(沙利度胺)惨剧就是一个典型的案例。r-沙利度胺有镇静作用，可治疗怀孕期间的孕吐反应，而s-沙利度胺则有很强的致畸作用，在使用的6年中导致了全世界12000余例“海豹胎”畸形儿的产生。由于大多数手性除草剂至今仍是以外消旋体(具有旋光性的手性分子与其对映体的等摩尔混合物)形式生产和施用，不可避免地导致手性除草剂的不同异构体同时进入到生物体、土壤和水体等环境体系中。因此，手性除草剂在环境中的消亡已受到广泛关注。

2,4-滴丙酸(dichlorprop,dcpp)，是全世界广泛使用的典型手性除草剂之一。dcpp属于中等毒性化合物，受热分解会释放有毒化合物气体，如一氧化碳、氯化氢等。dcpp的除草活性和生长激素药效几乎全部集中于r-型对映体[(r)-dcpp]，s-型对映体[(s)-dcpp]不具有除草活性且具有轻微地抗生长素活性。dcpp具有潜在的致癌和致突变性，其挥发性弱，可溶性大，且难以生物降解和直接光解，环境残留率较高。dcpp经施用后，只有少部分能被植物体内吸收，其他大部分都会直接或间接进入到周边土壤中，由于其水溶性较大，易从土壤中随雨水或灌溉水进入水体环境。因此，对水生环境危害极大。与此同时，(s)-型对映体虽然没有除草活性，但其对非靶标生物可能有更大的毒性。因此，dcpp在环境中的消亡动态日益受到关注，人们迫切希望有一种切实可行方法，可以有效的去除环境中的dcpp残留。

生物降解是化学农药在环境中转化的一种重要过程，其中微生物是生物降解的主力军。微生物由于数量巨大、种类繁多、繁殖迅速、对环境适应性强以及不易产生二次污染等特点，被广泛应用于治理除草剂污染的土壤、水体甚至是农产品除草剂残留的祛除中。利用微生物的新陈代谢作用，对易残留的除草剂进行转化，使其无毒化，也是目前研究的热点。

技术实现要素：

本发明针对环境修复的实际问题和需求，提供一株能同时降解手性除草剂2,4-滴丙酸两种异构体的降解菌株。

本发明的另一目的是提供该降解菌株制备的菌剂。

本发明的又一目的是提供该降解菌剂的制备方法和应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

本发明提供一种(r,s)-dcpp高效降解菌株dcp-6(2019年12月23日寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctccno:m20191084。该菌株革兰氏染色反应阴性,，经鉴定属于sphingopyxissp.。菌株dcp-6的形态学特征为：在lb平板上呈橙黄色菌落，菌落凸起，表面湿润光滑，边缘整齐，不透明(图1a)。主要生物学特性为：g^－，菌体为杆状(0.5μm×1.4μm)，无鞭毛(图1b)，好氧；过氧化氢酶、氧化酶和v.p.反应为阳性；吲哚反应阴性；不能水解淀粉，使石蕊牛乳酸凝固。实验室摇瓶培养条件下，菌株dcp-6可在96h内完全降解30mg/l的(r,s)-dcpp(图2)。该菌株可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。

本发明所述的降解菌株dcp-6在制备降解苯氧羧酸类除草剂两种异构体的菌剂中的应用；所述的苯氧羧酸类除草剂选自(r,s)-dcpp、(r,s)-mcpp、2,4-d、mcpa或2,4-db中的任意一种或多种，优选(r,s)-dcpp、(r,s)-mcpp、2,4-d中的任意一种或多种。

一种用本发明所述的降解菌株生产的农药残留降解菌剂，由本发明所述的降解菌株发酵制得。

本发明所述的降解菌剂，优选通过以下方法生产而成：

(1)将(r,s)-dcpp降解菌株dcp-6的试管种接种于lb培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；

(2)将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期,种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖8g/l，酵母膏5g/l，k2hpo41g/l，nacl5g/l，caco32g/l，mgso40.2g/l，大豆油0.1％(v/v)，ph值7.2-7.5；

(3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

(4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6-1.2，搅拌速度为180-240rpm，培养温度为30-35℃，全流程培养时间为96-108小时,发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上,发酵液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

一种制备本发明所述的降解菌剂的方法，包含以下步骤：

(1)将(r,s)-dcpp降解菌株dcp-6的试管种接种于lb培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；

(2)将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期,种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖8g/l，酵母膏5g/l，k2hpo41g/l，nacl5g/l，caco32g/l，mgso40.2g/l，大豆油0.1％(v/v)，ph值7.2-7.5；

(3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

(4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6-1.2，搅拌速度为180-240rpm，培养温度为30-35℃，全流程培养时间为96-108小时,发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上,发酵液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

本发明所述的降解菌剂在降解苯氧羧酸类除草剂中的应用。

本发明所述的苯氧羧酸类除草剂降解菌株dcp-6在降解苯氧羧酸类除草剂中的应用，优选在降解土壤中苯氧羧酸类除草剂中的应用。

其中，所述的苯氧羧酸类除草剂优选手性除草剂2,4-滴丙酸[(r,s)-dcpp]和2-甲基-4-氯苯氧丙酸[(r,s)-mcpp]的外消旋体以及苯氧羧酸类非手性除草剂2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、2-甲基-4-氯苯氧乙酸(mcpa)和2,4-滴丁酯(2,4-db)中的任意一种或多种，进一步优选(r,s)-dcpp和/或(r,s)-mcpp。

有益效果

本发明提供一株能够高效、快速降解苯氧羧酸类手性除草剂(r,s)-dcpp的细菌dcp-6。降解菌株dcp-6具有广泛的降解谱，能降解苯氧羧酸类手性除草剂(r,s)-mcpp的外消旋体和苯氧羧酸类非手性除草剂2,4-d、mcpa和2,4-db等，并能在96小时内完全降解30mg/l的(r,s)-dcpp，具有广泛的应用潜力和价值。使用该细菌生产的降解菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点。适合在农业生产区或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。使用该降解菌剂可以在农作物播种前正常使用化学农药进行杂草防治而保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求。

本发明成功地解决了农业生产中农药残留超标问题，既充分发挥了化学农药在植物病虫害防治中的高效快速的作用，又可以成功治理苯氧羧酸类除草剂残留污染的土壤和水环境，保护生态环境。

附图说明

图1菌株dcp-6的菌落照片(a)和电镜照片(b)

图2菌株dcp-6的16srrna基因系统发育分析

图3菌株dcp-6对(r,s)-dcpp的降解

图4温度对菌株dcp-6降解(r,s)-dcpp的影响

图5初始ph对菌株dcp-6降解(r,s)-dcpp的影响

图6接种量对菌株dcp-6降解(r,s)-dcpp的影响

图7菌株dcp-6底物谱的紫外检测效果图

生物材料保藏信息

dcp-6，分类命名为sphingopyxissp.dcp-6，保藏于中国典型培养物保藏中心,菌种保藏号为cctccno:m20191084，保藏日期为2019年12月23日，保藏地址为湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心。

具体实施方式

实施例1、菌株的分离与鉴定

本发明提供一种能高效降解手性除草剂(r,s)-dcpp两种手性异构体的菌株及其生产的菌剂，所用菌株为革兰氏染色阴性菌株dcp-6，分离自江苏南京某废弃农药厂厂区的土壤中。

菌株具体的分离筛选方法为：

取土样10.0g加入到100ml含有30mg/l(r,s)-dcpp的液体无机盐培养基(以下简称msm),30℃、180rpm摇床培养7d，以15％接种量(v/v)转接至新鲜的相同培养基中，连续富集传代培养四次。利用紫外分光光度计在200-350nm范围内扫描，检测第五代富集液的降解效果。将有效果富集液在含有30mg/l(r,s)-dcpp的无机盐固体培养基上稀释涂布，30℃培养5d，挑取平板上的单菌落于3ml液体lb试管培养基中，然后保存并转接至20ml含有30mg/l(r,s)-dcpp的msm培养基中，30℃培养5d。然后加入25％的盐酸，调节ph至3.0左右，随后用等体积的二氯甲烷进行萃取，紫外分光光度计检测效果，从而获得(r,s)-dcpp降解菌株。

2019年12月23日寄存于中国典型培养物保藏中心,菌种保藏号为cctccno:m20191084，经鉴定属于sphingopyxissp.。主要生物学特性为g^－，菌体为杆状，大小约0.5μm宽,1.4μm长，无鞭毛(图1b)，好氧；过氧化氢酶、氧化酶和v.p.反应为阳性；吲哚反应阴性；不能水解淀粉，使石蕊牛乳酸凝固。将菌株dcp-6的16srrna基因序列(seqidno.1)在数据库ezbiocloud中比对分析，结果显示菌株dcp-6与sphingopyxis属亲缘关系最近，其中与sphingopyxistaejonensisjss54^t的16srrna序列一致性高达98.72％，与sphingopyxislindanitoleransws5a3p^t的16srrna序列一致性98.65％。结合菌株的菌落形态特征、生理生化特性以及16srrna基因比对分析。最终将菌株dcp-6初步鉴定为sphingopyxis属(图2)。

实施例2、实验室降解实验

2.1种子液制备

将菌株dcp-6接入100mllb培养基中，30℃、180rpm摇床培养，48h后6,000rpm离心收集菌体，使用灭菌的msm洗涤菌体两次，最后用10ml灭菌的msm重悬，作为种子液备用。

2.2菌株dcp-6对手性除草剂(r,s)-dcpp的降解

将菌株dcp-6按5％的接种量接至含有30mg/l(r,s)-dcpp的100mlmsm中，30℃、180rpm摇床培养，每隔12小时取样3ml，取至第4天。检测(r,s)-dcpp残留量，计算降解率，绘制菌株dcp-6对手性除草剂(r,s)-dcpp的时间-降解曲线。如图3，菌株dcp-6能在96h内完全降解30mg/l的(r,s)-dcpp。

高效液相色谱法检测手性除草剂(r,s)-dcpp：取3ml待测样品，加入25％的盐酸将样品ph调至3.0左右，然后加入等体积的二氯甲烷进行萃取，漩涡震荡2min后静置。待水相与有机相呈现明显分层，去除上层水相，并向下层有机相中加入过量无水硫酸钠以彻底除去残余水分。然后吸取2ml处理完毕的有机相到离心管中并将其放置于通风橱，直至二氯甲烷挥发完全，随后向离心管中加入350μl甲醇，震荡混匀，用直径为0.22μm的有机相滤器过滤后在液相色谱仪上检测。液相色谱检测条件：仪器，shimadzulc-20a(shimadzucorporation)；手性色谱柱，superchirals-as(chiralwaybiotechco.,ltd.),0.46cmi.d.*15cmlength,5μm；柱温设定为25℃；流动相，正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝96:04:0.05(v/v/v)，流速设定为0.8ml/min；紫外检测器检测波长，220nm和235nm；进样量，6μl。根据标曲的锋面积计算含量。

2.3温度对菌株dcp-6降解(r,s)-dcpp的影响

在添加(r,s)-dcpp终浓度为30mg/l的msm培养基中，按5％接种量接入菌株dcp-6的种子液，分别于4、16、25、30、35、37和45℃条件下，180rpm摇床培养，3d后取样检测(r,s)-dcpp的残留量，计算降解率，确定温度对菌株dcp-6降解(r,s)-dcpp的影响。图4所示，菌株dcp-6在30℃时对(r,s)-dcpp的降解率最高。

2.4初始ph对菌株dcp-6降解(r,s)-dcpp的影响

在初始ph分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的msm培养基中，加入30mg/l的(r,s)-dcpp，按5％接种量接入菌株dcp-6的种子液，于30℃、180rpm摇床培养，3d后取样检测(r,s)-dcpp的残留量，计算降解率，确定ph对菌株dcp-6降解(r,s)-dcpp的影响。以不接种降解菌株的为对照。由图5所示，菌株dcp-6在ph7.0时对(r,s)-dcpp的降解效果最好；在ph6.0-8.0的范围内均能较好的降解(r,s)-dcpp；而当ph小于5.0和ph大于9.0时，其降解能力明显下降。

2.5接种量对菌株dcp-6降解(r,s)-dcpp的影响

按1％、3％、5％、8％、10％与12％的接种量分别接入含30mg/l(r,s)-dcpp的msm培养基中，30℃、180rpm摇床培养，48h时测定一次(r,s)-dcpp的含量。由图6所示，接种量的大小对(r,s)-dcpp的降解效率有直接的关系，接种量越大，(r,s)-dcpp的降解效率就越高。

2.6菌株dcp-6的底物谱

按5％接种至分别含30mg/l不同底物[(r,s)-dcpp、(r,s)-mcpp、2,4-d、mcpa、2,4-db、2,4,5-t]的msm培养基中，于30℃、180rpm摇床培养5d后，紫外分光光度计检测不同底物的降解情况(图7)。结果显示菌株dcp-6可以降解(r,s)-dcpp、(r,s)-mcpp、2,4-d、mcpa和2,4-db。

实施例3菌剂制备

将本发明的手性除草剂(r,s)-dcpp降解菌株dcp-6的原种在试管斜面上活化，并测定降解性能，然后接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mllb培养基(lb培养基配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，水1l，ph7.4)的1000ml摇瓶中，恒温振荡培养至对数期，准备接种一级种子罐。一级种子罐50l，投料量40l，培养基配方为：葡萄糖8g/l，酵母膏5g/l，k2hpo41g/l，nacl5g/l，caco32g/l，mgso40.2g/l，大豆油0.1％(v/v)，ph值7.2-7.5。

投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入50l一级种子罐，培养至对数生长期(约98小时)，搅拌速度为220rpm，无菌空气通入量为1：0.8。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入二级种子罐。二级种子罐500l，投料量400l，培养基配方和培养条件与一级种子罐一致。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至30℃，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在30-35℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1：1.0，搅拌速度为240rpm，整个工艺流程培养时间为100小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。

发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

实施例4、土壤降解实验

采取菜园土作为供试土样。将土样过2mm筛，分别取一定量的(r,s)-dcpp、(r,s)-mcpp和2,4-d粉剂溶于10ml甲醇中，然后浸泡硅藻土，使农药被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中吹干，将其拌入土壤中，使土壤中农药的浓度约为50mg/kg。每一种土样各取500g于30℃恒温培养箱中培养，按10％的接种量接入dcp-6种子液，以不接菌的作为对照，土壤的持水量保持在60％。培养7天后，每种处理每次取3个样品，每个样重20g。样品用等体积的提取液(甲醇：水：乙酸＝49：49：2)，放于机械振荡器中振荡2h(30℃,200rpm)。待振荡结束，转移提取液至50ml离心管中离心10min(6,000rpm)后进行过滤。将提取液减少为15ml重复上述步骤两次。合并过滤液，用浓hcl调节ph为3.0。用二氯甲烷为萃取剂萃取3次(取下层液体)，萃取液体积分别为30ml、15ml、15ml。合并萃取液至旋转蒸发浓缩仪中浓缩后氮吹至干。用lml甲醇定容，过0.22μm的有机相微孔滤膜，然后hplc检测，测定三种化合物的残留量。

从表1可以得出，经过7天培养，菌株dcp-6对(r,s)-dcpp、(r,s)-mcpp和2,4-d的降解率分别达到89.6％、87.5％和85.6％。以上结果说明，菌株dcp-6在施入土壤中后，没有出现不降解或降解效率急剧下降的现象，其降解性能稳定，这就为菌株dcp-6对(r,s)-dcpp、(r,s)-mcpp和2,4-d污染土壤的修复提供了科学依据。

表1菌株dcp-6在土壤中对相关农药的降解

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种能同时降解手性除草剂2,4-滴丙酸两种异构体的降解菌株及其生产的菌剂

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1450

<212>dna

<213>sphingopyxissp.

<400>1

agagtttgatcctggctcagaacgaacgctggcggcatgcctaacacatgcaagtcgaac60

gaagtcttcggacttagtggcgcacgggtgcgtaacgcgtgggaatctgcccttgggtac120

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