一种细菌检测试剂盒及其应用的制作方法

本申请涉及细菌检测领域，具体地涉及一种细菌检测试剂盒及其应用。

背景技术：

临床的样本来源多样，如组织液、血液、脑脊液、胸腹水、尿液、痰液等。每年因临床样本基质复杂、病原体种类复杂、致病菌含量低等给带来的细菌快速检测困难，导致漏诊，治疗不及时造成患者预后不良。对细菌的检测大多数都是通过增殖培养的方式来提高检测灵敏度，但由于有些细菌很难培养，且培养过程中容易导致二次污染，而且非常耗时(24-48h)，大大降低了检测结果的时效性，甚至错过了最佳治疗的时期。虽然使用分子生物学的方法能够较快速的检测标本中致病菌细菌的dna，但是此方法仍然存在一定的假阴性或假阳性结果干扰诊断。已有的磁珠检测试剂盒成本高，操作不方便，未能广泛的应用于临床。

技术实现要素：

以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。

针对这些问题，为了解决现有的特殊条件下特殊处理改良磁珠提高其吸附效率的问题。本申请通过将磁珠和样品分别用平衡液处理，然后混合用于富集细菌，富集后无论是荧光染色观察还是直接培养，沉淀菌量都比上清提高。

具体地，本申请提供一种细菌检测试剂盒，包括磁珠和平衡液，所述平衡液包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖和麦芽糖，所述磁珠与所述平衡液的比例为50mg-100mg:1ml。

在本申请中，所述磁珠可以为fe3o4纳米磁珠；

所述fe3o4纳米磁珠可以为裸磁珠，或为表面经过硅烷基改性、油酸改性、柠檬酸改性或羧基改性的磁珠，优选地为表面经过硅烷基改性、油酸改性、柠檬酸改性或羧基改性的磁珠。

在本申请中，所述平衡液可以包括10％w/v-20％w/v葡萄糖、5％w/v-10％w/v甘露糖、2％w/v-5％w/v半乳糖和2％w/v-5％w/v麦芽糖。w/v指的是质量体积比，例如，10％指的是10g溶质溶于100ml溶剂里。

在本申请中，所述平衡液可以包括15％w/v-20％w/v葡萄糖、8％w/v-10％w/v甘露糖、4％w/v-5％w/v半乳糖和4％w/v-5％w/v麦芽糖。

在本申请中，所述平衡液还可以包括组胺、鞘氨醇、定菌磷、苯并噻唑、咪唑丙烯酸和谷氨酰胺。

在本申请中，所述平衡液还包括2.5％w/v-5％w/v交联剂；

所述交联剂可以选自糊精、乙烯基三乙氧基硅烷、硼酸和对甲苯磺酸中的任一种或更多种。

在本申请中，溶剂为0.9％医用生理盐水，尽量维持细胞稳定的形态，利于样本的储存。

在本申请中，所述细菌可以选自金黄色葡萄球菌、链球菌、破伤风芽孢杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和伤寒杆菌中的任一种或更多种。

本申请还提供一种富集细菌的方法，所述方法包括：

(1)将磁珠和样品分别用平衡液处理；

(2)将处理后的磁珠与处理后的样品混合，静置；

(3)将步骤(3)获得的混合物放置于磁场中，弃去上清液，收集磁珠沉淀，

其中，步骤(1)中的磁珠和平衡液为前述细菌检测试剂盒中的磁珠和平衡液。

在本申请中，收集磁珠沉淀后进行镜检、荧光染色、pcr检测、maldi-tof(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flight(maldi-tof)massspectrometry)质谱检测或直接培养。

在本申请中，可以将所述磁珠与所述平衡液按50mg-100mg:1ml的比例混合；

所述样品和所述平衡液按体积比10-50:1混合；

按200-2000:1的体积比，在处理后的样品中加入处理后的磁珠。

在本申请中，可以在4℃-40℃，优选地25℃下，在所处磁场中静置5-10分钟。

本申请还提供所述细菌检测试剂盒在组织液、血液、脑脊液、胸腹水、尿液或痰液中的细菌富集检测中的应用。

该方法具有以下优点：容易广泛高效的吸附临床样本中的革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，如金黄色葡萄球菌，链球菌，破伤风芽孢杆菌，大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，伤寒杆菌等；磁珠与平衡液混合后，即达到了磁珠的改良，快速，方便，成本低；富集效果明显；避免了反复离心，保证生物安全。

相比于现有技术，本申请所有操作均在常温下进行；磁珠的改良处理一步完成，操作简单方便；该方法适用于大部分的细菌，有普遍性；该方法适用于不同ph范围内的样本检测；可以避免离心操作，当临床样本量较大时，在离心机中高速离心，有可能造成标本的漏出，或离心管破裂导致样本漏出在离心机中，造成对生物安全的危害，导致这些标本有可能污染离心机，污染其它标本以及造成实验人员的感染。

本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本申请技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。

图1是金黄色葡萄球菌富集前后的培养结果。

图2是大肠杆菌富集前后的培养结果。

图3是采用对比例方法进行检测的结果。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合附图对本申请的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

实施例

实施例1

一次性尿液采样器，取含有金黄色葡萄球菌的尿液样本后，2小时内送到检验人员处。溶剂为0.9％医用生理盐水。

检测流程

1)取50mg的磁珠(购自厦门普睿迈格生物科技有限公司)溶于1ml的平衡液(包含0.20g葡萄糖，0.10g甘露糖，0.05g半乳糖和0.05g麦芽糖，组胺、鞘氨醇、定菌磷、苯并噻唑、咪唑丙烯酸、谷氨酰胺各0.0005g，0.05g糊精)中混合均匀；

2)取30ml尿液标本放置于50ml离心管内，加入3ml平衡液(包含0.60g葡萄糖，0.30g甘露糖，0.15g半乳糖和0.15g麦芽糖，组胺、鞘氨醇、定菌磷、苯并噻唑、咪唑丙烯酸、谷氨酰胺各0.0015g，0.15g糊精)混合均匀；

3)将步骤2)中获得的混合液及与步骤1)中获得的磁珠按体积比1500:1混合，静置10min；

4)将步骤3)获得的混合液置于磁场中，静置5min。弃上清，吸取100μl的沉淀涂板，置于37℃孵箱中进行培养，16h后观察菌落情况。

实施例2

一次性尿液采样器，取含有大肠杆菌的尿液样本后，2小时内送到检验人员处。溶剂为0.9％医用生理盐水。

检测流程

1)取50mg的磁珠溶于1ml的平衡液(包含0.20g葡萄糖，0.10g甘露糖，0.05g半乳糖和0.05g麦芽糖，组胺、鞘氨醇、定菌磷、苯并噻唑、咪唑丙烯酸、谷氨酰胺各0.0005g，0.05g糊精)中混合均匀；

2)取30ml尿液标本放置与50ml离心管内，加入3ml平衡液(包含0.60g葡萄糖，0.30g甘露糖，0.15g半乳糖和0.15g麦芽糖，组胺、鞘氨醇、定菌磷、苯并噻唑、咪唑丙烯酸、谷氨酰胺各0.0015g，0.15g糊精)混合均匀；

3)将步骤2)中获得的混合液及与步骤1)中获得的磁珠按体积比1500:1混合，静置10min；

4)将步骤3)获得的混合液置于磁场中，静置5min。弃上清，吸取100μl的沉淀涂板，置于37℃孵箱中进行培养，16h后观察菌落情况。

从图1可以看出，磁珠富集前的标本进行培养，培养基中金黄色葡萄球菌菌落非常稀少。而磁珠富集后进行培养，培养基中菌落明显增加。

从图2可以看出，磁珠富集前的标本进行培养，培养基中大肠杆菌菌落非常稀少。而磁珠富集后进行培养，培养基中菌落明显增加。

实施例3

稳定性测试

1)热稳定性测试

将实施例1中的平衡液和平衡液处理后的磁珠置于40℃避光水浴3天，肉眼未发现分层，镜下无无晶体析出，再按实施例1的操作步骤进行试验，发现富集效果没有减弱。

2)冷稳定性测试

将实施例1中的平衡液和平衡液处理后的磁珠置于-20℃冰箱避光1月，期间反复冻融数次，取出，肉眼未发现分层，镜下无晶体析出，再按实施例1的操作步骤进行试验，发现富集效果没有减弱。

3)常温稳定性测试

将实施例1中的平衡液和平衡液处理后的磁珠置于常温避光1个月，肉眼未发现分层，镜下无晶体析出，再按实施例1的操作步骤作进行试验，发现富集效果没有减弱。

4)酸碱稳定性测试

按实施例1操作步骤，对用生理盐水调节成2-10的ph值的样本加入金黄色葡萄球菌，然后用磁珠进行富集检测，发现富集效果没有变化。

对比例

目前检测标本中细菌有直接涂片染色后镜检或者培养。步骤如下：1.将1ml-30ml临床标本，如尿液、血液等放入离心管中；2.将离心管放置于离心机中，3000r/min，离心10分钟；3.弃去上清；4.吸取10μl-20μl沉淀涂片，革兰氏染色后使用显微镜进行观察；5.吸取100μl沉淀涂板，置于37℃孵箱中进行培养，16h-48h后观察菌落情况。或者不用离心，直接将吸取标本进行革兰氏染色镜检或者接种于培养基上，但是由于标本量大，菌量小，导致镜检或培养呈阴性结果。如图3所示，使用这种方法培养的菌落数明显比磁珠富集后少。

目前在现有技术中用fe3o4纳米磁珠富集细菌。主要原理是通过包裹fe3o4纳米磁珠实现磁珠改良，例如，磁珠表面包裹lgg或者多肽，使其更好的吸附细菌。然后在磁力的作用下，结合有细菌的磁珠聚集沉淀，达到了从液体中浓缩富集细菌的效果。方法步骤主要为：将改良后的磁珠加入到临床样本中，混匀后静置。将加入磁珠的样本管置于磁场中，待磁珠在管底聚集后，弃掉上清，磁珠沉淀用于后续的检测。

然而该方法存在以下主要问题：磁珠改良的操作复杂；磁珠改良的成本高；改良磁珠富集细菌所需的条件较高，例如一定的温度，ph值等；富集菌种较单一。

本申请的方法：容易广泛高效的吸附临床样本中的革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，如金黄色葡萄球菌，链球菌，破伤风芽孢杆菌，大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，伤寒杆菌等；在常温下进行；磁珠与平衡液混合后，即达到了磁珠的改良，快速，方便，成本低；富集效果明显；避免了反复离心，保证生物安全；适用于大部分的细菌，有普遍性；避免离心操作。

虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。