一种丝状真菌外泌体提取方法及其应用与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种丝状真菌外泌体提取方法及其应用。

背景技术：

外泌体(exosomes)是一种细胞分泌的微小膜泡，具有30-200nm大小、极低密度的细胞外纳米级囊状结构，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。它通过其膜上运载的蛋白质、rna、脂类等信号分子，以及膜内包裹的内含物(神经递质、蛋白、激素和细胞因子等)在细胞间通讯和机体调控中发挥至关重要的作用。近年来，外泌体凭借其大小及双分子膜等优势在参与细胞间通讯、疾病诊断、疾病治疗等方面发挥重要作用。几乎所有的细胞都可以产生外泌体，不同细胞来源的外泌体中既包含与细胞形成、结构和物质转运相关的共有成分，也包含与来源细胞的生物功能相关的特异分子。外泌体作为一种细胞间交流、传递生物功能分子的重要方式日益受到重视。

丝状真菌因在人体健康、生物医药、工业发酵、农业生产以及环境保护等方面具有独特的作用，发挥了日益重要的角色。对人类有致病性的真菌约有300多个种类，能引起浅表真菌病、皮肤真菌病、皮下组织真菌病和系统性真菌病等多种感染性疾病。许多丝状真菌产生临床需要的抗生素、抗肿瘤药物、降脂药物与免疫调剂等药物，是治疗多种人类疾病的重要手段；丝状真菌通过工业发酵产生人类广泛使用的生物活性物质、工业用酶与功能蛋白的重要来源。在农业生产和环境保护领域，丝状真菌对许多重要经济作物种植和动物养殖影响巨大，是许多动植物的致病菌之一；作为生态环境中普遍存在的生物种群，丝状真菌可以分解消耗大部分有机物质，对生态系统的物质能量循环具有重要作用。除此之外，丝状真菌在其他方面也深刻得影响着我们的生活。例如，建筑物腐蚀、水质污染等多数都和真菌有关。

目前，对丝状真菌外泌体的研究和开发目前处于空白领域。丝状真菌外泌体将会在真菌感染性疾病的诊断、抗真菌药物靶点及其药物开发、工业发酵真菌调控、植物保护与动物保健等领域具有潜在应用价值。本研究将提供一种通用的丝状真菌外泌体的制备方法，并且证明了其在植物线虫病害的生物防治领域的应用。

植物寄生线虫会引起植物病害，是植物主要病原之一。在我国，根结线虫、松材线虫和包囊线虫是主要植物寄生线虫病害，导致作物大量的减产，严重限制了我国农林业的发展。而丝状真菌少孢节丛孢菌(arthrobotrysoligospora)是一类捕食线虫真菌，属于子囊菌门，在普通环境中营腐生生活，但是当在周围环境中存在线虫时该丝状真菌通过营养菌丝体特化形成三维菌网来捕食线虫。

当前，对线虫的防治主要依靠化学杀虫剂，在短时间内能起到杀线虫效果，但长期使用化学杀虫剂会造成环境污染，同时杀虫剂残留会进一步影响到动植物，甚至是人类自身健康。近年来，生物防治线虫得到了各国政府的重视，从不污染环境、经济实惠目标着手开展了各项试验项目，众多的研究结果证明，利用线虫的自然天敌-捕食线虫性真菌进行生物防治是防控线虫的一种安全有效的方法。丝状真菌少孢节丛孢菌(arthrobotrysoligospora)的外泌体将在生物防治线虫中起到关键作用，是一类新型的线虫生物防治制剂。

因此，发明一种丝状真菌外泌体提取方法及其应用来解决上述问题很有必要。

技术实现要素：

本发明结合现有提取外泌体的技术，从节约成本、省时、高纯度等方面出发综合优化，提供了一种快速提取丝状真菌少孢节丛孢菌(arthrobotrysoligospora)外泌体的方法；同时证明了其在植物线虫病害的生物防治领域的应用。具体内容如下。

1.含外泌体发酵液的获得

200×氨基酸：2g赖氨酸(lys)，2g缬氨酸(val)，2g苯丙氨酸(phe)，1g脯氨酸(pro)，1g甘氨酸(gly)，1g丙氨酸(ala)，0.1g精氨酸(arg)，0.1g半胱氨酸(cys)，0.1g亮氨酸(leu)，0.1g组氨酸(his)，0.1g甲硫氨酸(met)，0.1g酪氨酸(tyr)，0.1g谷氨酸(glu)，溶于ddh2o中，定容至100ml，0.22μm水系滤器过滤除菌，存于4℃。

lnaam培养基组成：

将cma固体培养基上生长7d的少孢节丛孢菌孢子使用无菌水洗下使用4层无菌擦镜纸过滤，然后将滤液加入含双抗(1％青霉素/链霉素)的无菌lnnam培养基中，160rpm、28℃摇床中发酵7d。

2.含外泌体发酵液预处理

将上述发酵液进行去除菌丝处理，然后进行高速离心处理，保留上清液。

3.含外泌体发酵液浓缩

将上述离心上清液用100kd超滤离心管进行超滤浓缩，然后使用适量pbs溶液清洗浓缩液三次。

4.外泌体纯化

将上述粗外泌体使用外泌体纯化柱进行纯化，得外泌体纯化液；然后将纯化液使用0.22μm过滤器进行过滤除菌处理，即得到目标外泌体。

5.外泌体表征

对外泌体的总蛋白含量和rna含量进行测定，分别为393μg/ml和23.6ng/ml。将获得的外泌体使用高分辨透射电镜观察其形态(图1)，使用粒径分析仪检测其分子大小(图2)。

6.抑制线虫效应

分别在20℃、28℃与37℃下将真菌外泌体对线虫作用1h，每组三个平行重复。发现在20℃或28℃下，真菌外泌体对线虫运动具有极其显著的抑制作用。与pbs对照组比较，其头部摆动频率(图3a)和身体弯曲频率(图3b)显著减弱。

本发明的有益效果是：

(1)本发明通过提取丝状真菌外泌体，用于对生物防治线虫，从而有效的利用丝状真菌外泌体对线虫形成天敌般的克制效果，有效的起到生物防治防控线虫的有效方法，并且其不会导致环境污染和经济实惠。

附图说明

图1是本发明外泌体透射电镜图(标尺为200nm)；

图2是本发明外泌体粒径分析仪测量结果图(平均粒径为125nm)；

图3是真菌外泌体对线虫运动具有明显的抑制作用。与pbs对照组比较，真菌外泌体显著抑制线虫头部摆动频率(a)和线虫身体弯曲频率(b)。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：以少孢节丛孢菌为出发材料，制备真菌外泌体：

将cma固体培养基上生长7d的少孢节丛孢菌孢子使用无菌水洗下使用4层无菌擦镜纸过滤，然后将滤液加入含双抗(1％青霉素/链霉素)的无菌lnnam培养基中，160rpm、28℃摇床中发酵7d。将发酵液进行去除菌丝处理，然后进行高速离心处理，保留上清液。离心上清液用100kd超滤离心管进行超滤浓缩，然后使用适量pbs溶液清洗浓缩液三次。粗外泌体使用外泌体纯化柱进行纯化，得外泌体纯化液。然后将纯化液使用0.22μm过滤器进行过滤除菌处理，即得到目标外泌体。

实施例2：真菌外泌体的表征：

首先将收集好的外泌体使用酶标仪进行总蛋白与总rna测定，然后使用高分辨透射电镜观察其形态，使用粒径分析仪测定其粒径。

高分辨透射电镜观察外泌体形态的步骤为：首先将收集好的外泌体取15μl于1.5mlep管中，加入15μlpbs进行稀释，然后将30μl样品全部加入到铜网上，静置1min。用滤纸轻轻吸干铜网上的液体后，滴加同体积的醋酸双氧铀，在冰上静置10min，然后放置白炽灯下照干，最后使用透射电镜在80-120kv电压下观察其形态。

粒径分析仪测定外泌体粒径的步骤为：首先将粒径分析仪开机预热30min，用双蒸水清洗比色皿，用滤纸将水吸干，然后将稀释到适量体积的外泌体倒入比色皿中，放入仪器进行粒径测定。

实施例3：少孢节丛孢菌外泌体对线虫运动的抑制：

取90ul外泌体加m9buffer现洗的同期化l4期线虫10ul(大概8-10条线虫)，对照组取90ulpbs加10ul同期化线虫，置于20℃、28℃以及37℃培养箱中孵育1h，每组平行三个样品。然后吸取至无e.coliop50的ngm平板上，再静置30min，最后计量各线虫1min内头部摆动频率与身体弯曲频率。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。