一类新的化合物及其用途的制作方法

1.本发明涉及一类新的化合物及其用途，还涉及该类化合物在制备抗病毒药物等方面的应用。


背景技术：

2.人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus；abbr:hiv)，即艾滋病(aids，获得性免疫缺陷综合征)病毒，是造成人类免疫系统缺陷的一种病毒。1981年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒(lentivirus)，属逆转录病毒的一种。
3.hiv通过破坏人体的t淋巴细胞，进而阻断细胞免疫和体液免疫过程，导致免疫系统瘫痪，从而致使各种疾病在人体内蔓延，最终导致艾滋病。由于hiv的变异极其迅速，难以生产特异性疫苗，至今无有效治疗方法，对人类健康造成极大威胁。
4.hbv(乙型肝炎病毒)简称乙肝病毒。是一种dna病毒，属于嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)。根据目前所知，hbv就只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病。完整的乙肝病毒成颗粒状，也会被称为丹娜颗粒(dane)。1965年由丹娜发现。直径为42纳米。颗粒分为外壳和核心两部分。
5.我国的乙肝病毒感染率约60％-70％；乙肝表面抗原携带率约占总人口的7.18％，以此计算，全国约有9300万人携带乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。
6.hiv-1和hbv药物的研发一直以来都是药物研发的重点和热点之一。
7.副黏病毒科家族的副黏病毒属是造成许多流行性人和动物疾病的阴性、单链rna病毒。这些病毒包括至少两个主要亚科，即副黏病毒亚科和肺病毒亚科。亚科副黏病毒亚科包括人副流感病毒(hpiv)、麻疹病毒和腮腺炎病毒。虽然，疫苗可用于防止麻疹和腮腺炎感染，但在2001年这些感染造成745，00人死亡，所以对于易感人群，将期望另外的治疗。hpiv是较年轻的孩子中的下呼吸道感染的第二最普遍的原因且总共造成约75％的义膜性喉炎(croup)病例。hpiv可以在整个生命中造成重复感染，包括上呼吸道疾病和甚至严重的下呼吸道疾病(例如，肺炎、支气管炎和细支气管炎)，后者在老年人中和在免疫系统受损的患者中是尤其值得关注的。因此，对抗副黏病毒亚科疗法存在需求。
8.亚科肺病毒亚科包括人呼吸道合胞病毒(hrsv)。几乎所有的孩子在他们第二岁时将患上hrsv感染。hrsv是婴儿期和童年期中下呼吸道感染的主要原因，且被感染的那些人中的0.5％至2％需要住院治疗。患有慢性心脏病、肺病的老年人和成年人或被免疫抑制的那些人还具有发展严重的hrsv疾病的高风险。目前不能得到防止hrsv感染的疫苗。单克隆抗体帕利珠单抗可用于处于高风险的婴儿，例如，早产儿或患有心脏病或肺病的那些，但一般使用的成本常常令人不敢问津。利巴韦林还已经用于治疗hrsv感染但具有有限的效力。因此，通常对抗肺病毒亚科疗法和抗副黏病毒科疗法存在需求。
9.人类冠状病毒最早是在20世纪60年代中期发现的，它们是在他们生活中的某个时间感染大多数人的普通病毒，通常会导致轻度到中度的上呼吸道和胃肠道疾病。称为“中东
呼吸综合症冠状病毒”(mers-cov或mers)的新型冠状病毒于2012年在沙特阿拉伯首次报道，并已蔓延至其他几个国家。严重急性呼吸系统综合症(sars)的冠状病毒sars-cov于2002年首次在中国得到确认，并导致2002年和2003年全球爆发。
10.2019年12月，在中国中部有1100万人口的城市武汉，出现了一种由先前未知的病原体引起的新型肺炎。这些最初的病例与武汉市的一家海鲜市场的暴露有关。截至2020年2月12日，中国报道了59901例确诊病例，包括1368例死亡，总体死亡风险约为2％。此外，在中国香港、中国澳门和中国台湾也发现了51例、10例、18例确诊病例。在日本、新加坡、泰国、韩国、美国、越南、尼泊尔、法国、澳大利亚、加拿大等24个国家共发现了492例确诊病例。这种病原体很快被鉴定为一种新型冠状病毒2019-ncov(covid-19)，与严重急性呼吸综合征(sars)冠状病毒(sars-cov)存在密切的亲缘关系。目前，尚无针对这种新病毒的特异性治疗方法。因此，迫切需要找到有效的抗病毒药物来对抗这种疾病。


技术实现要素：

11.本发明的发明人在研制新的hiv-1和hbv抗病毒药物的过程中，意外地发现一类新化合物，该类化合物出人意料地具有优异的抗hiv-1和hbv病毒活性，同时对副黏病毒、冠状病毒也有着出乎意料的疗效。
12.为了完成本发明的目的，本发明提供一类新的化合物及其用途，经过药理实验发现，该类新化合物在抗病毒药理实验中，效果显著。现有技术中未见对该类化合物的报道。该类新的化合物及其立体异构体，药学上可接受的盐和/或水合物、溶剂合物或晶型，其特征在于，其结构通式为m1：
13.通式m1：
[0014][0015]
r0为h、
[0016]
r1为h、卤素；
[0017]
r2、r3各自分别为h、卤素、nr
10
r
11
、zr
10
；
[0018]
r
10
、r
11
、r
12
、r
13
各自分别为ra；
[0019]
ra为(ch2)my(ch2)nch3；
[0020]
r
a1
、r
a2
各自分别为卤素、z1r、r；
[0021]
或者r
a1
、r
a2
相交形成c
3-7
环烷基或含有选自n、o、s的c
3-7
杂环基；
[0022]
r
a3
为r；
[0023]
r为h、c
1-8
烷基、c
1-8
取代烷基、c
3-8
环烷基、c
3-8
取代环烷基、c
3-8
杂环基、c
3-8
取代杂
环基、c
2-8
烯基、c
2-8
取代烯基、c
2-8
炔基、c
2-8
取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基；
[0024]
或者r
10
、r
11
相交形成
[0025]
m1、m3、m4各自分别为0、1；
[0026]
m2为0、1、2、3、4、5、6、7、8；
[0027]
m5为0、1、2、3；
[0028]
r
14
为芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基；
[0029]
r4为卤素、n3、cn、c
1-8
烷基、c
1-8
取代烷基、c
3-8
环烷基、c
3-8
取代环烷基、c
3-8
杂环基、c
3-8
取代杂环基、c
2-8
烯基、c
2-8
取代烯基、c
2-8
炔基、c
2-8
取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基；
[0030]
r5为h；
[0031]
r6、r7、r9各自分别为ra、卤素、cn、n3；
[0032]
或者r6、r7、r9中的任两个相交形成含有c
3-7
环烷基或c
3-7
杂环基；
[0033]
或者r
10
、与r6、r7、r9中的任一个相交形成
[0034]
r8为h、卤素；
[0035]
m为1-10的整数；
[0036]
n为10-24的整数；
[0037]
x、z、z1、y、x1、x2、x3、x4、x5各自分别为o、s、nr；
[0038]
rx为卤素、nr
10
r
11
、xr
10
。
[0039]
通过优化，可以优化为以下的化合物，或其立体异构体，药学上可接受的盐和/或水合物、溶剂合物或晶型，其特征在于，其结构通式为下述通式m2、m3：
[0040]
通式m2、m3：
[0041][0042]
r1为h、卤素；
[0043]
r
10
、r
11
各自分别为ra；
[0044]
ra为(ch2)my(ch2)nch3；
[0045]
r
a1
、r
a2
各自分别为卤素、z1r、r；
[0046]
或者r
a1
、r
a2
相交形成c
3-7
环烷基或含有选自n、o、s的c
3-7
杂环基；
[0047]
r
a3
为r；
[0048]
r为h、c
1-8
烷基、c
1-8
取代烷基、c
3-8
环烷基、c
3-8
取代环烷基、c
3-8
杂环基、c
3-8
取代杂环基、c
2-8
烯基、c
2-8
取代烯基、c
2-8
炔基、c
2-8
取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基；
[0049]
或者r
10
、r
11
相交形成
[0050]
m1、m3、m4各自分别为0、1；
[0051]
m2为0、1、2、3、4、5、6、7、8；
[0052]
m5为0、1、2、3；
[0053]
r
14
为芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基；
[0054]
m为1-10的整数；
[0055]
n为10-24的整数；
[0056]
x、z、z1、y、x1、x2、x3、x4、x5各自分别为o、s、nr；
[0057]
rx为卤素、nr
10
r
11
、xr
10
。
[0058]
进一步优化为下述结构式中的任一种：
[0059]
[0060]
[0061]
[0062][0063]
进一步优化为为下述结构式中的任一种：
[0064]
[0065]
[0066][0067]
该类化合物还包括其同位素化合物。包括并不限于c的同位素为碳12(
12
c)、碳13(
13
c)、碳14(
14
c)，n的同位素为氮14(
14
n)、氮15(
15
n)，o的同位素为氧16(
16
o)、氧17(
17
o)、氧18(
18
o)，h的同位素为h(1h，氕)、d(2h，氘)、t(3h，氚)，磷的同位素为磷31(31p)、磷32(32p)。
[0068]“取代”例如“取代烷基”、“取代芳基”、“取代芳基烷基”，分别意指其中一个或多个氢原子各自独立地被非氢取代基代替的烷基、亚烷基、芳基、芳基烷基、杂环基、碳环基。典型的取代基包括但不限于，-r
c
、＝o、-or
c
、-sr
c
、-nr
c2
、-nr
c
、-cr
c3
、-cn、-ocn、-n3、-no、-no2、-nhc(＝o)r
c
、-oc(＝o)r
c
、-nhc(＝o)nr
c2
，其中每个r
c
独立地是h、烷基、芳基、芳基烷基、杂环。亚烷基、亚烯基和亚炔基还可以被类似地取代。
[0069]
以上本发明各结构通式及结构式的详细描述，不应被认为是对本发明的限制。
[0070]
部分新化合物的制备方法如下：
[0071]
制备方法：
[0072]
化合物c1的制备
[0073][0074]
将乙基丙氨酸酯盐酸盐(3.38g,22mmol)溶解在无水ch2cl2(20ml)中并在n2(g)下在搅拌下将混合物冷却至0℃。加入二氯磷酸苯基酯(3.0ml,20mmol)，随后在10分钟内滴加et3n。然后将反应混合物缓慢地升温至rt并搅拌12小时。加入无水et2o(100ml)，并搅拌混合物30分钟。通过过滤除去形成的固体，并在减压下浓缩滤液。对残留物进行用己烷中的0-50％etoac洗脱的硅胶色谱法，以提供中间体c1(2.10g,38％)。
[0075]1h-nmr(300mhz,cdcl3)δ7.39-7.27(m,5h),4.27(m,3h),1.52(m,3h),1.32(m,3h)。
[0076]
31
p-nmr(121.4mhz,cdcl3)δ8.2,7.8。
[0077]
类似方法制备化合物c2
[0078]
[0079]
类似方法制备化合物c3
[0080][0081]
化合物a2的制备
[0082][0083]
将10.0g a1(23.8mmol)溶于30ml无水dmso中，充氮条件下，加入醋酸酐20ml，室温搅拌48小时，确认反应完全后，反应液倒入500ml冰水中，搅拌20分钟。取水层液，200ml醋酸乙酯萃取3次。合并萃取液，200ml水冲洗3次。醋酸乙酯液加入无水mgso4干燥，蒸干，残渣溶于dcm中，上硅胶柱，25％etoac/己烷洗脱，洗脱液蒸干，得a2，产率：93％。1h-nmr(cd3cn)：δ3.63-3.75(m，2h)，4.27(d，1h)，4.50-4.57(m，3h)，4.65(s，3h)，4.69-4.80(m，2h)，7.25(d，2h)，7.39(m，13h)。
[0084]
化合物a3的制备
[0085][0086]
将7-溴-吡咯并[2，1-f][1，2，4]三嗪-4-基胺:1.0g(4.8mmol)悬浮于20ml无水thf中，充氮条件下，搅拌加入tmscl 1.336ml(10.56mml)，室温搅拌20分钟，冷却至-78℃，缓慢加入12.0ml buli溶液(3.2n在己烷中)，搅拌10分钟，通过注射器加入a2，反应完全后醋酸淬灭，反应液蒸干，残渣溶于200ml二氯甲烷水溶液(二氯甲烷∶水＝1∶1)。取有机层，100ml水冲洗，无水mgso4干燥，蒸干，柱色谱法(0-50％etoac∶己烷)洗脱，得到a3 1∶1的消旋化合物；22％产率。lc/ms(m/z：553，m+h
+
)。消旋化合物拆分，得化合物a3。
[0087]
同理，可以制备a03：
[0088][0089]
化合物a4的制备
[0090][0091]
将0.56ga3(1.02mmol)溶于无水二氯甲烷中，充氮条件下，加入0.70ml三甲基甲硅烷基氰化物，冷却至0℃，搅拌10分钟，加入100ul三氟化硼合乙醚，升温至室温，反应完全后三乙胺淬灭，蒸干，残渣溶于二氯甲烷，上硅胶柱。使用0-75％醋酸乙酯和己烷的梯度，洗脱，得a4，35％产率。1h-nmr(cd3cn)：3.61-3.90(m，2h)，4.09-4.19(m，2h)，4.30-4.88(m，7h)，4.96(d，0.5h)，5.10(d，0.5h)，6.41(bs，2h)，6.73-6.78(m，1h)，6.81-6.88(m，1h)，7.17(m，2h)，7.39(m，13h)，7.86(s，0.5h)，7.93(s，0.5h)。
[0092]
同理，制备a04：
[0093][0094]
化合物a5的制备
[0095][0096]
将化合物a4 1.40mg(0.248mmol)溶于2ml无水二氯甲烷中，充氮条件下，冷却至-78℃。1n三氯化硼溶于1.01ml二氯甲烷中，加入反应容器，搅拌1小时，反应完全后甲醇淬灭，升至室温，蒸干，制备液相纯化得a5；70％总产率。1h-nmr(d2o)：3.65-3.75(dd，2h)，4.12(t，1h)，4.29(q，1h)，4.80(d，1h)，6.97(d，1h)，7.14(d，1h)，7.93(s，1h)。
[0097]
同理，制备a05：
[0098][0099]
化合物a6的合成
[0100][0101]
将a5(45mg,0.15mmol)溶解在无水磷酸三甲酯(0.5ml)中并在n2(g)下在0℃下搅拌溶液。将甲基咪唑(36μl,0.45mmol)加入溶液中。将c3(69mg,0.225mmol)溶解在无水thf
(0.25ml)中并滴加到核苷混合物中。当lcms指示反应完成时，将反应混合物用etoac稀释，并用饱和nahco3水溶液，饱和nacl洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并在减压下浓缩。对残留物进行用ch2cl2中的0-5％meoh洗脱的硅胶色谱法，制备液相制备,得a6(20.9mg,25％)。
[0102]1h-nmr(300mhz,cd3od)δ7.95(m,1h),7.31-6.97(m,7h),4.94(m,1h),4.78(m,1h),4.43(m,3h),4.20(m,1h),3.80(d,1h),1.30-1.18(m,9h)；
[0103]
31
p-nmr(121.4mhz,cd3od)δ3.8。
[0104]
lcms m/z561.0[m+h],559.0[m-h]。
[0105]
同理，制备a7：
[0106][0107]
化合物a8的合成
[0108][0109]
化合物a9的合成
[0110][0111]1h-nmr(300mhz,cd3od)δ7.95(m,1h),7.31-6.97(m,6h),4.94(m,1h),4.78(m,1h),4.43(m,3h),4.20(m,1h),3.80(d,1h),1.30-1.18(m,9h)；
[0112]
31
p-nmr(121.4mhz,cd3od)δ3.8。
[0113]
lcms m/z561.0[m+h],559.0[m-h]。
[0114]
同理：
[0115][0116]
本发明还提供上述新的化合物在制备抗病毒药物中的应用。特别的，该化合物用于制备抗艾滋病病毒、乙肝病毒、副黏病毒、冠状病毒的药物。
[0117]
本化合物对逆转录病毒hiv-1和hbv的活性
具体实施方式
[0118]
下面以实施例的方式对本发明做进一步的详细说明，给出本发明的实施细节，但是不应被认为是对本发明的限制。
[0119]
hiv活性测试
[0120]
将293t细胞按每孔6
×
104的密度加到24孔板上，用dmso溶解待测化合物，并配制不同的浓度，于感染前15分钟加入细胞培养液中，dmso溶剂作空白对照，再加入0.5ml病毒液(根据p24浓度将病毒原液稀释至0.1-0.5ng p24/ml)。感染后48小时，去除上清液，每孔中加入50μl细胞裂解液(promega)裂解细胞，再将20μl细胞裂解产物加入至30μl荧光素酶底物中(promega)，用fb15荧光检测器(sirius)仪器测定细胞荧光素酶的相对活性，以dmso作对照，计算化合物对野生型hiv-1复制的半数抑制浓度。
[0121]
将对数生长期的293t细胞按8000～10000个/孔的细胞密度接种至96孔板中，每孔100ul，37℃，5％co2培养箱中培养24h后，加入待测化合物，并以dmso为空白对照(终浓度为0.1％)，37℃，5％co2培养箱中继续培养44小时。向每孔中加入20μlmts/pms现配的混合液，37℃，5％co2培养箱中继续培养4小时后显色。在酶联检测仪上，波长490nm和650nm处检测各孔的光吸收值(od)，在victor3v1420多标记记数器(perkin elmer)中检测板的突光，应用microsoftexcel和xlfit4.1软件求出cc
50
值。
[0122]
合成化合物的抗hiv活性评价：
[0123]
序号测试化合物ec
50
(nm)cc
50
(nm)1n433.1〉1002n453.3〉1003n463.1〉1004n473.1〉1005n493.0〉1006n513.1〉100
[0124]
实验结果显示，新化合物都有很强的抗hiv活性。
[0125]
抗hbv活性评价：
[0126]
hepg2 2.2.15细胞(sells，pnas，1987andsells，jv，1988)的染色体整合有完整的hbv基因组，并稳定表达病毒rna，cccdna和病毒蛋白质。此外，该细胞还向培养基中分泌成熟的乙肝病毒颗粒。通过qpcr量化病毒粒子dna的方法可以测量病毒的复制。待测化合物用dmso溶解为30mm的储存液并保存在-20℃。在96孔细胞培养板中加入每孔10，000个hepg2 2.2.15细胞，每孔200μl细胞培养基，在37℃，5％co2细胞培养箱中培养3天至细胞长满。弃掉旧的培养基并加入200μl新鲜的检测培养基(5％fbs)。加入100％dmso稀释的化合物1μl：稀释为不同的指定的测试浓度，在co2培养箱中孵育10天，每隔一天(第2，4，6，8，10天)换一次液(5％fbs)，并加入新鲜配制浓度的化合物。在第11天每孔取150μl上清提取病毒dna。细胞毒性检测板也进行类似处理：最高浓度是150μm。病毒基因组dna的提取试剂盒为qiaamp96dna blood kit。经过常规的离心和qpcr过程。用包含hbv基因组的质粒(病毒拷贝数:2*10e6，2*10e5，2*10e4，2*10e3)做标准曲线，并以标准曲线来计算病毒拷贝数。抑制率的计算公式如下：抗病毒的抑制率＝100-(检测值-hpe平均值)/(zpe平均值-hpe平均值)*100(zpe:最低浓度化合物孔平均值，hpe:最高浓度化合物孔平均值)。抑制率数据通过
graphpad prism 5软件处理并绘制曲线，ec
50
和ec
90
通过四参数非线性回归模型计算。细胞毒性％＝100-(检测值/dmso对照孔平均值*100)。细胞毒性％数据通过graphpad prism 5软件处理并绘制曲线，cc
50
通过四参数非线性回归模型计算。
[0127]
化合物的抗hbv活性评价：
[0128]
序号测试化合物ec
50
(nm)cc
50
(nm)1n434.1〉1002n454.6〉1003n464.1〉1004n474.6〉1005n494.4〉1006n514.3〉100
[0129]
实验结果显示，所有的新化合物都有很强的抗hbv活性。
[0130]
在吉利德专利中国专利cn103052631中，对呼吸道合胞病毒(rsv)抗病毒活性和细胞毒性、副流感病毒进行了如下实验：
[0131]
呼吸道合胞病毒(rsv)抗病毒活性和细胞毒性测定
[0132]
抗rsv活性
[0133]
针对rsv的抗病毒活性在hep2细胞中使用体外细胞保护测定来确定。在该测定中，抑制病毒复制的化合物展示针对病毒诱发的细胞致死的细胞保护效应，其可以使用细胞生存力试剂来量化。
[0134]
hep2细胞从atcc(manassas，vi)获得并被维持在补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的mem介质中。使细胞每周传代2次并保持在分汇合阶段。确定rsv菌株a2(advancedbiotechnologies，columbia，md)的商业储备液的效价，然后进行化合物测试以确定在hep2细胞中产生期望的细胞病变效应的病毒储备液的适当稀释度。
[0135]
对于抗病毒测试，在测定之前24小时以3，000细胞/孔的密度将hep2细胞接种入96孔板。在单独的96孔板上，将待测试的化合物在细胞培养基中逐次稀释。对于每种测试化合物，制备以3-倍连续稀释增量的八个浓度，且一式两份地将每个稀释以100μl/孔转移到具有接种的hep2细胞的板上。随后，在细胞培养基中制备先前通过滴定确定的病毒储备液的适当稀释物，并将其以100μl/孔加入到包含细胞和逐次稀释的化合物的测试板中。每个板包括受感染的未经处理的细胞的三个孔和未受感染的细胞的三个孔，分别用作0％和100％病毒抑制对照。在受rsv感染之后，将测试板在组织培养培养箱中温育4天。在温育之后，rsv-诱发的细胞病变效应使用celltiterglo试剂(promega，madison，wi)，随后读出发光来确定。计算相对于0％和100％抑制对照的每个测试浓度的抑制百分数，且每种化合物的ec50值通过非线性回归确定为抑制rsv-诱发的细胞病变效应50％的浓度。
[0136]
细胞毒性
[0137]
测试化合物的细胞毒性在未受感染的hep2细胞中使用细胞生存力试剂以之前对于其它细胞类型所描述的相似方式与抗病毒活性平行确定。与用于确定抗病毒活性的相同方案用于测量化合物细胞毒性，除了细胞没有受rsv感染之外。相反，将不含病毒的新鲜细胞培养基(100μl/孔)加入到含细胞和预稀释化合物的测试板。然后温育细胞4天，随后使用celltiterglo试剂测试细胞生存力并读出发光。未经处理的细胞和用50μg/ml嘌呤霉素
(sigma，st.louis，mo)处理的细胞分别用作100％和0％细胞生存力对照。计算相对于0％和100％对照的每个测试化合物浓度的细胞生存力百分数，且cc50值通过非线性回归确定为减少细胞生存力50％的化合物浓度。
[0138][0139]
rsvrnp制备
[0140]
按照从mason等人(1)改良的方法制备rsv核糖核蛋白(rnp)复合物。将hep-2细胞以7.1x104个细胞/cm2的密度铺在mem+10％胎牛血清(fbs)中，且允许其在37℃(5％co2)下
附着过夜。在附着之后，用35mlmem+2％fbs中的rsva2(moi＝5)感染细胞。在感染后20小时，用补充有2μg/ml放线菌素d的mem+2％fbs代替培养基，并返回到37℃，持续一个小时。然后用pbs洗涤细胞一次，并用35ml的pbs+250μg/ml溶血卵磷脂处理一分钟，此后吸出所有的液体。通过将细胞刮入到1.2ml的缓冲液a[50mm乙酸tris(ph8.0)、100mm乙酸钾、1mmdtt和2μg/ml放线菌素d]中来收获细胞并通过重复经过18号注射针(10次)溶解细胞。将细胞溶解产物放置在冰中10分钟，且然后在4℃下以2400g离心10分钟。除去上清液(s1)，且通过重复经过18号注射针(10次)，在补充有1％tritonx-100的600μl的缓冲液b[10mm乙酸tris(ph8.0)，10mm乙酸钾和1.5mmmgcl2]中破坏沉淀(p1)。将经再悬浮的沉淀放置在冰中10分钟，且然后在4℃下以2400g离心10分钟。除去上清液(s2)，并在补充有0.5％脱氧胆酸和0.1％tween40的600μl的缓冲液b中破坏沉淀(p2)。将经再悬浮的沉淀放置在冰中10分钟，且然后在4℃下以2400g离心10分钟。收集包含富集的rsvrnp复合物的上清液(s3)部分，且通过280nm下的uv吸光度确定蛋白质浓度。在-80℃下储存经等分的rsvrnps3部分。
[0141]
rsvrnp测定
[0142]
转录反应包含在30μl的反应缓冲液[50mmtris-乙酸酯(ph 8.0)、120mm乙酸钾、5％甘油、4.5mmmgcl2、3mmdtt、2mm乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-四乙酸(egta)、50μg/mlbsa、2.5u rnasin(promega)、atp、gtp、utp、ctp和1.5uci[α-32p]ntp(3000ci/mmol)]中的25μg的粗制rsvrnp复合物。用于转录测定的放射标记的核苷酸被选择为匹配正在评价其rsvrnp转录的抑制的核苷酸类似物。加入以其km(atp＝20μm，gtp＝12.5μm，utp＝6μm和ctp＝2μm)的一半的最终浓度的冷的竞争性的ntp。以100μm的最终浓度加入三种剩下的核苷酸。
[0143]
为了确定核苷酸类似物是否抑制rsvrnp转录，使用5倍增量的6步连续稀释加入化合物。在30℃温育90分钟之后，用350μl的qiagenrlt溶菌缓冲液停止rnp反应，且使用qiagenrneasy96试剂盒纯化rna。将纯化的rna在rna样品装载缓冲液(sigma)中在65℃下变性10分钟，且在包含2m甲醛的1.2％琼脂糖/mops凝胶中运行。干燥琼脂糖凝胶，并将其暴露于storm磷屏成像筛，且使用storm磷屏成像(phosphorimager)(gehealthcare)显色。通过两个双份的非线性回归分析来计算将总放射标记转录物减少50％的化合物浓度(ic50)。
[0144][0145]
副流感病毒细胞保护测定的描述
[0146]
副流感病毒细胞保护测定使用vero细胞和副流感病毒3菌株c243。简要地说，在测试化合物的存在下混合病毒和细胞，并温育7天。病毒被预滴定，使得对照孔呈现出由于病毒复制引起的85％至95％的细胞生存力损失。因此，当化合物防止病毒复制时，观察到抗病毒效果或细胞保护。每个测定板包含细胞对照孔(仅细胞)、病毒对照孔(细胞加病毒)、化合物毒性对照孔(仅细胞加化合物)、化合物比色对照孔(仅化合物)以及实验孔(化合物+细胞+病毒)。由mts reagent，promega，madisonwi)染料减少测定细胞保护和化合物细胞毒性。确定并报告病毒细胞病变影响(cpe)的减少％；当在剂量响应中测试化合物时，ic50(抑制50％病毒复制的浓度)、tc50(导致50％细胞死亡的浓度)和计算的ti(治疗指数tc50/ic50)与抗病毒活性和化合物细胞毒性的图形表示一起提供。每个测定包括用作阳性对照的利巴韦林。
[0147]
细胞制备
[0148]
vero细胞补充10％胎牛血清(fbs)、2.0mml谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(dmem)中生长。使用标准细胞培养物技术以1：10的分流比一周两次地继代培养该细胞。使用血球计数仪和台盼蓝排除法进行总细胞数和生
存力百分数测定。对于测定中使用的细胞，细胞生存力必须大于95％。在测定前一天以1x104个细胞/孔的浓度在96孔组织培养板中接种细胞。
[0149]
病毒制备
[0150]
副流感病毒3菌株c243在vero细胞中生长以便产生储备病毒池。对于每次测定，从冰箱(-80℃)移除病毒的预滴定等分部分，并允许在生物学安全柜中将其缓慢地解冻到室温。将病毒再悬浮并稀释到组织培养基中，使得加入到每个孔的病毒的量是被确定为产生感染后6-7天在85％到95％的细胞杀死之间的量。
[0151]
用于细胞生存力的mts染色
[0152]
在测定终止时(感染后7天)，用可溶的基于四唑鎓的染料mts(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2h-四唑鎓；reagent，promega)染色测定板以便确定细胞生存力并量化化合物毒性。由代谢活性细胞的线粒体酶代谢mts以产生可溶的甲臜产物，允许迅速定量分析细胞生存力和化合物细胞毒性。该试剂是不需要在使用之前制备的稳定单一溶液。在测定终止时，将20-25μl的mts试剂加入每个孔，且然后在37℃、5％co2下温育微量滴定板4-6小时以评估细胞生存力。使用粘合剂板密封器代替盖子，经密封的板倒转若干次以混合可溶的甲臜产物，且在490/650nm下按分光光度法用分子装置vmax或spectramaxplus板读数器对该板读数。
[0153]
数据分析
[0154]
使用内部计算机程序，计算细胞病变效应(cpe)减少％、细胞生存力％、ic25、ic50、ic95、tc25、tc50和tc95和其它指标，且显示图形化结果概要。在打印输出中提供带有数据的图形表示的抗病毒活性和毒性两者的原始数据，总结了单独化合物活性。下表示出所选择的化合物对副流感病毒3病毒的活性。
[0155][0156][0157]
我们合成了部分cn103052631中化合物，包括瑞德西韦。采用相同的试验方法，我进行了测试，得到了类似数据，在与本发明新化合物对比中，相同剂量下，本发明新化合物有活性，并且表现更优异。
[0158]
[0159][0160]
[0161][0162]
冠状病毒
[0163]
已知感染人的冠状病毒共有7种，其中四种在人群中较为常见(hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1)，另外两种则是mers病毒(中东呼吸综合征mers-cov)和sars病毒(严重急性呼吸综合征sars-cov)，除此之外还有2019新型冠状病毒(2019-ncov)。
[0164]
其中3种常用于药物筛选，hcov-nl63、hcov-oc43、hcov-229e。
[0165]
新化合物对hcov-nl63疗效测试：
[0166]
llc-mk2细胞(3
×
105细胞/孔)在6孔培养平板过夜后，再感染3
×
104pfu(菌斑形成单位)hcov-nl63，分别以0、1、10、50μg/ml浓度和0、10、50、100μm浓度药物的处理。在37℃和5％二氧化碳下孵育36小时后，使用显微镜拍摄了hcov nl63诱导的细胞病变效应(cpe)，细胞肿胀、圆形、空泡和最终脱落，其中37℃时hcov nl63感染的llc-mk2细胞的cpe中空泡更为突出。为了测定子代病毒的产生(病毒产量测定)，收集培养基，用菌斑法测定病毒滴度。将llc-mk2细胞单层加入上述培养基的10倍稀释液100μl。培养1小时后，用含0.75％琼脂糖(每孔3毫升)的培养基覆盖细胞单层，在37℃的二氧化碳培养箱中培养2天，以形成菌斑。最后用萘酚蓝黑染色液对细胞单层进行染色，计算斑块数。测定了茎乙醇提取物和酚酸组分对病毒的50％抑制浓度(ic50)。本发明新化合物对hcov-nl63有良好的抑制作用。
[0167]
化合物ic50/μm瑞德西韦(gs-5734)：2.5n431.0n451.0n461.0n470.9n490.9n511.0
[0168]
新化合物对hcov-oc43疗效测试：
[0169]
mrc-5细胞(1
×
104)接种于96孔组织培养板上培养过夜，用hcov-oc43感染细胞，并用浓度的化合物连续稀释处理，24小时后，用mts测定各组细胞的存活率。采用非线性回归分析确定ic50值。本发明新化合物对hcov-oc43有良好的抑制作用。
[0170]
化合物ic50/μm瑞德西韦(gs-5734)：5.5n431.5n451.9n462.1n471.8n492.0n512.1
[0171]
新化合物对hcov-229e疗效测试：
[0172]
用xtt法评价纯化合物对hcov-229e的抗病毒活性。用胰蛋白酶处理的mrc-5细胞，以7
×
103细胞/ml浓度加入到96孔板，用5％的二氧化碳病毒(100tcid50)在34℃下孵育过夜，加入病毒液，再孵育2小时，之后加入不同浓度的药物，培养96上后用xtt法测定各组细胞的存活率。采用非线性回归分析确定ic50值。本发明新化合物对hcov-nl63有良好的抑制作用。
[0173]
化合物ic50/μm瑞德西韦(gs-5734)：2.5n431.4n451.3n461.5n471.4n491.4n511.4
[0174]
核苷类或类核苷的强亲水性一直是该类药物的应用难题，严重影响其临床药物利用。减少核苷类或类核苷类药物的亲水性，增加其脂溶性，会进一步提高其脂溶性改善生物利用度。
[0175]
本发明化合物n43、n49、n51与瑞德西韦脂溶性大小的测定
[0176]
比较两种物质脂溶性大小的原理：
[0177]
物质的脂溶性与物质的极性大小相关，物质的极性越大，则该物质的脂溶性越小，物质的极性越小，则该物质的脂溶性越大。
[0178]
各种物质的脂溶性大小的比较，通常通过测定不同物质在一定的的条件下，在反向液相色谱图上，保留时间的长短来表征。物质的脂溶性越高，则表现为该物质在反向液相色谱图上，保留时间越长。
[0179]
本发明化合物n43、n49、n51和瑞德西韦脂溶性大小的比较就是根据上述的原理来进行的。
[0180]
在色谱条件：色谱柱，agilent zorbax sb-c18(250
×
4.6mm.id.5μm)；流动相，甲醇/水＝95:5(v:v)；检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃下，瑞德西韦的保留时间为1.68分钟，化合物n43、n49、n51的保留时间为5.56、5.70、5.60分钟。根据上述检测，本发明化合物n43、n49、n51的脂溶性比瑞德西韦的脂溶性脂溶性高出了3倍。这也就是说本发明化合物n43、n49、n51的膜透过性是瑞德西韦膜透过性的3倍，因此得出这样的结论：如果治疗乙型肝炎或2019-ncov(covid-19)新冠病毒本化合物用药用药仅为瑞德西韦的1/3，就达到同样的效果。患者由于服药量减少到了1/3，则药物对身体的不良反应也减小到了原来的1/3，毒性大大降低，更有利保障患者的健康，这是一个让人非常振奋的消息。
[0181]
在治疗实践中，核苷类或类核苷药物在应用于抗病毒治疗一段时间后，很容易产生耐药性，如乙肝药拉米夫定、阿德福韦酯、替诺福韦酯等，药物有效性迅速降低甚至失效，所以通过核苷类药物母核的结构改造中，如果新化合物能够保证高表达，会具备突破病毒抗耐药优点，作为治疗手段的延伸。
[0182]
至于本发明试验新化合物在艾滋病病毒、乙肝病毒、副黏病毒、冠状病毒生理活性均优于瑞德西韦，有可能是通过改善瑞德西韦德脂溶性实现，也有可能是该类化合物的新结构的自身特点，与增加脂溶性无关。我们将继续深入进行研究。