一种用于检测甘薯腐烂茎线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法与流程

文档序号:20916692发布日期:2020-05-29 13:37阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于检测甘薯腐烂茎线虫的rpa引物,其特征在于:所述rpa引物的序列如下:

上游引物dd-rpaf3:5’-ctgtctctttggcctagcacgtgtttcttgtg-3’;

下游引物:dd-rpar3:5’-gttagtttcttttcctccgcttactgatatgc-3’。

2.一种用于检测甘薯腐烂茎线虫的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒中采用权利要求1中的rpa引物,具体序列如下:

上游引物dd-rpaf3:5’-ctgtctctttggcctagcacgtgtttcttgtg-3’;

下游引物dd-rpar3:5’-gttagtttcttttcctccgcttactgatatgc-3’。

3.根据权利要求2所述的一种用于检测甘薯腐烂茎线虫的rpa试剂盒,其特征在于:所述试剂盒的反应体系的组成如下:

反应缓冲液29.5μl,浓度均为10μm的上游引物dd-rpaf3和下游引物dd-rpar3各2.4μl,待测dna模板1μl,rpa冻干酶粉5mg,280mm的醋酸镁溶液2.5μl,ddh2o12.2μl。

4.一种用于检测甘薯腐烂茎线虫的检测方法,其特征在于:

包括以下步骤:

步骤(1)、提取待测样品中的dna;

步骤(2)、以步骤(1)提取的dna作为待检测dna模板,采用权利要求1所述的rpa引物进行rpa扩增反应,制得rpa扩增产物;

步骤(3)、分析rpa扩增产物,取出rpa扩增产物5μl,用10g/l琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果,在230bp处出现扩增条带的为甘薯腐烂茎线虫,反之则否。

5.根据权利要求4所述的一种用于甘薯腐烂茎线虫的检测方法,其特征在于:步骤(2)中rpa扩增反应所用的体系如下:

反应缓冲液29.5μl,浓度均为10μm的上游引物dd-rpaf3和下游引物dd-rpar3各2.4μl,待测dna模板1μl,rpa冻干酶粉5mg,280mm的醋酸镁溶液2.5μl,ddh2o12.2μl。

6.根据权利要求4所述的一种用于甘薯腐烂茎线虫的检测方法,其特征在于:rpa扩增反应的条件如下:38℃反应30分钟,随后冰上终止反应。

7.根据权利要求4-6任意一项所述的一种用于甘薯腐烂茎线虫的检测方法,其特征在于:步骤(3)中分析rpa扩增产物的方法为:利用琼脂糖凝胶电泳技术分析。


技术总结
本发明提供了一种应用重组酶聚合酶等温扩增(Recombinase plolymerase amplification,RPA)技术检测甘薯腐烂茎线虫的RPA引物及包含该RPA引物的RPA试剂盒,所述RPA引物的序列如SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示。本发明还提供了利用RPA试剂盒来检测甘薯腐烂茎线虫的方法,可以检测单个或者混合甘薯腐烂茎线虫DNA样品,检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好,对甘薯茎线虫病的诊断检测和科学施药提供理论指导。

技术研发人员:马居奎;孙厚俊;谢逸萍;张成玲;杨冬静
受保护的技术使用者:江苏徐淮地区徐州农业科学研究所(江苏徐州甘薯研究中心)
技术研发日:2020.03.05
技术公布日:2020.05.29
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