一种用于检测甘薯腐烂茎线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法与流程

文档序号：20916692发布日期：2020-05-29 13:37阅读：373来源：国知局

本发明属于生物技术领域，涉及到一套利用重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinaseplolymeraseamplification，rpa)检测甘薯腐烂茎线虫引物及方法，具体为一种用于检测甘薯腐烂茎线虫的rpa引物、试剂盒及检测方法。

背景技术：

甘薯茎线虫病又叫空心病，俗称"糠心病"，是国内植物检疫对象之一。其病原线虫为甘薯腐烂茎线虫（ditylenchusdestructorthorne），该线虫最早发现于马铃薯上，导致马铃薯腐烂，因此也称为马铃薯腐烂茎线虫（potatorotnematode）。1980年，张云美等首次报道山东省发生的甘薯茎线虫病的病原为甘薯腐烂茎线虫。1982年，丁再福和林茂松等对采自山东、江苏、安徽等地的甘薯茎线虫病病原进行鉴定，再次肯定其病原为甘薯腐烂茎线虫。此外，陈品三和王玉娟等先后报道了甘薯腐烂茎线虫可引起当归麻口病。由于我国在过去很长一段时间里未对线虫病害进行系统的调查和准确鉴定，导致甘薯腐烂茎线虫通过甘薯种薯运输、种苗调运、农事操作以及花卉植物的种苗、苗木运输等途径，已扩散到我国十多个省，成为我国北方薯区最为严重的病害之一。

线虫种类鉴定主要包括传统的形态学鉴定、基于蛋白的同工酶鉴定技术和基于dna分子的检测技术。传统形态学鉴定主要以线虫外部和内部形态特征作为分类依据，形态学鉴定只适用于成虫，茎线虫属种类多，许多种类形态特征较为相似，鉴定的准确性完全依靠操作者较强的经验，方法耗时长、需要较强的专业技能。同工酶鉴定技术通过酯酶和苹果酸脱氢酶的酶谱表型来区分线虫不同种类，该方法以线虫雌成虫的蛋白粗提物进行聚丙烯酰胺电泳，通过酯酶和苹果酸脱氢酶同工酶染色后根据酶带的谱型来进行种类判断，该方法部分克服了形态学鉴定的缺点，可以比较快速准确的判断根结线虫种类。但该技术操作复杂、耗时长的不足也极大限制其应用。基于dna的分子检测技术是线虫最常用的检测手段，主要包括随机扩增多态性dna技术(rapd)、特异引物pcr技术、实时荧光定量pcr技术(real-timepcr)和环介导等温扩增技术(lamp)等。pcr技术和real-timepcr技术具备准确、高效、灵敏度高的特点，同时可实现对根结线虫的定量检测，以pcr为基础的分子检测需要相对高质量的dna模板，扩增和检测需要pcr仪等，且检测过程需要数小时，存在对仪器设备、实验条件、人员专业素质要求较高的缺点。发明专利201110228196.6公开了一种基于lamp检测甘薯腐烂茎线虫的试剂盒，针对甘薯腐烂茎线虫rdna-its区设计了3组引物，实现甘薯腐烂茎线虫检测。但该方案需要65℃恒温水浴1h以上，且产物为多带，容易出现假阳性。鉴于此，继续开发精确、高效、对仪器设备要求低的甘薯茎线虫检测技术具有重要的实践价值。

重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)是一种由重组酶、单链dna结合蛋白和链置换dna聚合酶参与的恒温扩增新技术，可在37℃～45℃下连续进行反应，反应时间只需15～30min，该技术相比于lamp，只需要一对特异性引物，反应所需温度更低，反应时间更短，且扩增后产生与传统pcr一样的单条带，特异性强、灵敏度高，非常适用于疾病诊断和现场检测。该技术不需温控仪器即可快速进行痕量dna或rna的特异性扩增，在临床检测和现场快速诊断方面具有显著的优越性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种应用重组酶聚合酶扩增（rpa）技术检测甘薯腐烂茎线虫的rpa引物、试剂盒及检测方法。

本发明提供的一种用于检测甘薯腐烂茎线虫的rpa引物，所述rpa引物的序列如下：

上游引物dd-rpaf3：5’-ctgtctctttggcctagcacgtgtttcttgtg-3’，（见seqidno：5）；

下游引物:dd-rpar3：5’-gttagtttcttttcctccgcttactgatatgc-3’，（见seqidno：6）。

本发明提供一种应用rpa技术检测甘薯腐烂茎线虫的试剂盒，所述试剂盒组成如下：

反应缓冲液29.5μl，浓度均为10μm的上游引物dd-rpaf3和下游引物dd-rpar3各2.4μl，待测dna模板1μl，rpa冻干酶粉5mg，280mm的醋酸镁溶液2.5μl，ddh2o12.2μl。

其中，上游引物dd-rpaf3：5’-ctgtctctttggcctagcacgtgtttcttgtg-3’，（见seqidno：5）；

下游引物dd-rpar3：5’-gttagtttcttttcctccgcttactgatatgc-3’，（见seqidno：6）。

本发明的目的是提供一种应用rpa技术检测甘薯腐烂茎线虫检测方法，该方法为：

提取待测线虫样品的dna作为模板，利用甘薯腐烂茎线虫的rpa试剂盒中的特异性引物作为扩增引物，进行rpa扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现230bp的特异dna条带，则待测线虫为甘薯腐烂茎线线虫，反之则否。

所述rpa扩增的条件如下：38℃反应30分钟。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明针对腐烂茎线虫的包括its、核糖体dna28s等多个区域进行了分子检测的研究，设计了多个甘薯腐烂茎线虫rpa引物对，筛选出特异性强、灵敏度高的引物组合。利用本发明提供的试剂盒和检测方法，该特异性引物对甘薯腐烂茎线虫特异性片段大小为230bp，对根结线虫、孢囊线虫、短体线虫等其他线虫无特异性条带片段。可检测单个或者混合甘薯腐烂茎线虫dna样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好，为制定线虫的快速分子检测、甘薯茎线虫病的早期诊断和辅助鉴定等提供服务。

附图说明

图1为甘薯腐烂茎线虫rpa引物特异性检测。其中，m：dl2000dnamarker；1-8：甘薯腐烂茎线虫（dd1-dd8），9：南方根结线虫（mi1）；10：爪哇根结线虫（mj1）；11：象耳豆根结线虫（me1）；12：大豆孢囊线虫（hg1）；13：禾谷孢囊线虫（ha1）；14：贝西滑刃线虫（ab1）；15：咖啡短体线虫（pc1）；16：ddh2o对照；17：rpa试剂盒自带阳性对照。

图2为群体基因组dna引物灵敏度检测。

图2a为甘薯腐烂茎线虫群体基因组dnarpa反应灵敏度检测。m：dl2000dnamarker；1-5：dna模板浓度10ng/μl，1ng/μl，10^-1ng/μl，10^-2ng/μl，10^-3ng/μl；6：ddh2o对照。

图2b为甘薯腐烂茎线虫群体基因组dnapcr反应灵敏度检测。m：dl2000dnamarker；1-5：dna模板浓度10ng/μl，1ng/μl，10^-1ng/μl，10^-2ng/μl，10^-3ng/μl；6：ddh2o对照。

图3为单条线虫dna引物灵敏度检测。

图3a为单条甘薯腐烂茎线虫dnarpa反应灵敏度检测。m：dl2000dnamarker；1-5：dna模板浓度10⁰、10^-1、10^-2、10^-3和10^-4；6：ddh2o对照。

图3b为单条甘薯腐烂茎线虫dnapcr反应灵敏度检测。m：dl2000dnamarker；1-5：dna模板浓度10⁰、10^-1、10^-2、10^-3和10^-4；6：ddh2o对照。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明进一步进行描述，但并不限制本发明。

以下实施例中使用的rpa反应管以及反应缓冲液购自英国twistdx公司，商品编号twistamp®basickit；其中，重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶以rpa冻干酶粉状态存在于rpa反应管中，使用时，用反应缓冲液溶解，整个rpa扩增反应在rpa反应管中进行。

实施例1、甘薯腐烂茎线虫rpa扩增引物设计和检测方法的建立

1.1甘薯腐烂茎线虫rpa引物设计和筛选

根据甘薯腐烂茎线虫与其他茎线虫的its、核糖体rna28s核苷酸序列进行比对分析，设计了3对适用于rpa反应的引物（表1）。

表1：用于甘薯腐烂茎线虫rpa检测筛选的引物

1.2甘薯腐烂茎线虫dna模板的制备

收集甘薯腐烂茎线虫放入1.5ml离心管中，经5000rpm离心10分钟后，使用移液器尽量吸去管中的水，将离心管放入液氮中速冻30s后，使用研磨杵进行研磨，研磨后的匀浆使用动物基因组dna快速抽提试剂盒(上海生工)提取线虫dna。

1.3rpa反应体系

反应使用twistamp®basickit，反应总体系为50μl，首先在0.2ml的pcr管中加入缓冲液29.5μl，10μm的上下游引物各2.4μl，dna模板1μl，ddh2o12.2μl，用移液器吸打混匀后，加入到含有rpa冻干酶粉的反应管中，并用移液器混匀，最后加入280mm的mgac溶液2.5μl。

1.4rpa扩增反应条件

将上述rpa扩增体系充分混匀，置于38℃的水浴或者金属浴孵育30min，获得rpa扩增产物。

1.5rpa扩增产物电泳检测

将5μlrpa产物用10g/l琼脂糖凝胶电泳分离，经dna染料染色后于紫外凝胶成像系统下显像，引物dd-rpaf3、dd-rpar3扩增后能稳定获得230bp特异性片段，其余引物由于稳定性弱和特异性差等原因被舍弃。

实施例2、甘薯腐烂茎线虫rpa特异性扩增准确性和可靠性试验

收集甘薯腐烂茎线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、象耳豆根结线虫、大豆胞囊线虫、禾谷胞囊线虫、贝西滑刃线虫、咖啡短体线虫共15个种群（表2），按照实例1.2提取不同群体线虫dna作为模板，以ddh2o为阴性对照，按照实例1.3、1.4、1.5进行rpa反应并检测。图1结果显示，仅甘薯腐烂茎线虫群体获得230bp特异性扩增产物，其他线虫群体在此处均无条带产生。

表2试验所用的线虫群体

实施例3、甘薯腐烂茎线虫rpa反应灵敏度检测

3.1甘薯腐烂茎线虫群体基因组dnarpa反应灵敏度检测

用实施例1.2的提取方法，提取甘薯腐烂茎线虫的dna，采用nanodrop2000测定其基因组dna浓度，采用水将其稀释成10ng/μl，1ng/μl，10^-1ng/μl，10^-2ng/μl，10^-3ng/μl。

rpa检测：分别以这5种不同浓度的甘薯腐烂茎线虫的dna为模板（1μl），以清水为对照，按照1.3、1.4、1.5进行rpa反应并检测。

pcr检测：以上述梯度稀释的dna模板，扩增体系为25μl，dna模板1μl，引物对ddf1/ddr1（20μm）1μl，emeraldamp®maxpcrmastermix（takara，大连）12.5μl，ddh2o补足至25μl。采用无线虫dna模板为阴性对照。在eppendorfpcr扩增仪上进行扩增。pcr反应条件如下：95℃4min；95℃40s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min，4℃保存。将5μlpcr产物用10g/l琼脂糖凝胶电泳分离，经dna染料染色后于紫外凝胶成像系统下显像。

ddf1和ddr1引物序列如下：

ddf1：5’-gctctgtgcctggctaatttgtg-3’；

ddr1：5’-accaaacactggacagcattatc-3’；

图2a和2b结果显示，本发明rpa方法与普通pcr检测的灵敏度相当，约为10^-2ng/μl。

3.2单条甘薯腐烂茎线虫dnarpa反应灵敏度检测

挑取单条甘薯腐烂茎线虫，置于含有10μl裂解缓冲液（8μlddh2o和1μl10×pcrbuffer）的200μlpcr管中，随后在液氮中冷冻2min，65℃水浴2min，重复3次。然后向pcr管中加入1μl10mg/ml蛋白酶k，65℃温育1.5h，95℃处理10min，14000rpm离心1min，获得单条甘薯腐烂茎线虫dna模板（以10⁰计），并按10倍梯度依次稀释10^-1、10^-2、10^-3和10^-4条线虫dna。

rpa检测：分别以这5种不同浓度的甘薯腐烂茎线虫的dna为模板（1μl），以清水为对照，按照1.3、1.4、1.5进行rpa反应并检测。

图3a和3b结果显示，本发明rpa方法与普通pcr检测的灵敏度相当，为10^-2条/μl，即甘薯腐烂茎线虫的检出限为1/100条线虫。

利用本发明提供的引物、试剂盒和检测方法，可对甘薯腐烂茎线虫做出快速鉴定，灵敏度高，重复性强，鉴定时间短，为制定线虫的快速分子检测、甘薯茎线虫病的早期诊断和辅助鉴定等提供服务。

序列表

<110>江苏徐淮地区徐州农业科学研究所(江苏徐州甘薯研究中心)

<120>一种用于检测甘薯腐烂茎线虫的rpa引物、试剂盒及检测方法

<130>2020

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>31

<212>dna