一种H9亚型禽流感病毒分离鉴定方法与流程

本发明属于病毒分离鉴定领域。
背景技术：
：禽流感病毒可引起的人和动物的感染，根据致病性强弱，将禽流感分为高致病性禽流感和低致病性禽流感，其中h9亚型禽流感属于低致病性禽流感，广泛存在于养殖场中，尽管各级农业部门和养禽企业采取了多种防治措施，但该病对养禽业仍造成了巨大的损失。禽流感分离鉴定能对环境中的禽流感病毒进行监控和预警，是防控禽流感疫情的重要手段。禽流感分离鉴定包括分离和鉴定两部分。鉴定的目的是对病原体进行病毒种类的识别。常见的鉴定方法包括血清学方法和分子生物学方法等。血清学方法包括血凝(ha)试验、血凝抑制(hi)试验、琼脂凝胶扩散(agp)试验、神经氨酸酶抑制试验(nit)、病毒中和试验(vnt)、酶联免疫吸附试验(elisa)等。分子生物学方法包括pcr、逆转录环介导等温核酸扩增技术(rt-lamp)、基因芯片、dna测序等等。而分离的目的是将病原体纯化和扩增，达到足以被准确鉴定的病原体含量水平。分离的效率直接关系到鉴定的准确性。常见的分离方法是将样品进行有限稀释(可省略)，再接种到spf鸡胚或犬肾传代细胞(mdck细胞)中进行培养。spf鸡胚是隔离养殖的、不带有禽类流行传染病病原的鸡所产的蛋，其费用较高；且鸡胚对有些血清型的病毒的敏感性不够，且分离出来的病毒抗原性变异比较大，容易产生假阴性。mdck细胞相对费用较低，但其对h9亚型禽流感的敏感性仍然有待提高。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了一种新的h9亚型禽流感病毒分离鉴定方法。本发明的技术方案包括：一种h9亚型禽流感病毒分离方法，其特征在于，它包括：将病毒样品经终浓度6-12μg/ml的胰酶孵育10-20min后，接种于悬浮mdck细胞，培养4-6天。进一步的，所述培养环境温度为37摄氏度。进一步的，所述培养环境中co2浓度为5％。进一步的，所述培养的持续时间是5天。一种h9亚型禽流感病毒分离鉴定方法，它包括：将病毒样品经终浓度6-12μg/ml的胰酶孵育10-20min后，接种于悬浮mdck细胞，培养4-6天后，进行ha试验；ha试验中，样品ha效价不低于4log2，则为阳性。如前述的方法，它还包括对病毒类型进行进一步验证，即：当ha试验中样品ha效价不低于4log2时，再将检测ha为阳性的细胞液稀释为2log2单位的抗原进行hi试验；所述hi试验使用的阳性血清包括h9亚型禽流感阳性血清和其他血清；所述其他血清为：鸡新城疫、h5亚型禽流感、h7亚型禽流感和产蛋下降综合征阳性血清中的一种或一种以上；当h9亚新禽流感阳性血清hi效价不低于4log2，且其他血清hi效价低于4log2，则鉴定为h9亚型禽流感。进一步地，前述鉴定方法还包括对病毒类型再次验证，即：当ha试验中样品ha效价不低于4log2时，再使用pcr或dna测序对细胞液中病毒类型进行验证。如前述的方法，所述培养环境温度为37摄氏度。如前述的方法，所述培养环境中co2浓度为5％。如前述的方法，所述培养的持续时间是5天。术语“ha试验”指血凝试验，也称为凝集试验；该试验的原理是：病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(ha)。术语“hi试验”指血凝抑制试验，也称凝集抑制试验；该试验的原理是：当病毒悬液中先加入抑制病毒颗粒或血凝素的抗体，红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，此时红细胞凝集现象被抑制，该现象为红细胞凝集抑制(hi)。本发明具有如下有益效果：本发明的分离方法相比鸡胚分离，病毒分离率更高。进而本发明的分离鉴定方法具有更高的灵敏度，能够避免很多漏检情况，更有利于鸡场h9亚型禽流感的防范。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1：mdck悬浮细胞(培养48h后)；标尺长度为100μm。具体实施方式实施例1本发明h9亚型禽流感病毒分离鉴定方法1.mdck悬浮细胞的复苏与培养从液氮罐中取出1支细胞，37℃水浴迅速解冻。200g离心5分钟，弃去上清，加入细胞生长液，放置于摇床上，进行悬浮培养，摇床参数：转速为200r/min、温度为37℃、co2浓度为5％，细胞培养2-3日，细胞密度达到6.0×106/ml后，分装接种于50ml的tpp管中，15ml/管，放置于摇床上，细胞显微镜检如图1所示。2.接毒培养取所需分离病毒的样品，添加终浓度6μg/ml的胰酶溶液，37℃孵育10min，接种到5管mdck悬浮细胞，每管接种病毒液0.2ml，放置于摇床上，200r/min、37℃、5％co2条件下继续培养5日。3.检测3.1ha试验取细胞液，进行ha效价测定，ha效价不低于4log2则判定为病毒分离阳性。3.2hi试验将3.1中检测ha为阳性的细胞液稀释为2log2单位的抗原，利用鸡新城疫、禽流感(h5亚型、h7亚型、h9亚型)和产蛋下降综合征阳性血清进行hi试验。若只有禽流感(h9亚型)阳性血清的有hi效价且不低于4log2，而其他血清hi效价低于4log2，则可初步鉴定为分离出h9亚型禽流感病毒。另外，在事先不知道病毒种类时，也可采用pcr或者测定dna序列的方法对所分离的病毒进行进一步鉴定。实验例1敏感性检测1.方法使用实施例1的方法，将mdck复苏培养，当细胞密度达到6.0×106/ml以上时，分装于50mltpp培养管中，15ml/管。取h9亚型禽流感g株病毒，10倍系列稀释后，取稀释度10-8、10-9、10-10、10-11的病毒液1.0ml，分别添加终浓度为6μg/ml的胰酶溶液，37℃孵育10min。每个稀释度处理的病毒液，各接种1管mdck悬浮细胞，每管接种病毒液0.2ml，放置于摇床中，200r/min(摇床转速)、37℃、5％co2条件下培养5日。取出细胞液，进行ha效价测定，ha效价不低于4log2，判定为病毒分离阳性。2.结果10-8、10-9、10-10稀释组接种mdck细胞培养5日后，ha效价均不低于4log2，而10-11稀释组ha效价为0，具体结果见表1。表1不同稀释度h9亚型禽流感病毒对mdck细胞的敏感性试验结果稀释度10-810-910-1010-11ha效价9log29log28log20阳性结果判定阳性阳性阳性阴性实验结果表明，本发明的方法灵敏度较高，病毒稀释至10-10仍能被检测到。实验例2mdck细胞方法(本发明方法)与spf鸡胚方法(鸡胚法)敏感性比对试验1.方法1.1mdck细胞分离鉴定法(本发明的方法)同实验例1的方法。1.2鸡胚法取h9亚型禽流感g株病毒，10倍梯度稀释后，取10-8、10-9、10-10稀释度的病毒，每个浓度接种5枚鸡胚，每个鸡胚接种0.2ml；培养5日后，取样进行ha效价测定，ha效价不低于4log2，判定为病毒分离阳性。2.结果病毒稀释到10-10接种mdck细胞，病毒分离1/5阳性，而10-10稀释病毒接种spf鸡胚，无阳性。结果详见表2。表2不同分离方法敏感性比对试验结果本实验例结果说明，本发明的方法比鸡胚分离法灵敏度更高。实验例3本发明方法的应用1.方法从某疑似h9亚型禽流感发病的鸡场，采集200份喉头棉拭子，置于含有2.5ml的pbs溶液(浓度为0.01mol/l，ph值为7.2～7.4，每毫升含有1万单位的青霉素和1万μg的链霉素)中，并用漩涡振荡器震荡3分钟。将处理后的样本放置于2～8℃冰箱处理6～12小时，每份样液分为2部分，分别使用实验例2中稀释后病毒的处理方法(本发明的方法和鸡胚分离法)，进行后续检测。2.检测2.1ha试验取细胞液，进行ha效价测定，ha效价不低于4log2的细胞液，进行hi检测。2.2hi试验将2.1中检测ha为阳性的细胞液稀释为2log2单位的抗原，利用鸡新城疫、禽流感(h5亚型、h7亚型、h9亚型)和产蛋下降综合征阳性血清进行hi试验。若只有禽流感(h9亚型)阳性血清的有hi效价且不低于4log2，而其他血清hi效价低于4log2，则可初步鉴定为h9亚型禽流感。3.结果采集的样品经过处理，分别接种mdck细胞及鸡胚后，本发明的方法检测到12份样品ha效价不低于4log2，但鸡胚法仅检测到10份样品ha效价不低于4log2。经过hi试验进一步鉴定，本发明方法检测的12份样品全部为h9亚型禽流感病毒，而鸡胚法检测到的10份样品中，有9份为禽流感病毒，另有1个样品为新城疫病毒，结果详见表3、表4。表3不同分离方法ha试验结果接种对象ha效价不低于4log2样品mdck细胞12/200spf鸡胚10/200表4ha阳性样品的hi试验结果本实验例结果表明，鸡胚法检测灵敏度和准确性都不如本发明的分离鉴定方法。实验例4最佳胰酶孵育时间试验1.方法将mdck细胞复苏培养，当细胞密度达到6.0×106/ml以上时，分装于50mltpp培养管中，15ml/管。取h9亚型禽流感g株病毒，10倍系列稀释后，取稀释度10-8、10-9、10-10的病毒液1.0ml，分别添加终浓度为6μg/ml的胰酶溶液，于37℃孵育0min、10min、20min或40min，每个稀释度处理的病毒液，各接种5管mdck悬浮细胞，每管接种病毒液0.2ml。放置于摇床中，200r/min(摇床转速)、37℃、5％co2条件下培养5日。取出细胞液，进行ha效价测定，ha效价不低于4log2，判定为病毒分离阳性。2.结果胰酶孵育10min、20min，病毒分离率最高，0min、40min的病毒分离率偏低。所以胰酶孵育时间在10～20min均能达到良好的病毒分离效果。结果详见表5。表5胰酶孵育条件试验结果实验例5最佳添加胰酶浓度试验1.方法将mdck细胞复苏培养，当细胞密度达到6.0×106/ml以上时，分装于50mltpp培养管中，15ml/管。取h9亚型禽流感g株病毒，10倍系列稀释后，取稀释度10-8、10-9、10-10的病毒液1.0ml，分别添加终浓度为0μg/ml、6μg/ml、12μg/ml或18μg/ml的胰酶溶液，于37℃孵育10min，每个稀释度处理的病毒液，各接种5管mdck悬浮细胞，每管接种病毒液0.2ml。放置于摇床中，200r/min(摇床转速)、37℃、5％co2条件下培养5日。取出细胞液，进行ha效价测定，ha效价不低于4log2，判定为病毒分离阳性。2.结果胰酶浓度为6μg/ml、12μg/ml时，病毒分离率最高，0μg/ml、18μg/ml的病毒分离率偏低。所以将胰酶浓度定为6～12μg/ml均能达到良好的分离率。结果详见表6。表6胰酶浓度试验结果综上，本发明的分离方法分离率高，进而使本发明的分离鉴定方法灵敏度和准确性高于鸡胚法，可广泛应用于各种环境中禽流感病毒的监控。当前第1页12