本发明涉及生物检测领域，具体涉及高尔基体蛋白73的单克隆抗体、包含该抗体的试剂盒以及在检测高尔基体蛋白73中的应用。
背景技术：
：肝硬化是各种慢性肝病发展的晚期阶段，由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。在我国大多数为肝炎后肝硬化，少部分为酒精性肝硬化和血吸虫性肝硬化。病理组织学上有广泛的肝细胞坏死、残存肝细胞结节性再生、结缔组织增生与纤维隔形成，导致肝小叶结构破坏和假小叶形成，肝脏逐渐变形、变硬而发展为肝硬化。早期由于肝脏代偿功能较强可无明显症状，后期则以肝功能损害和门脉高压为主要表现，并有多系统受累，晚期常出现上消化道出血、肝性脑病、继发感染、脾功能亢进、腹水以及癌变等并发症。目前诊断肝硬化的方法主要包括：影像学检查，肝活检和实验室血清学检测等。影像学检查结果可靠，但只有肝脏组织结构发生明显变化时才能发现，因而不利于早期诊断。肝脏活检可以建立明确诊断，但是由于其创伤性很难为患者接受。而目前实验室血清学检测方法很难给出肝硬化的明确诊断，以肝纤维化阶段的四项检查(ⅲ型前胶原，ⅳ型胶原，层粘连蛋白和透明质酸)为例，因为受到肝脏炎症的影响较大，其特异性和灵敏度均不高，不能满足临床诊断肝硬化的要求。高尔基体蛋白73(golgiprotein73,gp73)是2000年kladney等在研究成人巨细胞性肝炎病原学时首次被发现的。gp73是一种高尔基体跨膜糖蛋白，在电泳中显示的相对分子量是73kd，因此被命名为gp73。编码gp73蛋白的基因位于第9号染色体，全长共3080个核苷酸，编码区位于199～1404nt基因，内含惟一开放读码框(1200～1430bp)。gp73定位于高尔基体的顺面，在体内发生糖基化并富含酸性氨基酸，主要分为5个部分：n端的1到12位氨基酸是胞质结构域，位于细胞质内；12到35位氨基酸是跨膜结构域；36到205位氨基酸是卷曲螺旋结构，负责与其他蛋白相互作用；206位到348位氨基酸是无定形结构域；349位到402位氨基酸是酸性片段区，具有亲水性。n端为疏水末端，主要位于高尔基体内，构成跨膜区和信号肽切割位点。c端位于高尔基体外，包含有十四(烷)酰化连续序列、五个糖基化位点、一个酸性结构域和一个卷曲螺旋结构。研究发现，gp73主要在胆管上皮细胞中表达，肝细胞中没有或很少表达。在良性肝病进展过程中有表达量逐渐增多的趋势，从急慢性肝炎到肝硬化gp73的表达量逐渐增多，以肝硬化组织表达最高。gp73的表达途径可能存在不同的机制：一种由急性肝细胞损伤触发，而另一种存在于慢性肝脏疾病进展过程中。有学者认为gp73蛋白是通过其细胞外的卷曲螺旋区与其他蛋白质发生作用，是维持肝、肾等内脏器官生长发育的重要物质，并且在哺乳动物及两栖动物胚胎时期的前肾发育成熟过程中起着至关重要的作用。技术实现要素：本发明通过对高尔基体蛋白73(可简称为gp73)蛋白全长序列的分析，选择了gp73aa180-aa280进行表达。用表达的gp73aa180-aa280抗原制备杂交瘤细胞，进而获得针对gp73aa180-aa280片段抗原表位的单克隆抗体。将所述gp73单克隆抗体制备检测试剂盒并用于检测人血清中的gp73，灵敏度高，特异性强。具体而言：本发明的第一目的在于提供高尔基体蛋白73单抗杂交瘤细胞株。本发明提供的第一株高尔基体蛋白73单抗杂交瘤细胞株，即gp73单抗细胞株-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter，cgmcc)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为cgmccno.19282，保藏日期2020年1月2日，分类命名为：杂交瘤细胞株。本发明提供的第二株高尔基体蛋白73单抗杂交瘤细胞株，即gp73单抗细胞株-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter，cgmcc)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为cgmccno.19283，保藏日期2020年1月2日，分类命名为：杂交瘤细胞株。本发明的第二目的是提供高尔基体蛋白73的单克隆抗体。该抗体由所述的杂交瘤细胞株分泌。本发明的第三目的是提供包含所述高尔基体蛋白73的单克隆抗体的试剂盒。本发明所述试剂盒可以是胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。作为本发明的一种优选方案，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。作为本发明的一种优选方案，所述酶联免疫试剂盒中包含：用所述高尔基体蛋白73单克隆抗体包被的酶标板，以及所述高尔基体蛋白73单克隆抗体与辣根过氧化物酶的结合物。本发明使用单克隆抗体包被酶标板以及标记辣根过氧化物酶，相比多克隆抗体，单克隆抗体具有高特异性、高均一性、高重复性等特点，制备的试剂盒稳定性好。作为本发明的一种优选方案，所述酶联免疫试剂盒中包含的校准品为液体蛋白标准品，由gp73蛋白溶于稀释液制备而成。所述液体蛋白标准品中优选加入0.03～0.07％的硫柳汞和0.03～0.07％的proclin300防腐剂，可以使gp73蛋白在2～8℃长时间稳定贮存于液体中，保质期可达9个月。其他同类试剂盒中的校准品大多为冻干品，或者需要-20℃保存，使用前需要稀释，操作复杂，易产生误差。作为本发明的一种优选方案，所述酶联免疫试剂盒中包含的显色剂为单组分tmb显色液。所述tmb，即3,3',5,5'-四甲基联苯胺，为白色结晶粉末，无嗅、无味，难溶于水，易溶于丙酮、乙醚、二甲亚砜、二甲基甲酰胺等有机溶剂，是一种新型安全的色原试剂。本发明采用单组分显色液体，可以避免双组份显色液分开配制以及使用前再混合导致的操作复杂、批间差大等缺陷，减少了操作步骤，提高了准确性。所述试剂盒中还可以进一步包括洗涤液、终止液、封板膜等组分。本发明的第四目的是提供所述杂交瘤细胞株、所述单克隆抗体或所述试剂盒在检测血清中高尔基体蛋白73中的应用。本发明的第五目的是提供采用所述杂交瘤细胞株、所述单克隆抗体或所述试剂盒检测血清中高尔基体蛋白73的方法。为了提高检测的准确性，本发明优选采用包括如下步骤的方法获得待测样品：采集静脉血，放置半小时以上充分凝固后，以转速1300～1500rpm水平离心5～10min，取上层血清。作为本发明的一种优选方案，所述方法采用双抗体夹心法对目标物质(即高尔基体蛋白73)进行定量检测。在实际操作中，在高尔基体蛋白73单克隆抗体包被的酶标板中，加入待测样品进行反应，加入高尔基体蛋白73单克隆抗体与辣根过氧化物酶的结合物，再与显色剂作用，显色强度与待测样品中目标物质的浓度相关。本发明提供的方法测定人血清中gp73含量，反应时间短，与同类elisa试剂盒进行比较，操作时间减少50分钟。由于血清中的gp73是目前国内外唯一的肝硬化血清学标志物，因此本发明提供的试剂盒和方法在临床上可用于肝硬化的辅助诊断。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1本实施例提供高尔基体蛋白73的单克隆抗体原液。该抗体原液是通过在balb/c小鼠体内注射本发明保藏的杂交瘤细胞制备腹水，再进行proteing纯化获得。具体而言，在balb/c小鼠体内注射保藏编号为cgmccno.19282的杂交瘤细胞制备腹水，再进行proteing纯化获得gp73单克隆抗体原液-1。在balb/c小鼠体内注射保藏编号为cgmccno.19283的杂交瘤细胞制备腹水，再进行proteing纯化获得gp73单克隆抗体原液-2。实施例2本实施例提供了用于检测人血清gp73水平的试剂盒。所述试剂盒的规格为96人份/盒，其中包含如下组分：(1)gp73抗体包被板(每个试剂盒中，96孔板×1)所述包被板通过如下方法制备得到：在96孔酶标板上按2μg/ml的浓度包被实施例1提供的gp73单克隆抗体原液-1，于2～8℃孵育不少于16小时；甩掉酶标板里的包被液，用磷酸盐缓冲液洗1遍，加入封闭液，于2～8℃孵育不少于16小时；甩掉酶标板里的封闭液，干燥后于2～8℃保存。(2)gp73校准品(每个试剂盒中，0.5ml×8瓶)所述gp73校准品是通过基因工程方法，在大肠杆菌中表达得到重组gp73蛋白(可简称为gp73抗原)，再加入0.02m磷酸盐缓冲液，配制特定浓度的工作校准品溶液。(3)gp73酶结合物(每个试剂盒中，12ml×1瓶)所述gp73酶结合物，即gp73单克隆抗体-辣根过氧化物酶结合物，是在实施例1获得的单克隆抗体原液-2基础上，采用过碘酸盐氧化法将其与辣根过氧化物酶结合，获得酶标抗体，并用酶结合物稀释液将其配置成特定的浓度，于2～8℃避光保存。(4)浓缩洗涤液(20×)(每个试剂盒中，50ml×1瓶)，其中包含0.4m磷酸盐缓冲液以及吐温-20。(5)单组份tmb显色液(每个试剂盒中，12ml×1瓶)。(6)终止液(每个试剂盒中，7ml×1瓶)，其成分为2m硫酸。(7)封板膜(每个试剂盒中，3张)该试剂盒于成品库2～8℃保存，有效期12个月。实施例3本实施例提供了一种利用实施例2提供的试剂盒检测人血清gp73水平的方法。1、样本采集：采集静脉血放置半小时以上，充分凝固后，水平1500rpm离心5～10min，取上层血清。为了确保检测结果准确，本发明要求尽可能使用新鲜样本，避免反复冻融；新鲜样本在2～8℃可保存7天，在-20℃保存期不超过3个月，若长期保存，应置于-80℃，不得超过2年；样本须在冻存条件下运输，并符合相关生物安全规定；不能使用严重溶血、高脂血或严重污染的样本；样本不能使用叠氮钠作为防腐剂。若样本经过冷冻，在检测前需在室温(18～28℃)平衡至少30min。2、加样：分别在相应孔中加入50μl校准品(s0～s7)和血清样本(空白孔不加)，充分振荡混匀30s。本发明提供的方法无需加入样本稀释液即可完成测定，反应特异性强；相比较而言，同类试剂盒需要加入样本稀释液以降低非特异反应，操作复杂。3、温育：用封板膜封板后置于37℃恒温水浴箱温育30min。4、洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤6遍，每次每孔应加入至少300μl洗涤液，最后一遍洗涤后在干净吸水纸上扣干。5、加酶结合物：每孔加入100μl酶结合物(空白孔不加)，振荡混匀30s。6、温育：同步骤3。7、洗涤：同步骤4。8、显色：每孔加入单组份tmb显色液100μl，振荡30s，用封板膜封板后置于37℃避光温育10min。9、测定：每孔加入50μl终止液，振荡混匀30s，使用酶标仪在450nm波长处测量各孔吸光度值(od值)。酶标仪无需空白孔调零点。需在终止反应后10min内进行测定。10、数据处理：应用双对数log-log线性拟合方法处理数据。以各校准品浓度的对数为纵坐标(y轴)，各校准品od值(需减去s0的od值)的对数为横坐标(x轴)作图，建立标准曲线。单波长(450nm)酶标仪测得样本的od值，需减去空白孔的od值再取对数，从标准曲线上计算出样本的gp73浓度。双波长(450nm和630nm)酶标仪测得样本的od值直接取对数，从标准曲线上计算出样本的gp73浓度。本发明提供的方法检测限≤1.00ng/ml；线性良好，在1.00ng/ml～475.00ng/ml范围内，相关系数≥0.9900；批内重复性好，变异系数cv≤15％；批间重复性好，变异系数cv≤15％；准确度高，回收率在85％～115％范围内。实施例4本实施例采用实施例2提供的试剂盒进行了临床试验。本试验共计收取样本1300份，其中符合样本入选条件的有效样本1299，占总样本数的99.9％，详细入选情况见表1。表1研究样本情况描述导致1份无效样本的具体原因详见表2。表2剔除病例情况描述中心序号性别年龄(岁)剔除原因2629女57未检测出结果表3基线人口统计学资料描述(fas)说明:1q1:百分之25分位数；2q3:百分之75分位数表4gp73测量结果的描述性分析(fas)说明:1q1:百分之25分位数；2q3:百分之75分位数表5基线人口统计学资料描述(pps)说明:1q1:百分之25分位数；2q3:百分之75分位数表6gp73测量结果的描述性分析(pps)说明:1q1:百分之25分位数；2q3:百分之75分位数诊断准确性评价与金标准比较，描述考核试剂的灵敏度、特异度、符合率等，给出相应灵敏度和特异度的95％可信区间，灵敏度和特异度与目标值的比较用z检验。并采用roc曲线分析考核试剂的诊断界值和诊断准确性。该分析在fas和pps两个数据集进行。从下表可见，考核试剂的roc曲线下面积为0.926，有较好诊断价值。在最佳阈值和3.65ng/ml阈值下的灵敏度为89.50％，显著高于目标值0.75；特异度为95.57％，显著高于目标值0.70。表7考核试剂的roc曲线下面积(pps)auc标准误auc的95％ci下限auc的95％ci上限最佳阈值(mm)0.9260.0090.9090.9443.54*auc：roc曲线下面积表8考核试剂在最佳阈值下的诊断准确性描述(病例分布)(pps)表9考核试剂在最佳阈值下的诊断准确性指标(pps)指标灵敏度特异度符合率kappa系数估计值0.89500.95570.92760.8539标准误0.01250.00780.00720.014595％ci下限0.87050.94040.91350.825595％ci上限0.91950.97090.94170.8823与目标值的比较-z11.600032.7821--与目标值的比较-p<0.0001<0.0001--表10考核试剂在3.65ng/ml阈值下的诊断准确性描述(病例分布)(pps)表11考核试剂在3.65ng/ml阈值下的诊断准确性指标(pps)指标灵敏度特异度符合率kappa系数估计值0.89500.95570.92760.8539标准误0.01250.00780.00720.014595％ci下限0.87050.94040.91350.825595％ci上限0.91950.97090.94170.8823与目标值的比较-z11.600032.7821--与目标值的比较-p<0.0001<0.0001--结论以上分析表明本发明提供的高尔基体蛋白73试剂盒(酶联免疫法)对人血清中gp73的测定结果有效。该试剂盒达到临床测定要求，可广泛用于临床检测。虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12