一种用于检测肝癌的长非编码RNA基因标志物及其应用的制作方法

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种用于检测肝癌的长链非编码rna基因标志物及其应用。

背景技术：

肝癌是目前临床上最为常见的癌症之一。肝癌每年的死亡率居全世界恶性肿瘤中的第三位，新发病率居全世界恶性肿瘤中的第五位，且肝癌的发生呈现出迅猛增加的趋势。肝癌的发病与病毒感染、非酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、遗传和环境因素等有关。大多数的肝癌患者是在晚期阶段被确诊治疗，所以患者的生存率较低。早诊断、早治疗是提高肝癌患者生存率的关键。

人类基因组中只有少量的基因能够编码蛋白质，而98％的基因虽然可以转录形成rna，但是这些rna无法进一步的最终形成蛋白质，这些基因转录所形成的rna被称之为非编码rna.之前，人们将这些非编码rna视为转录噪音，并没有实际的具体功能。但是，最新的研究显示这些非编码rna具有基因调控功能。长链非编码rna是指长度大于200个碱基的非编码rna，而且其广泛存在于多种组织中，长非编码rna能够参与到细胞发育和代谢等多种生命功能调控途径中，包括基因重组、基因印记、细胞周期调控、染色质修饰、转录、翻译、mrna降解等。现有的研究表明，长链非编码rna的表达差异通常与癌症的发生、发展以及患者的术后恢复有着紧密的联系。一些异常表达的长链非编码rna能够作为癌症的基因诊断靶标，并且可以作为癌症患者早期诊断以及为判断癌症类型提供新的依据。因此，寻找新的肝癌相关lncrna基因标志物，对于实现肝癌患者的早期诊断和治疗具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种与肝癌发生发展相关的基因标志物，通过检测linc01141的表达水平来实现肝癌患者的早期诊断，同时通过利用sirna靶向干扰linc01141来实现肝癌患者的靶向治疗。

为实现上述目的本发明提供了一种长链非编码rna，所述长链非编码rna为linc01141，linc01141的转录本genbank登录号为nr_033887.1。

优选地，所述linc01141的序列如seqidno.1所示。

优选地，所述linc01141在肝癌中高表达。

此外，本发明提供了长链非编码rnalinc01141在制备用于诊断肝癌的试剂盒或芯片中的应用。

此外，本发明提供了长链非编码rnalinc01141在制备用于诊断肝癌的实时荧光定量pcr试剂盒中的应用。

优选地，所述试剂盒包括利用实时荧光定量pcr检测linc01141表达量时使用的引物。

优选地，所述引物的正向序列如seqidno.2所示，所述引物的反向序列如seqidno.3所示。

除此之外，本发明提供了长链非编码rnalinc01141在制备治疗肝癌药物组合物中的应用。

优选地，所述药物组合包含抑制长链非编码rnalinc01141基因表达的sirna。

优选地，所述sirna的正义链如seqidno.6所示，所述sirna的反义链如seqidno.7所示。

优选地，所述药物组合物还包括与所述sirna相配伍的其他药学上可接受的载体和/或辅料，所述药学上可接受的载体和/或包括但不限于粘合剂、稀释剂、表面活性剂、填充剂。

优选地，所述药物组合物的使用途径包括但不限于静脉内、口服、肌肉内和皮下。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种诊断肝癌的分子标志物linc01141，通过检测发现linc01141在肝癌患者肿瘤中高表达，因此通过检测肝癌患者中的linc01141表达能够实现肝癌的早期诊断从而提高肝癌患者生存率，而且本发明所提供的linc01441基因标志物具有优异的诊断价值。

其次，本发明提供一种linc01141的sirna在制备肝癌药物组合物中的应用，该药物组合物可以用作新的治疗肝癌患者的治疗药物，具有重要的临床价值和应用前景。

附图说明

图1linc01141在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况。

图2linc01141在肝癌组织和癌旁组织中表达情况的roc曲线。

图3转染linc01141的sirna对于肝癌hepg2细胞中linc01141的表达影响情况。

图4干扰linc01141对于肝癌细胞hepg2细胞增殖的影响情况。

图5干扰linc1141对于肝癌细胞增殖相关蛋白cyclin-d1和c-myc的影响情况。

具体实施方法

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。如无特别说明，本发明所涉及的技术均为分子生物学或细胞生物学常规技术手段，其中涉及的酶、试剂以及反应条件均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。

实施例1

检测linc01141在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况

1.研究对象

选取20例肝癌组织以及相应的癌旁组织进行实验，组织来源于青岛市肿瘤医院，所有组织标本均通过医院伦理委员会审查和批准，所有组织标本来源患者均签署知情同意书。肝癌组织经病理检测证实为肝癌(肝癌组织切除时，患者尚未进行化疗，放疗等治疗)。

具体标本如下：

2.组织rna提取

(1)从-80℃冰箱中取出组织标本，取约50mg组织标本放入到研钵中，加入少量的液氮，迅速的进行研磨，待组织变软后，再次加入少量液氮进行研磨，重复三次；

(2)加入1mltrizol，使用自动匀浆器匀浆2分钟，匀浆结束后，将组织标本转移至离心管中，室温放置5min；

(3)12000rpm离心5min，取上清，去除沉淀；

(4)加入0.2ml氯仿，震荡混匀后，室温放置15分钟；

(5)4℃12000rpm离心15min；

(6)取上清转移至另一个离心管中，加入等体积预冷的异丙醇混匀，混匀后冰上静置8分钟；

(7)4℃12000rpm离心10分钟，去除上清，保留沉淀；

(8)在沉淀中加入1ml75％乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀；

(9)4℃8000rpm离心5分钟，使用移液器小心的去除上清；

(10)室温静置10分钟干燥rna，之后使用50μldepc水溶解沉淀；

(11)使用微量紫外分光光度计测定组织总rna的纯度和浓度。

3.逆转录获取cdna

(1)去除基因组dna

反应条件：42℃2分钟，4℃。

(2)逆转录反应

反应条件：37℃15分钟，85℃5秒，4℃。

4.荧光定量pcr检测

反应条件：95℃10min；95℃15s，60℃30s40个循环；75℃60s。采用2^-△△ct方法处理实时定量pcr数据，计算linc01141的表达变化。

5.引物序列

linc01141引物为forward5’-cttcccttcatccttgccgt-3’(seqidno.2)

reverse5’-ttacgagtgtggactgtggc-3’(seqidno.3)

gapdh引物序列为forward5’-acaactttggtatcgtggaagg-3’(seqno:4)

reverse5’-gccatcacgccacagtttc-3’(seqno:5)

4.结果

荧光定量pcr的结果表明(图1)，相较于癌旁组织，linc01141在肝癌组织中的相对表达量为3.56±0.32，显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义(p＜0.05)，说明linc01141能够作为肝癌诊断的基因标志物。

绘制linc01141mrna表达水平的roc曲线，结果如图2所示。linc01141的acu值为0.9125(std.error0.04757；95％confidenceinterval0.8192-1.006；p＜0.0001)，说明linc01141差异表达分析对于肝癌的诊断具有优异的价值。

实施例2

linc01141基因的敲减

1.sirna设计

si-rna-1

5’-auuuugcagaucuaucauccu-3’(seqidno.6)

5’-gaugauagaucugcaaaauuc-3’(seqidno.7)

si-rna-2

5’-aucaaguaucuauaugugcca-3’(seqidno.8)

5’-gcacauauagauacuugauac-3’(seqidno.9)

si-rna-1和si-rna-2由上海吉玛公司合成，si-nc由公司提供。

2.细胞培养

人肝癌细胞hepg2采用高糖dmem培养液培养(10％胎牛血清)，培养条件：细胞恒温培养箱37℃，5％co2。

3.sirna转染

(1)转染前一天将2×10⁵的hepg2细胞接种到6孔细胞培养板上，37℃，5％co2培养箱中培养24h后，参照lipofectamine2000说明书对细胞进行转染；

(2)实验分组为对照组(空转染lipofectamine2000)，si-nc组，si-rna-1组和si-rna-2组。

4.荧光定量pcr检测敲减后的linc01141基因表达情况

(1)细胞总rna提取

在6孔细胞培养板每孔中，加入500μltrizol，室温放置5分钟，充分裂解后，转移至离心管中；

剩余步骤与实施例1组织rna提取步骤相同(相应添加量按比例缩减)。

(2)逆转录反应步骤和条件与实施例1相同。

(3)荧光定量pcr检测步骤和条件与实施例1相同。

5.结果

通过图3可以看出，与对照组相比，si-nc的linc01141mrna表达量无明显变化。而，si-rna-1组和si-rna-2组与对照组相比，linc01141表达水平均出现显著降低(p<0.05)，说明本发明所设计合成的si-rna-1和si-rna-2能够抑制linc01141的表达，其中，sirna-1(抑制率86％)的抑制效果更好，因此本发明选用si-rna-1进行后续试验。

实施例3

1.细胞增殖实验

(1)将5×10³个分别转染si-nc、si-rna-1的hepg2细胞接种于96孔板中，每孔90μl，每组设置3个复孔，置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养；

(2)分别在24h、48h、72h进行检测，检测时，每孔中加入10ulcck-8检测液，之后置于37℃，5％co2培养箱中孵育4小时；

(3)将细胞培养板置于酶标仪中，450nm处检测吸光值，绘制生长曲线。

2.结果

通过图4可以看出，实验组在转染si-rna-1之后，相较于si-nc组，hepg2细胞的增殖受到抑制，增殖速率明显降低，在72h时，si-nc组的od值为1.09±0.049，si-rna-1组的od值为0.766±0.041，差异具有统计学意义，说明通过sirna-1敲减linc01141可以有效的抑制肝癌细胞的增殖。

实施例3westernblot检测干扰linc01141对于细胞增殖相关基因的影响

(1)转染前一天将2×10⁵的hepg2细胞接种到6孔培养板上，37℃，5％co2细胞培养箱中培养24h后，参照lipofectamine2000说明书对细胞进行转染，实验分组为si-nc组，si-rna-1组；

(2)转染48h后，pbs洗涤细胞后，每孔加入100μlripa细胞裂解液；

(3)充分裂解后，转移至离心管中，10000g/min，4℃离心10分钟，取上清至新的离心管；

(4)吸取2μl，使用bca法进行蛋白定量，加入5×上样缓冲液，沸水煮5分钟；

(5)12000r/min离心5分钟，得到制备好的蛋白样品；

(6)组装好电泳槽，配置5％上层胶和12％下层胶；

(7)每孔加入20μg蛋白样品和蛋白marker指示剂；

(8)电泳槽加入新配置的电泳缓冲液，按照上层胶电压80v，下层胶120v条件下开始电泳，待溴酚蓝指示剂移至胶底时，结束电泳；

(9)组装转膜夹子，装入倒满转移液的转移槽中，200ma，转膜1.5h；

(10)将转膜后的pvdf膜转移至5％的脱脂奶粉中，室温，封闭1h；

(11)tbst洗膜3次，每次5min，孵育β-actin，c-myc，cyclin-d1一抗稀释液，4℃摇床孵育过夜；

(12)tbst洗膜3次，每次5min，孵育二抗，室温，摇床孵育1h；

(13)暗室中，快速将发光液滴加至pvdf膜上，进行显像。

实验结果如图4所示，相较于si-nc组，干扰linc01141的si-rna-1组的cyclin-d1和c-myc表达量显著下调，说明抑制linc01141可以有效的抑制肝癌细胞hepg2增殖相关蛋白的表达，进一步验证了通过sirna-1敲减linc01141可以有效的抑制肝癌细胞的增殖。

综上所述，本发明提供的linc01141的sirna-1可以用于制备治疗肝癌药物组合物。

序列表

<110>青岛思拓新源细胞医学有限公司

<120>一种用于检测肝癌的长非编码rna基因标志物及其应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3799

<212>dna

<213>人源(human)

<400>1

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