菌液直接PCR检测摩根氏菌的方法与流程

本发明涉及细菌分子生物学检测技术领域，具体涉及一种菌液直接pcr检测摩根氏菌的方法。

背景技术：

摩氏摩根菌(morganellamorganii)属于摩根菌属，摩根菌属只有摩氏摩根菌一个种。摩氏摩根菌呈革兰氏阴性，直杆菌，条件性致病菌。在普通琼脂平板，麦康凯琼脂平板和肉汤培养基中均可生长。普通琼脂平板上为光滑、湿润、边缘整齐的圆形菌落。该菌株葡萄糖、甘露糖、苯丙氨酸、尿素酶、鸟氨酸阳性，鼠李糖、乳糖、蔗糖、蕈糖、麦芽糖、甘露醇、肌醇、vp为阴性。对于丁胺卡那高度敏感，对头孢曲松，呋喃唑酮为中度敏感，对恩诺沙星、环丙沙星、利福平为耐药。一般存在于人和动物的粪便、尿道和伤口中，能够引起伤口和泌尿道感染，严重者现已出现死亡病例的报道。

近年来，由摩氏摩根菌引起的感染呈逐渐增加的趋势，但摩氏摩根菌难以进行分离，其临床分离率在国内仅为革兰氏阴性菌的0.5％，因此，目前对于摩氏摩根菌的研究还比较少。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种菌液直接pcr检测摩根氏菌的方法。该方法能够实现对摩根氏菌的快速、灵敏和特异性检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一组引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示；具体如下：

f：5’-atgcattatgatacccatcaga-3’；(seqidno.1)

r：5’-tcattcacccttatgaaaga-3’；(seqidno.2)

本发明的第二方面，提供上述引物对在制备检测摩根氏菌的试剂或试剂盒中的应用。

本发明的第三方面，提供一种检测摩根氏菌的试剂盒，所述试剂盒中含有上述的引物对。

进一步的，所述试剂盒中还包括：pcrmix和ddh2o。

本发明的第四方面，提供上述试剂盒在如下(1)或(2)中的应用：

(1)对摩根氏菌进行耐药性研究；

(2)开发治疗摩根氏菌引起的感染的药物。

本发明的第五方面，提供一种利用上述试剂盒检测摩根氏菌的方法，包括如下步骤：

从待测样本中提取细菌并制备成菌悬液，以菌悬液作为模板，构建pcr反应体系进行pcr扩增；将pcr扩增产物进行凝胶电泳检测，若扩增出857bp的条带，则表明待测样本中含有摩根氏菌；若扩增不出857bp的条带，则表明待测样本中不含有摩根氏菌。

优选的，从待测样本中提取细菌并制备成菌悬液的方法为：将待测样本用无菌水稀释，过滤，将滤液进行离心处理，离心转速为3000r/min，离心时间为5min，离心后弃去上清，用无菌pbs缓冲液重悬。

优选的，所述菌悬液的od值为0.1-0.15。

优选的，所述pcr反应体系包括：pcrmix25μl，菌悬液5μl，seqidno.1所示的引物1μl，seqidno.2所示的引物1μl，ddh2o18μl。

优选的，pcr扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸90s，32个循环；72℃保温10min。

需要说明的是，上述方法除了用于摩根氏菌的快速检测外，还可以用于该摩根氏菌治疗药物的开发。

本发明的有益效果：

(1)本发明直接以经处理得到的菌悬液为模板对摩根氏菌进行pcr检测，省去了繁琐的dna提取步骤，简化了pcr检测的步骤，节省了人力物力，大大降低了检测成本。

(2)本发明对扩增引物和扩增条件进行了优化设计，克服了菌液直接pcr所容易出现假阳性问题，采用本发明的方法对摩根氏菌进行检测，检测方法的重复性好、灵敏度高，特异性强。

附图说明

图1：本发明检测方法特异性的考察。

图2：本发明检测方法灵敏度的考察。

图3：提取摩根氏菌dna和摩根氏菌菌液直接pcr，获得产物后进行电泳分析；图中，1：通过提取dna进行pcr产物的测定，2：通过菌液直接pcr产物的测定，m：marker。

图4：本发明设计的其他引物的效果考察；其中，m：marker，1-5：摩根氏菌。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语说明：

本发明中所提及的“摩氏摩根菌”、“摩根氏菌”表示的为同一菌，均为摩根菌属的摩氏摩根菌(morganellamorganii)。

正如背景技术所介绍的，由摩氏摩根菌引起的感染成逐渐增加的趋势，但对于摩氏摩根菌的研究还较少，因此对于这种比较难分离的罕见致病菌应予以重视。

pcr技术以其敏感性强、特异性好、检测时间短等特点被广泛应用于许多病原菌的检测。传统的pcr检测方法是：提取待测样品的dna，以其为模板通过设计的引物进行pcr扩增；该方法存在繁琐的dna的提取纯化过程，且常常会导致提取的失败。

菌液pcr因为不用提取细菌dna直接进行检测而受到研究人员的关注，但是，一方面，如何从样品中提取纯化能直接用于pcr检测的病原菌仍是目前的技术难点；另一方面，菌液直接pcr不可避免的会存在大量的干扰物质，很容易出现假阳性的检测结果。以上问题制约了菌液直接pcr在细菌检测中的应用。

基于此，本发明对菌液直接pcr进行了深入研究，首次提出了一种菌液直接pcr检测摩根氏菌的方法。其有效解决了现有的菌液pcr所存在的上述问题，同时，为摩氏摩根菌的检测提供了新的方法。

摩氏摩根菌主要存在于人和动物的粪便、尿道和伤口中，因此，摩氏摩根菌所处的环境中存在大量的干扰物质影响pcr检测。

为有效的从待测样本中将摩氏摩根菌提取出来，在本发明的一种实施方案中所给出的方法为：将待测样本用无菌水稀释，过滤，将滤液进行离心处理，离心转速为3000r/min，离心时间为5min，离心后弃去上清，用无菌pbs缓冲液重悬。

本发明研究发现，离心条件是将摩氏摩根菌从待测样本中提取出来的关键，通过离心转速和离心时间的配合，将摩氏摩根菌富集至下层沉淀中。

另外，用无菌pbs缓冲液重悬后制成的菌悬液的od值会影响后续的pcr扩增以及电泳检测的效果，若od值过小，则模板量不足，电泳条带不清晰；若od值过大，则会对pcr起抑制作用，电泳条带出现拖尾。经综合考察发现，菌悬液的od值为0.1-0.15时，pcr反应效率高，电泳条带清晰。

对于菌液直接pcr检测而言，如何设计引物序列是保证检测有效性的关键。不同于常规的pcr检测，以菌液直接作为模板进行pcr扩增，其对扩增引物的特异性和敏感性的要求更高。虽然现有技术中有诸多引物设计的软件和引物设计原则等，但要设计得到特异性强、灵敏度高的引物组合，并非是通过引物设计软件就可以简单获得的，这需要技术人员利用其专业知识不断的选择优化靶标区域，再根据优化的靶标区域进行引物设计，以及对设计的引物进行反复的筛选、优化、再设计。

具体而言，由于本申请所检测的是摩根氏菌，目前对摩根氏菌的研究很少，其临床分离率仅为革兰氏阴性菌的0.5％，对于摩根氏菌的检测而言，如何选择靶标区域进行引物设计目前尚无统一的认知。本发明在试验过程中对引物设计的靶标区域进行了优化，结果发现，以该摩根氏菌基因组中seqidno.3所示的这段序列进行引物设计，所设计的引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示，可以实现对该摩根氏菌菌液pcr的特异性检测，其扩增效果与dna作为模板不相上下。

本发明在试验过程中还优化了pcr条件，一般的菌液直接pcr在pcr扩增之前需要将菌液进行煮沸处理，本发明省去了这一步骤。考虑到变性的不完全，本发明将预变性的时间进行了延长，但若预变性的时间过长又会对taqdna聚合酶的活性产生影响，经综合考虑和反复试验，本发明将预变性的时间确定为5min，该时间既能保证预变性的效果，有能保证taqdna聚合酶的活性不受影响。

由于本发明所设计的引物长度较短，其中gc含量较低，因此，本发明降低了退火处理的温度，经多次试验考察，发现将退火温度设定为50℃，可以大大增加扩增产物的产量。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如j.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；d.l.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。

实施例1：引物的设计与合成

在ncbi上选取多株摩根氏菌的基因组序列，包括：accession号为cp034944.1、cp033056.1、ls483498.1、cp014026.2、cp004345.1、cp032295.1等，使用megalign软件比对并分析其保守序列，确定引物设计的靶标序列，我们选取其中部分保守区域(seqidno.3)进行引物设计。具体如下：

f：5’-atgcattatgatacccatcaga-3’；(seqidno.1)

r：5’-tcattcacccttatgaaaga-3’；(seqidno.2)

本发明在试验过程中，还针对摩根氏菌的其他保守区域设计了多组不同的引物，分别为：

2f:ggacacggttatcaccggac；(seqidno.4)

2r:tcattcacccttatgaaaga。(seqidno.5)

3f:cggatctctctgtgttccggtg；(seqidno.6)

3r:tacgtaccagttccccctgt。(seqidno.7)

本发明针对已知摩根氏菌基因保守序列还设计了以上引物，预计该引物扩增产物长度约为500bp，但实际扩增产物与预计的大小不一致，见图4。可能是引物与靶序列不完全互补、引物聚合形成二聚体、退火温度过低、酶量及酶质量、循环次数等原因导致。考虑其导致原因的复杂性及gc含量占比，因此，对于摩根氏菌菌液直接pcr的引物设计是非常关键的。

实施例2：试剂盒的组成、实验参数的优化及特异性、灵敏性和重复性考察

1.试剂盒的组成：

本实施例的试剂盒为菌液直接pcr试剂盒，用于检测摩根氏菌。试剂盒中含有：实施例1设计的seqidno.1所示的上游引物(10μm)，实施例1设计的seqidno.2所示的下游引物(10μm)，pcrmix(2×taqpcrmix)和ddh2o。

以菌液直接作为pcr反应的模板。

2.实验参数的优化：

(1)引物浓度的优化：

引物的浓度是一个影响pcr反应的关键因素，若浓度太低，会致使反应不完全；若引物太多，则会发生错配以及产生非特异性产物的可能性会大大增加。非特异性产物和引物二聚体也多与靶序列竞争dna结合酶、dntp底物，从而使靶序列的扩增量降低。

将不同浓度的正向引物(1μm、5μm、10μm、15μm、20μm和25μm)、不同浓度的反向引物(1μm、5μm、10μm、15μm、20μm和25μm)按体积比1:1混合，进行pcr扩增和凝胶电泳检测，根据电泳条带的质量对引物的浓度进行优选。最终确定本发明的正向引物和反向引物的最优终浓度为0.2μm。

(2)退火温度的优化：

退火温度对pcr反应有一定的影响，温度越高，反应的特异性越强，但是扩增效率则会下降；反之，温度降低，虽然扩增效率有所提高，但是特异性却可能受到影响。

针对本发明所设计的引物长度较短，其中gc含量较低，以及直接以菌液作为模板，对扩增的特异性要求比较高的实际情况，本发明将退火温度依次设定为45℃、47℃、50℃、52℃、54℃、56℃和58℃，进行退火温度的优化。

综合平衡pcr扩增反应的效率和扩增的特异性，将退火温度优选为50℃。

经实验优化后确定的pcr扩增体系及扩增条件为：

pcr反应体系包括：pcrmix25μl，菌悬液5μl，seqidno.1所示的引物1μl，seqidno.2所示的引物1μl，ddh2o18μl；引物的浓度为0.2μm。

pcr扩增的条件为：

a、预变性：94℃、5min；

b、变性：94℃30s；

c、退火：50℃30s；

d、延伸：72℃1min30s；

e、循环：步骤b-d循环32次；

f、保温：72℃10min。

3.试剂盒的特异性、重复性和灵敏性考察

(1)特异性试验

应用该试剂盒，进行该试剂盒的特异性试验，选取摩根氏菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，巴氏杆菌菌液，使用本发明的试剂盒进行pcr扩增，完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测，结果如图1所示，结果发现只有摩根氏菌出现目的条带。

以上试验结果表明，本发明试剂盒的特异性为100％，具有较强的特异性，试剂盒中引物与摩根氏菌特异性结合，与其他种类的细菌都没有交叉反应。

(2)重复性试验

应用该试剂盒，进行该试剂盒的重复性试验。取确定含有摩根氏菌的组织样品，利用试剂盒进行重复性检测，一次实验中三个重复样品相应的变异系数(cv)小于0.5％，说明其具有极高的重复性。

(3)灵敏性试验

(1)挑取摩根氏菌单个菌落，接种于肉汤培养基中混匀，置于37℃摇床，培养过夜，浑浊后即为细菌原液。

(2)取1ml细菌原液，加入装有9ml无菌水试管中，吹打混匀即为10^-1稀释液，以此类推。

(3)每个梯度菌液分别pcr，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。

(4)同时将每个梯度设置3-5个重复，接种于培养基中，进行菌落计数。

试验结果见图2，由图2可以看出，本发明的试剂盒的检测灵敏度可达到10^-11梯度。

实施例3：菌液直接pcr法与dna提取法的评估比较

(1)将2ml体积的菌液进行3000r/min，离心5min，使用dna试剂盒提取法将沉淀物用于摩根氏菌整个dna的提取，洗脱体积为200μl，进行pcr。

(2)菌液直接扩增法，将2ml体积的菌液进行3000r/min，离心5min，弃去上清液，用无菌pbs液重悬，重复三次后，将菌液直接进行pcr。

(3)将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

检测结果如图3所示，由图3可以看出，两种方法都能获得目的产物，且菌液直接扩增方法更简便。

实施例4：实际样品检测

将3份已确认含有摩根氏菌的粪便样品、3份已确认不含有摩根氏菌的粪便样品，分别用8倍重量的无菌水稀释，用0.45μm过滤器过滤掉残渣，滤液3000r/min，离心5min，弃去上清，无菌pbs缓冲液重悬，得到菌悬液，将使菌悬液的od值为0.1，然后采用实施例2的试剂盒进行pcr扩增。将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

结果发现，已确认含有摩根氏菌的粪便样品均扩增出857bp的条带；已确认不含有摩根氏菌的粪便样品均未扩增出857bp的条带，检测结果均与实际结果相一致。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

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