一种深海来源的壳聚糖酶CSN5及其编码基因和应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种深海淤泥来源的壳聚糖酶csn5及其编码基因和应用。

背景技术：

壳聚糖是由自然界中广泛存在的甲壳素脱乙酰化后的产物，大量的研究表明壳聚糖在化工、医药、食品和农业等领域都有广泛的应用。相较于壳聚糖，其降解产物壳寡糖分子量小，可溶于水，具有优越的生物活性，非常容易被人体吸收，也是目前发现的自然界中唯一带正电荷的碱性寡糖，极具开发价值。

目前，降解壳聚糖制备壳寡糖的方法主要有酶降解法、物理和化学降解法。酶降解法因反应过程更易控制。反应条件温和、专一性强、产物相对均一安全性高、环境污染少等优势而广受关注。壳聚糖酶可以催化水解壳聚糖的β-1,4-糖苷键，是专一性水解壳聚糖的酶，广泛分布于细菌、真菌、病毒以及植物等生物群中，在降解壳聚糖多聚物、制备壳寡糖中发挥着重要作用。因此需要不断尝试新的方法来获取具有优异性质的新型壳聚糖酶以满足日益增长的需求。

各种环境中的微生物是新酶和生物活性分子的重要来源，但在微生物多样化的地球中，采用可培养技术能获得的微生物不足1％，这已成为微生物资源开发利用的一个限制性因素。与之相反，占大多数的不可培养微生物(>99％)，代表着生物技术开发应用的巨大基因库。宏基因组学，作为一种不依赖于培养的技术，通过提取特定环境中的所有微生物基因组dna、构建基因组文库，从文库中筛选和发现新的功能基因。宏基因组学的方法已被成功用于多种工业酶类的开发，它避开了微生物分离培养的过程，因此，利用宏基因组学的方法开发挖掘新型壳聚糖酶资源具有广阔的发展前景。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于提供一种壳聚糖酶csn5及其编码基因和应用，所述壳聚糖酶基因csn5来源于深海淤泥宏基因组。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种壳聚糖酶csn5，其氨基酸序列如seqidno:1所示。

本发明还提供编码所述壳聚糖酶csn5的基因csn5，其核苷酸序列如seqidno:2所示。

本发明的另一个目的在于提供一种重组质粒csn5/pet-28a，所述重组质粒csn5/pet-28a含有上述壳聚糖酶csn5的基因csn5。

本发明还提供含有所述重组质粒csn5/pet-28a的基因工程菌株。

进一步，所述的重组质粒csn5/pet-28a表达载体优选为pet28a。

进一步，所述的基因工程菌株由所述的重组质粒csn5/pet-28a转化大肠杆菌e.colibl21(de3)获得。

本发明还提供上述壳聚糖酶csn5用于催化壳聚糖生产壳寡糖的应用。

本发明还提供上述基因工程菌株用于催化壳聚糖生产壳寡糖的应用。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明从深海淤泥中提取了壳聚糖酶基因csn5，其编码的壳聚糖酶csn5的氨基酸序列与genbank中geobacteraceaebacterium来源的肽聚糖结合蛋白具有最高的相似性，为60％。本发明同时构建了该壳聚糖酶csn5的基因csn5的重组质粒csn5/pet-28a及基因工程菌株，所产生的壳聚糖酶csn5具有优良的酶学特性：最适温度为30℃，在20-40℃具有较高活性；最适ph为7，在ph6-7的条件下酶活较高，可以保持60％以上的活性。其反应条件温和，在酶法制备壳寡糖中具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1：壳聚糖酶csn5纯酶sds-page电泳图，m为marker。

图2：温度对纯化的壳聚糖酶csn5酶活力的影响。

图3：ph对纯化的壳聚糖酶csn5酶活力的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域的技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种壳聚糖酶csn5，编码该壳聚糖酶csn5的基因csn5及其应用、含有该基因的重组质粒csn5/pet-28a、含有该重组质粒的基因工程菌株以及该基因工程菌株的应用。

实施例1、来源于深海淤泥壳聚糖酶csn5编码基因的获取

本发明的壳聚糖酶csn5编码基因的获取方法包括如下步骤：

(1)、构建深海淤泥宏基因组文库

构建宏基因组文库的样品来自深海淤泥，按照meta-g-nome^tmdnaisolationkit(epicentre)说明书提取并纯化宏基因组样品dna。

取适量纯化的dna，载体采用copycontrol^tmfosmidlibraryproductionkitwithpcc1fos^tmvector(epicentre)，与其连接后将连接液转入epi300tm-t1re.coli宿主菌中。然后涂布在平板上(含12.5mg/l氯霉素)，37℃过夜培养后用无菌lb洗下平板上的菌落，加甘油(20％，v/v)保存于-80℃。

(2)筛选壳聚糖酶的阳性克隆

将保存的菌液按照适当的稀释倍数涂布在含壳聚糖(0.1％)的培养基上(含12.5mg/l氯霉素)，37℃恒温培养24-48h后，观察菌落周围培养基变化，挑取能形成清晰透明圈的菌株，并重复划线进行活性确认，将获得的阳性菌株命名为1-csn5。

(3)构建亚克隆文库及筛选阳性亚克隆

依据碱裂解法提取筛选到的阳性克隆1-csn5的质粒，并用限制性内切酶sau3ai将其片段化，采用琼脂糖电泳分离，并将大小为2-5kb的dna片段切胶回收。然后与用限制性内切酶bamhi酶切后的质粒pbluescriptiisk(+)片段连接并转入大肠杆菌dh5α中，构建亚克隆文库，筛选方法与如上所述一致，观察菌落周围的透明圈进行挑选，并经划线重复确认，将获得等阳性亚克隆菌株命名为2-csn5。

(4)基因测序及壳聚糖酶csn5的基因序列分析

将筛选得到的阳性亚克隆菌株csn5进行测序，并将测序结果利用ncbi/orffinder进行在线分析，得到一个全长为1116bp的完整开放阅读框，将其命名为csn5，其详细序列如seqidno:2所示。编码蛋白长度为371个氨基酸残基，其氨基酸序列如seqidno:1所示。将该氨基酸序列在genbank中进行同源搜索，与之相似性最高为62％的是一个来源于blastocatelliabacterium的假设蛋白。

(5)壳聚糖酶csn5基因的克隆及重组表达

根据序列分析结果，设计带有酶切位点的引物扩增壳聚糖酶csn5全基因，引物序列如下：

csn5bf：5'cgcggatccatggggtttagctca3'(下划线部分为bamhi酶切位点)；

csn5sr：5'cgagctctcatatcgtctccttta3'(下划线部分为saci酶切位点)。

利用上述引物，将壳聚糖酶csn5的基因进行pcr扩增，然后将产物用限制性内切酶bamhi和saci进行双酶切，酶切产物经纯化后与经相同双酶切过的原核表达载体pet-28a(+)连接，获得含有基因csn5的重组表达质粒csn5/pet-28a，然后将该质粒转入大肠杆菌dh5α中，挑取转化子进行测序验证。

测序结果显示重组质粒插入的片段序列与seqidno:2所述核酸序列完全一致，获得重组大肠杆菌菌株csn5/bl21(de3)。

实施例2、重组壳聚糖酶csn5的表达及纯化

按常规方法将实施例1中的重组质粒csn5/pet-28a转化至大肠杆菌e.colibl21(de3)，获得生产壳聚糖酶csn5的基因工程菌株。

将上述基因工程菌株csn5/bl21(de3)接入lb培养基中，37℃恒温培养至od600达到0.6-0.8时，加入iptg进行诱导(终浓度为0.1mmol/l)，然后在20℃条件下继续培养20h。离心收集菌体(6000*g，10min)，并用生理盐水将菌体洗涤两次后再加入npi-0缓冲液(50mmna2hpo4，0.3mnacl，ph8.0)，制成悬浮液。利用超声破碎，在冰水浴中进行菌体破碎(功率200～400w，工作3s，间隙5s，超声15min)。超声结束后离心收集上清(10000*g，25min)，此即为壳聚糖酶csn5的粗酶液。

采用ni亲和层析柱法纯化重组壳聚糖酶csn5，将所得的壳聚糖酶csn5粗酶液用0.25μm膜过滤后以1ml/min的流速上样至预先用npi-0平衡过的ni-nta柱(1ml，qiagen)上。然后依次用npi-10(50mmna2hpo4，0.3mnacl，10mm咪唑，ph8)和npi-200(50mmna2hpo4，0.3mnacl，200mm咪唑，ph8)洗脱杂蛋白和目的蛋白，并将所获得的含有目的蛋白的洗脱液通过超滤法进行脱盐浓缩，得到纯化的壳聚糖酶csn5，上述所有步骤均在4℃下进行。经sds-page电泳检测蛋白纯度，结果如图1所示，得到电泳纯的壳聚糖酶csn5，分子量约为40kda。

实施例3、重组壳聚糖酶csn5的酶学性质检测

(1)纯化的壳聚糖酶csn5的活性分析

活性测定的方法采用dns法测量还原糖产物的量来进行，具体操作如下：将含有磷酸钠缓冲液(50mm，ph7)，胶体壳聚糖(1％，w/v；85％dda)和适量的壳聚糖酶的反应混合物在30℃下孵育20min，然后将反应液在沸水中淬灭10min。以glcn为标准物，通过测量od520确定上清液中还原糖的量。一个单位(u)的壳聚糖酶活性定义为在上述测定条件下每分钟释放1μmol还原糖的酶的量。所有实验均一式三份进行，并将其平均值和标准偏差值用于分析。测得的壳聚糖酶csn5的活性为1.8u/mg。

(2)温度对纯化的壳聚糖酶csn5酶活力的影响

将所得的壳聚糖酶csn5用磷酸钠缓冲液稀释(100mm，ph3.5)，然后分别在20-60℃下进行酶促反应。以酶活力的最高值作为100％，结果如图2所示。结果显示纯化的壳聚糖酶csn5的最适温度为30℃，在20-40℃具有较高活性。

(3)ph对纯化的壳聚糖酶csn5酶活力的影响

将所得的壳聚糖酶csn5纯酶分别用100mm，ph为4-8的缓冲液稀释(柠檬酸盐缓冲液，ph4-6；磷酸盐缓冲液，ph6-8)，然后在30℃条件下进行酶促反应。以酶活力的最高值作为100％，结果如图3所示。结果表明重组壳聚糖酶csn5的最适ph为7，在ph6-7的条件下酶活较高，可以保持60％以上的活性。

seqidno:1

mgfssseiaaaaaivrvfetgtpagnysevavlndgagisygisqfthrsgslaevvsrylasggvagrdvfasrlpmlrdrsataiakltadrdfrralaaagharemrevqeavaferymlpairacegsgfrlplslaviydsmthgsynkirdrvrvspagkgdfekswitayvrerdawlgsiprlrstryrtrffksriaagrwglelpinvhgalitneilgispdasgksgtaagpnhppqtmqneapqtpttqpaenpqarppvsanevlgrvergferaaesfdrveriglgaanrtdrakslwatvagtvwqtlwaavgllaglprevwlvvaviaavftlaylyrqitlgrlrelketi

seqidno:2

atggggtttagctcatcggagatcgccgcggcggccgcgatcgtccgcgtgtttgagacgggcacgccggcgggcaactacagcgaggtcgcggtgctgaacgacggagccggaatttcatacggcatttcgcagttcacccatcgctcgggttcgctggctgaggtcgtttcgcgttacctcgcgagcggcggcgtcgcgggccgagatgtgttcgcatcgcggctgccgatgcttcgggatcgctcggcaacggccatcgcaaagctcacggcggatcgcgactttcgccgagcacttgccgctgcgggccacgcccgcgagatgcgcgaggtgcaggaggcggtcgcctttgagcggtatatgctcccggcgatccgtgcgtgcgagggctcgggctttcggctgccgctctcgctggccgtcatttacgactcgatgacacacggttcttacaacaagatccgcgaccgcgtgcgggtctcgcctgcaggcaagggcgactttgaaaagagctggatcacggcatacgtccgcgagcgggacgcctggctcggttcgatcccgcggctgcgttcgacgcgatatcggacgcgctttttcaagagccgcatcgcggccgggcgttggggcctcgagcttccgatcaacgttcacggcgctctcattacaaacgaaattcttggcatctcgccggacgcatccggcaagagcggaacggcggccgggccgaaccacccgccacaaacaatgcagaacgaagcacctcaaacacccaccacacaacccgccgaaaaccctcaggcccggccgcctgtttcggcaaatgaggtgctcggccgcgttgagcggggctttgaacgtgcggcggaaagctttgaccgcgtggagcgcatcgggctcggggcggcgaaccgcaccgaccgggcgaagtcgctatgggcaacggtcgcgggcacggtttggcaaacgctttgggcggcggtcggccttctcgccggattgccgcgagaggtctggctggtcgtggcggtcatcgccgccgtcttcacactcgcctatctttaccgccagatcacgctcgggcggctgcgggaactaaaggagacgatatga。

序列表

<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120>一种深海来源的壳聚糖酶csn5及其编码基因和应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>371

<212>prt

<213>壳聚糖酶csn5(1-csn5)

<400>1

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<212>dna

<213>壳聚糖酶csn5基因(1-csn5)

<400>2

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<210>4

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<213>人工序列(artificialsequence)

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