一种基因表达组件及其构建的克隆载体和应用的制作方法

本发明属于分子生物学和基因工程
技术领域：
，涉及一种基因表达组件及其构建的克隆载体和应用，尤其涉及一种编码β-半乳糖苷酶α肽和ω肽的基因表达组件、构建的克隆载体及其构建方法和应用。
背景技术：
：pcr是分子生物学和基因工程领域的重要技术，实验人员经常需要将pcr产物克隆到载体中。目前常用的克隆载体主要基于蓝白斑筛选原理，蓝白斑筛选方法为挑取阳性克隆带来了极大的方便。能够用于蓝白斑筛选的载体含有lacz’基因，该基因能够编码α肽链，在lacz’基因中含有一个用于克隆外源dna的多克隆位点(mcs)。现有的具有蓝白斑筛选功能的载体仅适用于β-半乳糖苷酶缺陷型基因工程菌，这种工程菌的染色体中编码β-半乳糖苷酶的基因发生突变，该突变基因的编码产物(ω肽)与野生型β-半乳糖苷酶相比缺少n段146个氨基酸，因此不具有生物学活性。尽管该β-半乳糖苷酶缺陷型菌株无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但是当菌体中含有带lacz’基因的质粒后，质粒lacz’基因编码的α肽和菌株表达的ω肽发生互补，得到具有β-半乳糖苷酶活性的互补产物，从而使x-gal生成蓝色物质，这种现象称为α-互补。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源dna连接入lacz’载体的mcs后，破坏α肽读码框，重组质粒将不再表达α肽，将它导入β-半乳糖苷酶缺陷型菌株后不产生α-互补，无法产生有β-半乳糖苷酶活性的产物，因而无法分解培养基中的x-gal产生蓝色，培养表型呈现白色菌落。puc系列载体即为常用的蓝白斑筛选载体。然而，现有的具有蓝白斑筛选功能的载体，譬如使用非常广泛的puc系列载体，存在以下缺点：第一，菌株适用范围具有局限性，该种载体仅适用于β-半乳糖苷酶缺陷型基因工程菌，但是在实际应用中经常使用β-半乳糖苷酶未突变的大肠杆菌，如stbl2、stbl3菌株，无法使用蓝白斑表型筛选阳性克隆；第二，每个大肠杆菌含有较低的基因组拷贝数，导致ω肽表达量很低，当菌株转化表达α肽的质粒后，形成的β-半乳糖苷酶含量低，菌株需要较长的时间才会形成明显的蓝斑，显色效率低，影响生产效率和大规模工业化应用；第三，该种载体需要使用含有iptg的平板，但是iptg价格昂贵且对人体有毒性，成本较高，安全性低。因此，有必要提供一种适用菌株广泛的具有蓝白斑筛选功能的质粒，使得蓝斑显色快、并且不需要iptg诱导。技术实现要素：针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种基因表达组件及其构建的克隆载体和应用，所述克隆载体具有蓝白斑筛选功能，几乎适用于所有类型的大肠杆菌，蓝斑显色快，不需要iptg诱导就能够大量表达具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白或多肽，具有重要意义和广泛的应用前景。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种基因表达组件，所述基因表达组件编码β-半乳糖苷酶α肽和ω肽；所述基因表达组件包括组成型启动子，和所述组成型启动子启动表达的laczα基因和laczω基因。本发明中，采用组成型启动子调控laczα基因和laczω基因的表达，使得laczα基因和laczω基因可以在宿主细胞中持续稳定地表达，转录翻译得到的β-半乳糖苷酶α肽和ω肽通过α-互补作用产生具有β-半乳糖苷酶活性的物质，将x-gal分解为蓝色5-溴-4-靛蓝，实现了不需要iptg诱导便产生β-半乳糖苷酶的技术效果，扩大了宿主细胞的适用范围，可以在任何类型的大肠杆菌进行蓝白斑筛选阳性克隆。优选地，所述laczα基因中含有多克隆位点；所述laczα基因和laczω基因之间具有核糖体结合位点。本发明中，laczα基因中的多克隆位点用于插入外源dna，而在laczα基因和laczω基因之间设置核糖体结合位点，则保证了在插入或未插入外源dna的情况下，ω肽均能够正常翻译。优选地，所述组成型启动子包括抗性基因启动子，优选为bla启动子(即amp抗性基因启动子)。优选地，所述laczα基因包括seqidno:1所示的核酸序列；seqidno:1：atgaccatgctcgagccaagcttgcatgcaggcctctgcagtcgacgggcccgggatccgatatctagatgcattcgcgaggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttaacagcctggcggtggtgctgcaacgccgcgattgggaaaatccgggcgtgacccaactgaaccgcctggcggcgcatccgccgtttgcgagctggcgcaacagcgaagaagcgcgcaccgaccgcccgagccagcaactgcgcagcctgaacggcgaatggcgcctgatgcgctattttctgctgacccatctgtgcggcattagccatcgcatttggtgtaccctgagcaccatttgcagcgatgcggcgtag。优选地，所述laczω基因包括seqidno:2所示的核酸序列；seqidno:2：atgaccatgattacggattcactggccgtcgtggcccgtaccgatcgtccgagccagcaactgcgcagtctgaatggcgaatggcgttttgcatggttcccggcacccgaagcagttcccgaaagctggctggaatgtgatttacccgaagcagacacagttgtggttccgagtaactggcagatgcatggctatgacgcccctatctacacaaacgtgacctaccctatcacagtgaacccgccgtttgtgccgaccgaaaacccgaccggttgctactctttaaccttcaatgttgacgagagctggctgcaagagggccagacccgtattatcttcgacggcgtgaacagtgcatttcatttatggtgcaacggtcgttgggttggttacggccaagacagccgtctgcctagtgaatttgatctgagcgcctttctgcgcgctggtgagaatcgtttagcagttatggttttacgctggagcgatggtagttatttagaagatcaagatatgtggcgcatgagcggcattttccgtgacgttagtctgctgcataagcctaccacccagattagcgactttcacgtggccacacgctttaacgacgatttcagccgcgccgttttagaagccgaagttcagatgtgtggcgaactgcgcgactatctgcgcgttacagttagtctgtggcaaggtgagacccaagtggccagcggtacagccccttttggtggcgagatcattgacgaacgcggcggctatgcagaccgtgtgacactgcgtttaaacgtggaaaatccgaaactgtggagtgccgagattcctaatttataccgtgcagttgttgagctgcataccgccgatggtacactgatcgaagcagaggcatgtgatgtgggcttccgtgaggttcgcattgagaacggcttactgctgctgaacggtaaaccgctgctgatccgcggtgtgaaccgccacgagcatcacccgttacatggccaagttatggacgagcaaaccatggtgcaagatattttactgatgaagcaaaacaatttcaatgcagtgcgctgtagccattatccgaatcacccgctgtggtatactttatgcgaccgctatggtctgtacgtggtggacgaggccaacattgaaacccatggcatggtgccgatgaaccgcttaacagacgaccctcgctggctgccggcaatgagtgagcgcgttacccgcatggtgcagcgtgaccgtaaccatccgagcgtgattatttggtctttaggtaacgagagcggtcatggtgcaaaccacgacgccttataccgctggatcaagagcgtggacccgagccgtcccgttcaatacgaaggtggcggcgccgataccaccgcaaccgacattatctgtcctatgtacgcccgcgttgatgaagatcaaccgttcccggccgttccgaaatggagtatcaagaagtggttatctttaccgggcgaaacacgcccgctgatcttatgtgagtatgcccatgccatgggcaatagtctgggcggcttcgccaagtattggcaagccttccgccaatatccgcgtttacaaggtggttttgtgtgggattgggttgaccagtctttaatcaagtacgacgagaacggcaatccgtggagtgcctacggtggtgatttcggcgataccccgaacgatcgccagttttgcatgaacggtttagttttcgccgatcgcaccccgcaccccgctctgaccgaagccaagcatcagcagcagttcttccagttccgtctgagcggccaaacaatcgaagtgacaagtgagtatttattccgccacagtgacaacgaactgctgcattggatggtggctttagacggtaaacctttagccagcggcgaggtgccgttagatgttgccccgcaaggtaaacagctgattgaactgccggagctgccgcaacccgaaagcgctggtcagctgtggctgaccgttcgtgtggttcaaccgaatgcaacagcatggagtgaagccggtcatattagcgcatggcagcagtggcgtttagccgaaaatctgagtgttactttaccggcagcaagccatgccattccgcatctgacaaccagcgagatggacttctgcattgaactgggtaataaacgttggcagtttaaccgtcaaagcggctttctgagtcagatgtggatcggcgacaagaagcagctgctgacaccgttacgtgatcagttcacccgcgcacctctggataacgatattggcgttagcgaggccacccgtatcgacccgaatgcttgggtggagcgttggaaagcagccggtcactatcaagctgaggccgctttactgcagtgtacagccgacacactggccgacgcagtgttaattaccaccgcccatgcatggcagcatcaaggcaagaccttattcattagccgtaagacctatcgtattgacggcagcggccagatggccattacagttgacgtggaagttgccagtgatacccctcacccggcacgcatcggtctgaattgtcagctggcacaagttgccgagcgtgttaactggctgggtttaggtccgcaagaaaattacccggatcgtttaacagcagcttgttttgatcgttgggatctgccgctgagcgacatgtacacaccgtacgtgtttccgagtgagaatggtttacgctgcggcacccgtgaactgaattatggcccgcatcagtggcgtggcgactttcagttcaatatcagtcgctacagtcagcagcagctgatggagaccagtcatcgccatttactgcacgcagaagagggcacttggctgaatattgacggcttccacatgggtatcggcggtgatgacagctggagtccgagtgttagcgccgaatttcagctgagtgccggtcgctaccattatcagctggtttggtgccaaaaataa。本发明中，以野生型laczα基因和laczω基因作为优化对象，按照大肠杆菌的密码子偏好性，选择使用频率最高的密码子，重新设计编码序列，并进一步优化编码序列，优化5’utr的二级结构，得到seqidno:1所示的laczα基因和seqidno:2所示的laczω基因，显著提高了α肽和ω肽的表达量，增强了显色效果和显色速度，缩短了显色时间。优选地，所述基因表达组件包括seqidno:3所示的核酸序列；seqidno:3：tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaattatttttggcaccaaaccagctgataatggtagcgaccggcactcagctgaaattcggcgctaacactcggactccagctgtcatcaccgccgatacccatgtggaagccgtcaatattcagccaagtgccctcttctgcgtgcagtaaatggcgatgactggtctccatcagctgctgctgactgtagcgactgatattgaactgaaagtcgccacgccactgatgcgggccataattcagttcacgggtgccgcagcgtaaaccattctcactcggaaacacgtacggtgtgtacatgtcgctcagcggcagatcccaacgatcaaaacaagctgctgttaaacgatccgggtaattttcttgcggacctaaacccagccagttaacacgctcggcaacttgtgccagctgacaattcagaccgatgcgtgccgggtgaggggtatcactggcaacttccacgtcaactgtaatggccatctggccgctgccgtcaatacgataggtcttacggctaatgaataaggtcttgccttgatgctgccatgcatgggcggtggtaattaacactgcgtcggccagtgtgtcggctgtacactgcagtaaagcggcctcagcttgatagtgaccggctgctttccaacgctccacccaagcattcgggtcgatacgggtggcctcgctaacgccaatatcgttatccagaggtgcgcgggtgaactgatcacgtaacggtgtcagcagctgcttcttgtcgccgatccacatctgactcagaaagccgctttgacggttaaactgccaacgtttattacccagttcaatgcagaagtccatctcgctggttgtcagatgcggaatggcatggcttgctgccggtaaagtaacactcagattttcggctaaacgccactgctgccatgcgctaatatgaccggcttcactccatgctgttgcattcggttgaaccacacgaacggtcagccacagctgaccagcgctttcgggttgcggcagctccggcagttcaatcagctgtttaccttgcggggcaacatctaacggcacctcgccgctggctaaaggtttaccgtctaaagccaccatccaatgcagcagttcgttgtcactgtggcggaataaatactcacttgtcacttcgattgtttggccgctcagacggaactggaagaactgctgctgatgcttggcttcggtcagagcggggtgcggggtgcgatcggcgaaaactaaaccgttcatgcaaaactggcgatcgttcggggtatcgccgaaatcaccaccgtaggcactccacggattgccgttctcgtcgtacttgattaaagactggtcaacccaatcccacacaaaaccaccttgtaaacgcggatattggcggaaggcttgccaatacttggcgaagccgcccagactattgcccatggcatgggcatactcacataagatcagcgggcgtgtttcgcccggtaaagataaccacttcttgatactccatttcggaacggccgggaacggttgatcttcatcaacgcgggcgtacataggacagataatgtcggttgcggtggtatcggcgccgccaccttcgtattgaacgggacggctcgggtccacgctcttgatccagcggtataaggcgtcgtggtttgcaccatgaccgctctcgttacctaaagaccaaataatcacgctcggatggttacggtcacgctgcaccatgcgggtaacgcgctcactcattgccggcagccagcgagggtcgtctgttaagcggttcatcggcaccatgccatgggtttcaatgttggcctcgtccaccacgtacagaccatagcggtcgcataaagtataccacagcgggtgattcggataatggctacagcgcactgcattgaaattgttttgcttcatcagtaaaatatcttgcaccatggtttgctcgtccataacttggccatgtaacgggtgatgctcgtggcggttcacaccgcggatcagcagcggtttaccgttcagcagcagtaagccgttctcaatgcgaacctcacggaagcccacatcacatgcctctgcttcgatcagtgtaccatcggcggtatgcagctcaacaactgcacggtataaattaggaatctcggcactccacagtttcggattttccacgtttaaacgcagtgtcacacggtctgcatagccgccgcgttcgtcaatgatctcgccaccaaaaggggctgtaccgctggccacttgggtctcaccttgccacagactaactgtaacgcgcagatagtcgcgcagttcgccacacatctgaacttcggcttctaaaacggcgcggctgaaatcgtcgttaaagcgtgtggccacgtgaaagtcgctaatctgggtggtaggcttatgcagcagactaacgtcacggaaaatgccgctcatgcgccacatatcttgatcttctaaataactaccatcgctccagcgtaaaaccataactgctaaacgattctcaccagcgcgcagaaaggcgctcagatcaaattcactaggcagacggctgtcttggccgtaaccaacccaacgaccgttgcaccataaatgaaatgcactgttcacgccgtcgaagataatacgggtctggccctcttgcagccagctctcgtcaacattgaaggttaaagagtagcaaccggtcgggttttcggtcggcacaaacggcgggttcactgtgatagggtaggtcacgtttgtgtagataggggcgtcatagccatgcatctgccagttactcggaaccacaactgtgtctgcttcgggtaaatcacattccagccagctttcgggaactgcttcgggtgccgggaaccatgcaaaacgccattcgccattcagactgcgcagttgctggctcggacgatcggtacgggccacgacggccagtgaatccgtaatcatggtcatatttacctcctctactttttgttttgttgccatggattggaagtatcctctacgccgcatcgctgcaaatggtgctcagggtacaccaaatgcgatggctaatgccgcacagatgggtcagcagaaaatagcgcatcaggcgccattcgccgttcaggctgcgcagttgctggctcgggcggtcggtgcgcgcttcttcgctgttgcgccagctcgcaaacggcggatgcgccgccaggcggttcagttgggtcacgcccggattttcccaatcgcggcgttgcagcaccaccgccaggctgttaacgacggccagtgaattcgagctcggtacctcgcgaatgcatctagatatcggatcccgggcccgtcgactgcagaggcctgcatgcaagcttggctcgagcatggtcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattatcagtcggg。第二方面，本发明提供了一种克隆载体，所述克隆载体包括第一方面所述的基因表达元件。优选地，所述克隆载体还包括大肠杆菌复制子，优选为pbr322复制子。优选地，所述pbr322复制子包括seqidno:4所示的核酸序列；seqidno:4：ctgacgtctaagaaaccattatcagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaact。优选地，所述克隆载体还包括抗生素抗性基因。优选地，所述抗生素抗性基因包括卡那霉素抗性基因。优选地，所述卡那霉素抗性基因包括seqidno:5所示的核酸序列；seqidno:5：aaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccagggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatctatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacc。优选地，所述克隆载体包括seqidno:6所示的核酸序列；seqidno:6：tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaattatttttggcaccaaaccagctgataatggtagcgaccggcactcagctgaaattcggcgctaacactcggactccagctgtcatcaccgccgatacccatgtggaagccgtcaatattcagccaagtgccctcttctgcgtgcagtaaatggcgatgactggtctccatcagctgctgctgactgtagcgactgatattgaactgaaagtcgccacgccactgatgcgggccataattcagttcacgggtgccgcagcgtaaaccattctcactcggaaacacgtacggtgtgtacatgtcgctcagcggcagatcccaacgatcaaaacaagctgctgttaaacgatccgggtaattttcttgcggacctaaacccagccagttaacacgctcggcaacttgtgccagctgacaattcagaccgatgcgtgccgggtgaggggtatcactggcaacttccacgtcaactgtaatggccatctggccgctgccgtcaatacgataggtcttacggctaatgaataaggtcttgccttgatgctgccatgcatgggcggtggtaattaacactgcgtcggccagtgtgtcggctgtacactgcagtaaagcggcctcagcttgatagtgaccggctgctttccaacgctccacccaagcattcgggtcgatacgggtggcctcgctaacgccaatatcgttatccagaggtgcgcgggtgaactgatcacgtaacggtgtcagcagctgcttcttgtcgccgatccacatctgactcagaaagccgctttgacggttaaactgccaacgtttattacccagttcaatgcagaagtccatctcgctggttgtcagatgcggaatggcatggcttgctgccggtaaagtaacactcagattttcggctaaacgccactgctgccatgcgctaatatgaccggcttcactccatgctgttgcattcggttgaaccacacgaacggtcagccacagctgaccagcgctttcgggttgcggcagctccggcagttcaatcagctgtttaccttgcggggcaacatctaacggcacctcgccgctggctaaaggtttaccgtctaaagccaccatccaatgcagcagttcgttgtcactgtggcggaataaatactcacttgtcacttcgattgtttggccgctcagacggaactggaagaactgctgctgatgcttggcttcggtcagagcggggtgcggggtgcgatcggcgaaaactaaaccgttcatgcaaaactggcgatcgttcggggtatcgccgaaatcaccaccgtaggcactccacggattgccgttctcgtcgtacttgattaaagactggtcaacccaatcccacacaaaaccaccttgtaaacgcggatattggcggaaggcttgccaatacttggcgaagccgcccagactattgcccatggcatgggcatactcacataagatcagcgggcgtgtttcgcccggtaaagataaccacttcttgatactccatttcggaacggccgggaacggttgatcttcatcaacgcgggcgtacataggacagataatgtcggttgcggtggtatcggcgccgccaccttcgtattgaacgggacggctcgggtccacgctcttgatccagcggtataaggcgtcgtggtttgcaccatgaccgctctcgttacctaaagaccaaataatcacgctcggatggttacggtcacgctgcaccatgcgggtaacgcgctcactcattgccggcagccagcgagggtcgtctgttaagcggttcatcggcaccatgccatgggtttcaatgttggcctcgtccaccacgtacagaccatagcggtcgcataaagtataccacagcgggtgattcggataatggctacagcgcactgcattgaaattgttttgcttcatcagtaaaatatcttgcaccatggtttgctcgtccataacttggccatgtaacgggtgatgctcgtggcggttcacaccgcggatcagcagcggtttaccgttcagcagcagtaagccgttctcaatgcgaacctcacggaagcccacatcacatgcctctgcttcgatcagtgtaccatcggcggtatgcagctcaacaactgcacggtataaattaggaatctcggcactccacagtttcggattttccacgtttaaacgcagtgtcacacggtctgcatagccgccgcgttcgtcaatgatctcgccaccaaaaggggctgtaccgctggccacttgggtctcaccttgccacagactaactgtaacgcgcagatagtcgcgcagttcgccacacatctgaacttcggcttctaaaacggcgcggctgaaatcgtcgttaaagcgtgtggccacgtgaaagtcgctaatctgggtggtaggcttatgcagcagactaacgtcacggaaaatgccgctcatgcgccacatatcttgatcttctaaataactaccatcgctccagcgtaaaaccataactgctaaacgattctcaccagcgcgcagaaaggcgctcagatcaaattcactaggcagacggctgtcttggccgtaaccaacccaacgaccgttgcaccataaatgaaatgcactgttcacgccgtcgaagataatacgggtctggccctcttgcagccagctctcgtcaacattgaaggttaaagagtagcaaccggtcgggttttcggtcggcacaaacggcgggttcactgtgatagggtaggtcacgtttgtgtagataggggcgtcatagccatgcatctgccagttactcggaaccacaactgtgtctgcttcgggtaaatcacattccagccagctttcgggaactgcttcgggtgccgggaaccatgcaaaacgccattcgccattcagactgcgcagttgctggctcggacgatcggtacgggccacgacggccagtgaatccgtaatcatggtcatatttacctcctctactttttgttttgttgccatggattggaagtatcctctacgccgcatcgctgcaaatggtgctcagggtacaccaaatgcgatggctaatgccgcacagatgggtcagcagaaaatagcgcatcaggcgccattcgccgttcaggctgcgcagttgctggctcgggcggtcggtgcgcgcttcttcgctgttgcgccagctcgcaaacggcggatgcgccgccaggcggttcagttgggtcacgcccggattttcccaatcgcggcgttgcagcaccaccgccaggctgttaacgacggccagtgaattcgagctcggtacctcgcgaatgcatctagatatcggatcccgggcccgtcgactgcagaggcctgcatgcaagcttggctcgagcatggtcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattatcagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccagggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatctatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtc。本发明中，自5’端起，克隆载体的第146～3127bp的反向互补序列为β-半乳糖苷酶ω肽的编码序列，第3128～3176bp的反向互补序列为核糖体结合位点(rbs)序列，起始laczω翻译，第3177～3542bp的反向互补序列为β-半乳糖苷酶α肽的编码序列，第3445～3533bp为多克隆位点(mcs)序列，第3543～3692bp的反向互补序列为bla启动子序列，第3935～4617bp为pbr322复制子序列，第4712～5527bp的反向互补序列为卡那霉素(kan)的编码序列。本发明中，构建的克隆载体pwizard质粒采用组成型启动子调控laczα基因和laczω基因的表达，使得laczα基因和laczω基因可以在宿主细胞中持续稳定地表达，不需要iptg诱导便产生具有β-半乳糖苷酶活性的物质，可以在任何类型的大肠杆菌中通过蓝白斑筛选阳性克隆；同时，所述克隆载体pwizard质粒属于高拷贝质粒，因此，laczα基因和laczω基因在宿主菌中的拷贝数高，显著提高了宿主细胞对α肽和ω肽的表达量，形成大量的具有β-半乳糖苷酶活性的酶，增强了显色效果和显色速度，缩短了显色时间。第三方面，本发明提供了一种第二方面所述的克隆载体的构建方法，所述构建方法包括：将基因表达组件、pbr322复制子和卡那霉素抗性基因的核酸分子混合，加入核酸外切酶、dna聚合酶和dna连接酶，40～60℃反应0.5～1h，得到闭合的环状双链dna；将所述闭合的环状双链dna转化感受态细胞，挑取单克隆培养后抽提质粒进行测序鉴定，得到所述克隆载体，命名为pwizard质粒。本发明中，基因表达组件、pbr322复制子和卡那霉素抗性基因的核酸分子之间具有30bp的同源重组臂，有利于通过同源重组方法连接成为环状dna。优选地，所述反应温度例如可以是40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃，优选为50℃。优选地，所述反应时间例如可以是0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、0.9h或1h。优选地，所述基因表达组件、pbr322复制子和卡那霉素抗性基因的核酸分子的摩尔比为1:1:1。作为优选技术方案，本发明提供了一种第二方面所述的克隆载体的构建方法，所述构建方法包括：将基因表达组件、pbr322复制子和卡那霉素抗性基因的核酸分子按照摩尔比为1:1:1混合，加入t5核酸外切酶、phusiondna聚合酶和taqdna连接酶，50℃反应0.5～1h，得到闭合的环状双链dna；将所述闭合的环状双链dna转化感受态细胞，挑取单克隆培养后抽提质粒进行测序鉴定，得到所述克隆载体，命名为pwizard质粒。第四方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体为插入有外源基因的第二方面所述的克隆载体。优选地，所述外源基因插入第二方面所述的克隆载体的多克隆位点。第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞的基因组中整合有第一方面所述的基因表达组件，和/或所述宿主细胞包括第二方面所述的克隆载体和/或第四方面所述的重组载体。优选地，所述宿主细胞包括β-半乳糖苷酶野生型基因工程菌和/或β-半乳糖苷酶缺陷型基因工程菌，包括但不限于top10、dh5α、stbl2或stbl3大肠杆菌。第六方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的基因表达组件、第二方面所述的克隆载体、第四方面所述的重组载体或第五方面所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。第七方面，本发明提供了一种外源基因克隆方法，所述方法包括：将外源基因插入第二方面所述的克隆载体的多克隆位点，导入宿主细胞，培养后根据蓝白斑筛选获得表达外源基因的阳性克隆。优选地，所述方法还包括从阳性克隆培养上清或阳性克隆菌体中分离纯化得到蛋白质的步骤。第八方面，本发明提供了一种第一方面所述的基因表达组件、第二方面所述的克隆载体、第四方面所述的重组载体、第五方面所述的宿主细胞或第六方面所述的试剂盒在蛋白质制备中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明的pwizard质粒采用组成型启动子调控laczα基因和laczω基因的表达，使得laczα基因和laczω基因可以在宿主细胞中持续稳定地表达，不需要iptg诱导便产生具有β-半乳糖苷酶活性的物质，可以涂布培养于不含iptg仅含x-gal的平板中，扩大了宿主细胞的适用范围，可以在任何类型的大肠杆菌进行蓝白斑筛选阳性克隆；(2)本发明对野生型laczα基因和laczω基因进行了密码子优化，构建的pwizard质粒在宿主菌中的laczα基因和laczω基因拷贝数远高于基因组拷贝数，显著提高了宿主细胞对α肽和ω肽的表达量，通过α-互补作用提高了具有β-半乳糖苷酶活性的酶的表达量，增强了显色效果和显色速度，缩短了显色时间。附图说明图1为pwizard质粒图谱；图2为puc57质粒转化dh5α菌株、涂布含iptg和x-gal平板；图3为puc57质粒转化top10f’菌株、涂布含iptg和x-gal平板；图4为puc57质粒转化stbl3菌株、涂布含iptg和x-gal平板；图5为pwizard质粒转化dh5α菌株、涂布含x-gal平板；图6为pwizard质粒转化top10f’菌株、涂布含x-gal平板；图7为pwizard质粒转化stbl3菌株、涂布含x-gal平板；图8为pet-30a质粒转化stbl3菌株、涂布含iptg和x-gal平板；图9为pwizard质粒平末端克隆外源dna转化dh5α菌株、涂布含x-gal平板；图10为pwizard质粒平末端克隆外源dna转化stbl3菌株、涂布含x-gal平板；图11为平末端克隆外源dna菌检结果，其中，泳道1-8为dh5α菌检结果，泳道9-16为stbl3菌检结果，泳道m为dnaladder，条带大小分别为100bp、250bp、500bp、750bp、1kb、1.5kb、2kb、3kb和5kb；图12为pwizard质粒粘性末端克隆外源dna转化dh5α菌株、涂布含x-gal平板；图13为pwizard质粒粘性末端克隆外源dna转化stbl3菌株、涂布含x-gal平板；图14为粘性末端克隆外源dna菌检结果，其中，泳道1-8为dh5α菌检结果，泳道9-16为stbl3菌检结果，泳道m为dnaladder，条带大小分别为100bp、250bp、500bp、750bp、1kb、1.5kb、2kb、3kb和5kb。具体实施方式为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。术语解释：lacz基因：广泛应用于基因表达调控研究的一种基因，编码的β-半乳糖苷酶(简称β-gal)是由4个亚基组成的四聚体，可以催化乳糖水解，β-gal稳定性好，用x-gal作底物进行染色时，呈蓝色，便于检测和观察，lacz基因的诸多优点使它成为基因工程实验中的一个常用标记基因，比如常用于转化菌株筛选，β-半乳糖苷酶显色反应选择法，即，蓝白筛选；laczα基因：编码β-半乳糖苷酶(lacz)n端α片段，可以通过α-互补形成具有β-半乳糖苷酶活性的酶，将无色化合物x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷)切割为半乳糖和深蓝色物质5-溴-4-靛蓝；核酸内切酶：水解核酸分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶；pcr技术：即聚合酶链式反应，dna在体外95℃高温时变性为单链，低温(60℃左右)时引物与单链按照碱基互补配对原则进行结合，再将温度调节至dna聚合酶的最适反应温度(72℃左右)，dna聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5’-3’)的方向合成互补链；基于聚合酶制造的pcr仪是一个温控设备，能够在变性温度、复性温度和延伸温度之间很好地控制温度的变化。材料：实施例1pwizard质粒的构建(1)设计并合成seqidno:3所示的基因表达组件bla-α-rbs-ω，序列全长3700bp，其中，自5’端起，第146～3127bp的反向互补序列为laczω基因，编码ω肽，第3128～3176bp的反向互补序列为rbs序列，起始laczω基因的转录翻译，第3177～3542bp的反向互补序列为laczα基因，编码α肽，第3445～3533bp为多克隆位点(mcs)序列，第3543～3692bp的反向互补序列为bla启动子；(2)设计并合成seqidno:4所示的pbr322复制子，序列全长1030bp，自5’端起，第265～947bp为pbr322基因序列；(3)设计并合成seqidno:5所示的kan基因，序列全长1055bp，自5’端起，第42～857bp为kan基因序列；(4)上述三个片段之间具有30bp的同源序列，采用gibsonmastermix(neb)试剂盒进行连接，反应体系为seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5三个基因片段各2μl，灭菌去离子水4μl，gibsonmastermix10μl(含有t5核酸外切酶、phusiondna聚合酶和taqdna连接酶)，反应条件为50℃反应1h，组装形成环状克隆载体，命名为pwizard质粒；(5)反应产物转化dh5α感受态细胞，涂布kan抗性平板；(6)次日挑取数个单克隆，培养后抽提质粒，进行sanger测序，测序正确的质粒即为pwizard质粒，质粒长度为5695bp。如图1所示，pwizard质粒中主要元件的位置分别为：自5’端起，第146～3127bp的反向互补序列为laczω基因，编码ω肽，第3128～3176bp的反向互补序列为rbs序列，起始laczω基因的转录翻译，第3177～3542bp的反向互补序列为laczα基因，编码α肽，第3445～3533bp为多克隆位点(mcs)序列，第3543～3692bp的反向互补序列为bla启动子，第3935～4617bp为pbr322复制子序列，第4712～5527bp的反向互补序列为kan基因序列。实施例2pwizard质粒转化大肠杆菌在非iptg诱导条件下形成蓝斑(1)分别吸取约50ngpwizard质粒加入到top10f’、dh5α、stbl3感受态细胞中，分别吸取约50ngpuc57质粒(金唯智保存)加入到top10f’、dh5α、stbl3感受态细胞中，同时，吸取约50ngpet-30a质粒(金唯智保存)加入到stbl3感受态细胞中；(2)冰浴30min；(3)42℃热激90s，冰浴3min；(4)向感受态细胞中分别加入700μl预热的lb培养基，并于37℃、220rpm的条件下复苏1小时；(5)从转化pwizard质粒的感受态细胞中吸取适量菌液均匀涂布于含x-gal和kan抗性的lb平板上，同时，从转化puc57和pet-30a质粒的感受态细胞中吸取适量菌液均匀涂布于含iptg、x-gal和kan抗性的lb平板上；(6)将平板置于37℃条件下过夜培养。次日观察菌落表型，结果见图2～图8，其中，图2为puc57质粒转化dh5α菌株、涂布含iptg和x-gal平板，图3为puc57质粒转化top10f’菌株、涂布含iptg和x-gal平板，图4为puc57质粒转化stbl3菌株、涂布含iptg和x-gal平板，图5为pwizard质粒转化dh5α菌株、涂布含x-gal平板，图6为pwizard质粒转化top10f’菌株、涂布含x-gal平板，图7为pwizard质粒转化stbl3菌株、涂布含x-gal平板，图8为pet-30a质粒转化stbl3菌株、涂布含iptg和x-gal平板。可以看出，所有平板的克隆均显蓝色，表明pwizard质粒不需要iptg诱导便可以表达具有β-半乳糖苷酶活性的物质，stbl3感受态细胞不适用于普通的需要iptg诱导的蓝白斑筛选载体；此外，与转化puc57质粒的感受态细胞相比，转化pwizard质粒的感受态细胞形成的菌落蓝色更深，说明在相同的培养时间内，转化pwizard质粒的感受态细胞能够表达更多的活性β-半乳糖苷酶，使蓝白斑更易区分，更易于挑取阳性克隆。实施例3使用pwizard质粒平末端克隆外源dna片段(1)以λdna为模板，f-λdna-blunt和r-λdna-blunt为引物进行pcr扩增，pcr扩增体系和扩增程序如表1和表2所示；f-λdna-blunt(seqidno:7)：acgtttgagcagaataaccatgtgg；r-λdna-blunt(seqidno:8)：aaataacgttctccaccgacctctg；表1试剂用量ddh2o75μl5×buffer20μldntp1μlf-λdna-blunt1μlr-λdna-blunt1μlλdna1μlpfu1μl总体积100μl表2(2)pcr反应结束后使用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，目的片段大小600bp，对目的片段进行切胶，采用axygen公司的凝胶回收试剂盒进行回收纯化，采用nanodrop2000测定纯化的dna浓度约120ng/μl；(3)使用ecorv限制性内切酶酶切pwizard质粒，酶切反应体系如表3所示，37℃酶切1小时；表310×buffer(μl)pwizard(μl)ecorv(μl)无菌ddh2o(μl)610(～3μg)341(4)使用axygen公司的凝胶回收试剂盒对酶切产物进行回收纯化，nanodrop2000测定纯化的酶切产物的浓度约20ng/μl；(5)按照表4配制连接反应体系，将纯化的pcr片段与ecorv酶切的pwizard质粒进行连接反应，22℃连接1小时；表410×buffer(μl)线性pwizard质粒(μl)λdna扩增片段(μl)无菌ddh2o(μl)1126(6)分别取5μl连接产物转化dh5α和stbl3感受态细胞，菌液涂布含x-gal和kan抗性的lb平板；(7)置于37℃下过夜培养。次日观察菌落表型，结果见图9～图10，其中，图9为pwizard质粒平末端克隆外源dna转化dh5α菌株、涂布含x-gal平板，图10为pwizard质粒平末端克隆外源dna转化stbl3菌株、涂布含x-gal平板。可以看出，pwizard质粒作为克隆载体不需要iptg诱导便可以形成明显的蓝白斑，表明pwizard质粒适用于stbl3等lacz基因未突变的菌株，可以通过蓝白斑筛选阳性克隆。从平板中随机挑取8个单克隆进行菌落pcr，使用jj-f-pwizard和jj-r-pwizard作为引物，电泳结果如图11所示，其中，泳道1-8为dh5α菌检结果，泳道9-16为stbl3菌检结果，可以看出菌检产物大小约900bp；从每个平板中随机挑取两个阳性克隆进行sanger测序，测序结果显示序列正确；jj-f-pwizard(seqidno:9)：cttcttcgctgttgcgccagctcgc；jj-r-pwizard(seqidno:10)：gtatccgctcatgagacaataaccc。实施例4使用pwizard质粒粘性末端克隆外源dna片段(1)以λdna为模板，f-λdna-sticky和r-λdna-sticky为引物进行pcr扩增，pcr扩增体系和扩增程序如表1和表2所示；f-λdna-sticky(seqidno:11)：ctgaccgcggtacccgtggaacccaccgagtgaaagtgt(下划线为kpni酶切位点)；r-λdna-sticky(seqidno:12)：caatgttgaagcttctgcgtatccagctcactctcaatg(下划线为hindⅲ酶切位点)；(2)pcr反应结束后使用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，目的片段大小约758bp，对目的片段进行切胶，采用axygen公司的凝胶回收试剂盒进行回收纯化，采用nanodrop2000测定纯化的dna浓度约160ng/μl；(3)使用kpni和hindⅲ限制性内切酶酶切回收的pcr产物，酶切反应体系如表5所示，37℃酶切1小时；表510×buffer(μl)纯化的pcr产物(μl)kpni(μl)hindⅲ(μl)无菌ddh2o(μl)4132219(4)使用axygen公司的凝胶回收试剂盒对酶切产物进行回收纯化，nanodrop2000测定纯化的酶切产物的浓度约20ng/μl；(5)使用kpni和hindⅲ限制性内切酶酶切pwizard质粒，酶切反应体系如表6所示，37℃酶切1小时；表610×buffer(μl)pwizard(μl)kpni(μl)hindⅲ(μl)无菌ddh2o(μl)610(～3μg)3338(6)使用axygen公司的凝胶回收试剂盒对酶切产物进行回收纯化，nanodrop2000测定纯化的酶切产物的浓度约15ng/μl；(7)按照表4配制连接反应体系，将纯化的pcr片段与kpni和hindⅲ酶切的pwizard质粒进行连接反应，22℃连接1小时；(8)分别取5μl连接产物转化dh5α和stbl3感受态细胞，菌液涂布含x-gal和kan抗性的lb平板；(9)置于37℃下过夜培养。次日观察菌落表型，结果见图12～图13，其中，图12为pwizard质粒粘性末端克隆外源dna转化dh5α菌株、涂布含x-gal平板，图13为pwizard质粒粘性末端克隆外源dna转化stbl3菌株、涂布含x-gal平板。可以看出，形成的菌落几乎全是白斑，仅有极少数蓝斑出现，极少数蓝斑很可能是由没有被酶切的残留质粒转化形成。从平板中随机挑取8个单克隆进行菌落pcr，使用jj-f-pwizard和jj-r-pwizard作为引物，电泳结果如图14所示，其中，泳道1-8为dh5α菌检结果，泳道9-16为stbl3菌检结果，可以看出菌检产物大小约1kb；从每个平板中随机挑取两个阳性克隆进行sanger测序，测序结果显示序列正确。综上所述，本发明采用组成型启动子调控laczα基因和laczω基因的表达，使得laczα基因和laczω基因可以在宿主细胞中持续稳定地表达，构建的克隆载体具有蓝白斑筛选功能，几乎适用于所有类型的大肠杆菌，蓝斑显色快，不需要iptg诱导就能够大量表达具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白或多肽，具有重要意义和广泛的应用前景。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>苏州金唯智生物科技有限公司<120>一种基因表达组件及其构建的克隆载体和应用<130>20200318<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>366<212>dna<213>人工合成<400>1atgaccatgctcgagccaagcttgcatgcaggcctctgcagtcgacgggcccgggatccg60atatctagatgcattcgcgaggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttaacagcctg120gcggtggtgctgcaacgccgcgattgggaaaatccgggcgtgacccaactgaaccgcctg180gcggcgcatccgccgtttgcgagctggcgcaacagcgaagaagcgcgcaccgaccgcccg240agccagcaactgcgcagcctgaacggcgaatggcgcctgatgcgctattttctgctgacc300catctgtgcggcattagccatcgcatttggtgtaccctgagcaccatttgcagcgatgcg360gcgtag366<210>2<211>2982<212>dna<213>人工合成<400>2atgaccatgattacggattcactggccgtcgtggcccgtaccgatcgtccgagccagcaa60ctgcgcagtctgaatggcgaatggcgttttgcatggttcccggcacccgaagcagttccc120gaaagctggctggaatgtgatttacccgaagcagacacagttgtggttccgagtaactgg180cagatgcatggctatgacgcccctatctacacaaacgtgacctaccctatcacagtgaac240ccgccgtttgtgccgaccgaaaacccgaccggttgctactctttaaccttcaatgttgac300gagagctggctgcaagagggccagacccgtattatcttcgacggcgtgaacagtgcattt360catttatggtgcaacggtcgttgggttggttacggccaagacagccgtctgcctagtgaa420tttgatctgagcgcctttctgcgcgctggtgagaatcgtttagcagttatggttttacgc480tggagcgatggtagttatttagaagatcaagatatgtggcgcatgagcggcattttccgt540gacgttagtctgctgcataagcctaccacccagattagcgactttcacgtggccacacgc600tttaacgacgatttcagccgcgccgttttagaagccgaagttcagatgtgtggcgaactg660cgcgactatctgcgcgttacagttagtctgtggcaaggtgagacccaagtggccagcggt720acagccccttttggtggcgagatcattgacgaacgcggcggctatgcagaccgtgtgaca780ctgcgtttaaacgtggaaaatccgaaactgtggagtgccgagattcctaatttataccgt840gcagttgttgagctgcataccgccgatggtacactgatcgaagcagaggcatgtgatgtg900ggcttccgtgaggttcgcattgagaacggcttactgctgctgaacggtaaaccgctgctg960atccgcggtgtgaaccgccacgagcatcacccgttacatggccaagttatggacgagcaa1020accatggtgcaagatattttactgatgaagcaaaacaatttcaatgcagtgcgctgtagc1080cattatccgaatcacccgctgtggtatactttatgcgaccgctatggtctgtacgtggtg1140gacgaggccaacattgaaacccatggcatggtgccgatgaaccgcttaacagacgaccct1200cgctggctgccggcaatgagtgagcgcgttacccgcatggtgcagcgtgaccgtaaccat1260ccgagcgtgattatttggtctttaggtaacgagagcggtcatggtgcaaaccacgacgcc1320ttataccgctggatcaagagcgtggacccgagccgtcccgttcaatacgaaggtggcggc1380gccgataccaccgcaaccgacattatctgtcctatgtacgcccgcgttgatgaagatcaa1440ccgttcccggccgttccgaaatggagtatcaagaagtggttatctttaccgggcgaaaca1500cgcccgctgatcttatgtgagtatgcccatgccatgggcaatagtctgggcggcttcgcc1560aagtattggcaagccttccgccaatatccgcgtttacaaggtggttttgtgtgggattgg1620gttgaccagtctttaatcaagtacgacgagaacggcaatccgtggagtgcctacggtggt1680gatttcggcgataccccgaacgatcgccagttttgcatgaacggtttagttttcgccgat1740cgcaccccgcaccccgctctgaccgaagccaagcatcagcagcagttcttccagttccgt1800ctgagcggccaaacaatcgaagtgacaagtgagtatttattccgccacagtgacaacgaa1860ctgctgcattggatggtggctttagacggtaaacctttagccagcggcgaggtgccgtta1920gatgttgccccgcaaggtaaacagctgattgaactgccggagctgccgcaacccgaaagc1980gctggtcagctgtggctgaccgttcgtgtggttcaaccgaatgcaacagcatggagtgaa2040gccggtcatattagcgcatggcagcagtggcgtttagccgaaaatctgagtgttacttta2100ccggcagcaagccatgccattccgcatctgacaaccagcgagatggacttctgcattgaa2160ctgggtaataaacgttggcagtttaaccgtcaaagcggctttctgagtcagatgtggatc2220ggcgacaagaagcagctgctgacaccgttacgtgatcagttcacccgcgcacctctggat2280aacgatattggcgttagcgaggccacccgtatcgacccgaatgcttgggtggagcgttgg2340aaagcagccggtcactatcaagctgaggccgctttactgcagtgtacagccgacacactg2400gccgacgcagtgttaattaccaccgcccatgcatggcagcatcaaggcaagaccttattc2460attagccgtaagacctatcgtattgacggcagcggccagatggccattacagttgacgtg2520gaagttgccagtgatacccctcacccggcacgcatcggtctgaattgtcagctggcacaa2580gttgccgagcgtgttaactggctgggtttaggtccgcaagaaaattacccggatcgttta2640acagcagcttgttttgatcgttgggatctgccgctgagcgacatgtacacaccgtacgtg2700tttccgagtgagaatggtttacgctgcggcacccgtgaactgaattatggcccgcatcag2760tggcgtggcgactttcagttcaatatcagtcgctacagtcagcagcagctgatggagacc2820agtcatcgccatttactgcacgcagaagagggcacttggctgaatattgacggcttccac2880atgggtatcggcggtgatgacagctggagtccgagtgttagcgccgaatttcagctgagt2940gccggtcgctaccattatcagctggtttggtgccaaaaataa2982<210>3<211>3700<212>dna<213>人工合成<400>3tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtca60cagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtg120ttggcgggtgtcggggctggcttaattatttttggcaccaaaccagctgataatggtagc180gaccggcactcagctgaaattcggcgctaacactcggactccagctgtcatcaccgccga240tacccatgtggaagccgtcaatattcagccaagtgccctcttctgcgtgcagtaaatggc300gatgactggtctccatcagctgctgctgactgtagcgactgatattgaactgaaagtcgc360cacgccactgatgcgggccataattcagttcacgggtgccgcagcgtaaaccattctcac420tcggaaacacgtacggtgtgtacatgtcgctcagcggcagatcccaacgatcaaaacaag480ctgctgttaaacgatccgggtaattttcttgcggacctaaacccagccagttaacacgct540cggcaacttgtgccagctgacaattcagaccgatgcgtgccgggtgaggggtatcactgg600caacttccacgtcaactgtaatggccatctggccgctgccgtcaatacgataggtcttac660ggctaatgaataaggtcttgccttgatgctgccatgcatgggcggtggtaattaacactg720cgtcggccagtgtgtcggctgtacactgcagtaaagcggcctcagcttgatagtgaccgg780ctgctttccaacgctccacccaagcattcgggtcgatacgggtggcctcgctaacgccaa840tatcgttatccagaggtgcgcgggtgaactgatcacgtaacggtgtcagcagctgcttct900tgtcgccgatccacatctgactcagaaagccgctttgacggttaaactgccaacgtttat960tacccagttcaatgcagaagtccatctcgctggttgtcagatgcggaatggcatggcttg1020ctgccggtaaagtaacactcagattttcggctaaacgccactgctgccatgcgctaatat1080gaccggcttcactccatgctgttgcattcggttgaaccacacgaacggtcagccacagct1140gaccagcgctttcgggttgcggcagctccggcagttcaatcagctgtttaccttgcgggg1200caacatctaacggcacctcgccgctggctaaaggtttaccgtctaaagccaccatccaat1260gcagcagttcgttgtcactgtggcggaataaatactcacttgtcacttcgattgtttggc1320cgctcagacggaactggaagaactgctgctgatgcttggcttcggtcagagcggggtgcg1380gggtgcgatcggcgaaaactaaaccgttcatgcaaaactggcgatcgttcggggtatcgc1440cgaaatcaccaccgtaggcactccacggattgccgttctcgtcgtacttgattaaagact1500ggtcaacccaatcccacacaaaaccaccttgtaaacgcggatattggcggaaggcttgcc1560aatacttggcgaagccgcccagactattgcccatggcatgggcatactcacataagatca1620gcgggcgtgtttcgcccggtaaagataaccacttcttgatactccatttcggaacggccg1680ggaacggttgatcttcatcaacgcgggcgtacataggacagataatgtcggttgcggtgg1740tatcggcgccgccaccttcgtattgaacgggacggctcgggtccacgctcttgatccagc1800ggtataaggcgtcgtggtttgcaccatgaccgctctcgttacctaaagaccaaataatca1860cgctcggatggttacggtcacgctgcaccatgcgggtaacgcgctcactcattgccggca1920gccagcgagggtcgtctgttaagcggttcatcggcaccatgccatgggtttcaatgttgg1980cctcgtccaccacgtacagaccatagcggtcgcataaagtataccacagcgggtgattcg2040gataatggctacagcgcactgcattgaaattgttttgcttcatcagtaaaatatcttgca2100ccatggtttgctcgtccataacttggccatgtaacgggtgatgctcgtggcggttcacac2160cgcggatcagcagcggtttaccgttcagcagcagtaagccgttctcaatgcgaacctcac2220ggaagcccacatcacatgcctctgcttcgatcagtgtaccatcggcggtatgcagctcaa2280caactgcacggtataaattaggaatctcggcactccacagtttcggattttccacgttta2340aacgcagtgtcacacggtctgcatagccgccgcgttcgtcaatgatctcgccaccaaaag2400gggctgtaccgctggccacttgggtctcaccttgccacagactaactgtaacgcgcagat2460agtcgcgcagttcgccacacatctgaacttcggcttctaaaacggcgcggctgaaatcgt2520cgttaaagcgtgtggccacgtgaaagtcgctaatctgggtggtaggcttatgcagcagac2580taacgtcacggaaaatgccgctcatgcgccacatatcttgatcttctaaataactaccat2640cgctccagcgtaaaaccataactgctaaacgattctcaccagcgcgcagaaaggcgctca2700gatcaaattcactaggcagacggctgtcttggccgtaaccaacccaacgaccgttgcacc2760ataaatgaaatgcactgttcacgccgtcgaagataatacgggtctggccctcttgcagcc2820agctctcgtcaacattgaaggttaaagagtagcaaccggtcgggttttcggtcggcacaa2880acggcgggttcactgtgatagggtaggtcacgtttgtgtagataggggcgtcatagccat2940gcatctgccagttactcggaaccacaactgtgtctgcttcgggtaaatcacattccagcc3000agctttcgggaactgcttcgggtgccgggaaccatgcaaaacgccattcgccattcagac3060tgcgcagttgctggctcggacgatcggtacgggccacgacggccagtgaatccgtaatca3120tggtcatatttacctcctctactttttgttttgttgccatggattggaagtatcctctac3180gccgcatcgctgcaaatggtgctcagggtacaccaaatgcgatggctaatgccgcacaga3240tgggtcagcagaaaatagcgcatcaggcgccattcgccgttcaggctgcgcagttgctgg3300ctcgggcggtcggtgcgcgcttcttcgctgttgcgccagctcgcaaacggcggatgcgcc3360gccaggcggttcagttgggtcacgcccggattttcccaatcgcggcgttgcagcaccacc3420gccaggctgttaacgacggccagtgaattcgagctcggtacctcgcgaatgcatctagat3480atcggatcccgggcccgtcgactgcagaggcctgcatgcaagcttggctcgagcatggtc3540atactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcgga3600tacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccga3660aaagtgccacctgacgtctaagaaaccattatcagtcggg3700<210>4<211>1030<212>dna<213>人工合成<400>4ctgacgtctaagaaaccattatcagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaat60cggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcac120tgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggt180aatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggcca240gcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgccc300ccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggact360ataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccct420gccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatag480ctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgca540cgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaa600cccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagc660gaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactag720aagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttgg780tagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagca840gcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtc900tgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaag960gatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatata1020tgagtaaact1030<210>5<211>1055<212>dna<213>人工合成<400>5aaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttagaaaaactcatcgagc60atcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagc120cgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctgg180tatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtca240aaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggc300aaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatca360aaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaat420acgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaac480actgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaat540gctgttttcccagggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaa600tgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatct660gtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggc720ttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccattta780tacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcc840cgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttatt900gttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtaga960aaagatcaaaggatctatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctt1020t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