一种双酶法恒温扩增检测COVID-19的试剂盒和检测方法与流程

本发明属于新型冠状病毒检测领域，具体涉及一种双酶法恒温扩增检测covid-19的试剂盒和检测方法。
背景技术：
：新型冠状病毒covid-19由rna核酸和蛋白等组成，是rna病毒的一种。病毒通过特定细胞表面的受体入侵细胞造成感染，并且利用宿主细胞进行复制增殖。因此可以通过采集人的特定部位细胞样本，检测其中是否含有病毒rna核酸，来确认机体是否受到感染。目前病毒检测的技术有以下几种：1.poct法--crispr等温检测法，该方法分为三步：①对提取的rna进行等温扩增25分钟；②加入cas13蛋白、向导rna和报告分子在37℃条件下温育30分钟；③将试纸条浸渍在完成步骤2的反应系统中，5分钟内出结果。检测时长50分钟-60分钟。2.igm/igg抗体联检法，igm抗体在感染早期出现，igg抗体在感染中晚期出现，滴度有一个持续增高的过程，并在血液循环中保持较长时间存在。但特异抗体检测阳性不能像病毒核酸检测阳性一样作为病毒感染的“金标准”，该方法必须采用igm和igg同时检测且通常需多次动态检测来确认。故该方法不能作为新冠病毒早期筛查的技术。以上的病毒检测技术存在检测速度慢、灵敏度低、检出率低的问题。且现在大多数技术都需要实验室才能够开展，样本往往需要运输很长的距离及时间才能到达实验室；而且在实验室中，样本要多次开盖，容易产生污染，最终样本的保真性被大大的降低。3.rpa重组酶等温扩增技术，rpa在7min内完成基因的足量复制，目前该扩增方法已经应用于多种呼吸道病原体的相关检测，但是该方法特异性差且rpa探针设计复杂成本较高。技术实现要素：目前临床急需快速简便、准确度高的检测技术，以满足广泛人群的准确筛查和隔离的及时性。针对临床需求以及目前病毒检测技术存在的问题，我们提供了一种检测快速、灵敏度高、特异性强的双酶法恒温扩增检测covid-19的试剂盒。本发明的第一个目的是提供一种检测covid-19的引物对和mnazyme核酸酶，包括forwardprimer、reverseprimer，mnazymeparta、mnazymepartb和sub2-fb；forwardprimer：5'-caagcctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaa-3'；如seqidno.1所示；reverseprimer：5'-ctcagcagcagatttcttagtgacagtttggcctt-3'；如seqidno.2所示；mnazymeparta：5'-aacttctcctgctagaatggctggcacaacgagaggaaacctt-3'，3’-p；如seqidno.3所示；mnazymepartb:5'-tgcccagggaggctagctaatggcggtgatgct-3'，3’-p；如seqidno.4所示；sub2-fb:5'-aaggtttcctcguccctgggca-3'，5’-fam，3’-bhq1。本发明的第二个目的是提供一种双酶法恒温扩增检测covid-19的试剂盒，包括上述检测covid-19的引物对和mnazyme核酸酶，即包括forwardprimer、reverseprimer，mnazymeparta、mnazymepartb和sub2-fb。所述的试剂盒，还包括反应缓冲液，mgac溶液，冻干酶制剂等用于扩增的试剂。所述反应缓冲液的来源为twistampbasicrt试剂盒(twistdx)中rehydration缓冲液；所述的280mmol/lmgac溶液、冻干酶制剂的来源为twistampbasicrt试剂盒(twistdx)。本发明的第三个目的是提供双酶法恒温扩增检测covid-19的检测方法，是以待检测样本的rna或裂解液为模板，用检测covid-19的引物对和mnazyme核酸酶进行荧光扩增检测是否含有covid-19。判断的方法为如果目标样本产生扩增曲线，且ntc(阴性对照)没有产生扩增曲线，则判断待测样本感染covid-19(2019新冠病毒)病毒；如果目标样本没有产生扩增曲线，而阳性对照产生了扩增曲线，则判断待检测样本未感染covid-19(2019新冠病毒)病毒。优选，具体为：1)配置反应体系：将0.2μlforwardprimer(终浓度为40nm)，1μlreverseprimer(终浓度为200nm)，1μlmnazymeparta(终浓度为200nm)，1μlmnazymepartb(终浓度为200nm)，1μlsub2-fb(终浓度为200nm)，29.5μlrehydrationbuffer，7.8μlnuclease-freewater，1μlrnaseinhibitor(40单位/μl)混合得到预混液；2)将所述预混液与twistampbasicrt试剂盒(twistdx)中的冻干酶制剂混合，得到混合液；3)将混合液与5μl样本提取的rna或者样本裂解液和2.5μl280mmol/lmgac溶液混合，得到反应体系；4)将所述反应体系转移至恒温荧光检测仪中，设置程序55℃，5min；37℃，10min，37℃为荧光采集温度，根据扩增曲线判断待检样本是否含covid-19(2019新冠病毒)病毒。1.rpa(recombinasepolymeraseamplification)等温扩增技术rpa技术是重组酶介导的恒温扩增技术的简称，其原理是在目的dna片段扩增的过程中，引物与重组酶形成的复合物与dna结合并沿dna链寻找引物的同源序列，完成定位后发生链交换反应并打开2条dna单链间的氢键，单链绑定蛋白(ssb)与单链dna链结合，阻止形成双链，之后具有链置换活性的dna聚合酶从发生链交换反应的位置开始复制dna，如此循环，从而完成了对目的dna片段的扩增。备注：技术原理图片(图1)引用于文献---elisamokany,simonm.bone,paule.young,tramb.doan,andalisonv.todd----j.am.chem.soc.2010,132,1051–1059.在rpa扩增技术基础上联合mnazyme探针，mnazyme是一类通用功能强大的核酸酶复合物，该复合物会响应于特殊的输入信号而产生放大的输出信号，是用于检测和分析遗传靶标的有力工具。2.mnazyme探针的技术特征2.1mnazyme新型探针的结构原理如图2所示，mnazyme是有两个部分酶(partzymea与partzymeb)组成的多聚寡核酸，partzymea包括：①一个能够与靶核酸结合的部分(af)，②一个催化核心部分，③一个发光底物结合部分(f-sub)；partzymeb包含：①一个能够与同一序列上的候选部分酶a相邻结合的发光底物结合部分(f-sub)，②一个催化核心部分；③一个能够与靶核酸结合的部分(af)，能够与partzymea结合在同一靶核酸上，并且位置与partzymea相邻；在适宜的离子环境，适宜的温度下，靶核酸与发光底物同时存在时，partzymea与partzymeb组装成具有切割活性的“h”型，af与靶核酸上同时发光底物结合在f-sub上，此时mnazyme催化核心完成对发光底物的切割，进而发射出荧光信号。2.2mnazyme具有较高的特异性mnazyme产生信号需要4个靶标特异性结合事件，即2个引物和2个部分酶的杂交。因此，与水解探针和分子信标相比，mnazyme探针具有更高的特异性水平，后者具有3种特异性水平(来自2个引物和1个靶标特异性探针)mnazyme与其他的核酸酶相比还具有较高的催化特异性，如下表1所示表1测量值mnazyme其他核酸酶kcat(min-1)2880km(nm)95140kcat/km(min-1m-1)5.6*1082.9*108备注：kcat表示单个酶分子转换一个底物分子所需的时间；km衡量的是酶与底物之间亲和力的大小；kcat与km的比是衡量一个酶催化效率的最重要参数；备注：此数据引用于文献---elisamokany,simonm.bone,paule.young,tramb.doan,andalisonv.todd----j.am.chem.soc.2010,132,1051–1059.本发明的检测方法是基于rpa重组酶恒温扩增技术的基础上联合mnazyme，采用特异的非均一性扩增以产生足够多的线性dna，使mnazyme可持续发光；mnazyme工作温度非常广泛，室温(37℃)条件下即可检测到荧光，与rpa扩增工作温度(37℃)契合；mnazyme具有较高的发光特异性与催化特异性；与传统的rpa恒温扩增技术相比，本发明方法无需合成复杂探针序列，可设置多个mnazyme(2-3个)得到较强的输出荧光信号，避免了因靶核酸信号较弱检测不到的情况；本方法简便、快捷、可与多种仪器连用，42℃与37℃都可实现扩增且无噪音。附图说明：图1是rpa基础技术原理图；图2是mnazyme基础技术原理图；图3是mnazyme恒温孵育15min荧光累积图；图4是双酶法恒温扩增检测技术荧光曲线图；图5是双酶法恒温扩增检测技术扩增产物电泳图；图6是双酶法恒温扩增检测方法灵敏度分析。具体实施方式：下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1：mnazyme恒温孵育荧光检测1.mnazyme序列的设计依据covid-19(2019新冠病毒)病毒n基因序列选择特异性保守区域，设计mnazyme核酸酶，所有的序列由上海生工生物工程有限公司合成。其中sub2-fb序列中具有荧光基团fam和猝灭基团bhq1。设计得到的引物为：mnazymeparta：5’-aacttctcctgctagaatggctggcacaacgagaggaaacctt-3’，3’-p(3’磷酸化)；mnazymepartb:5’-tgcccagggaggctagctaatggcggtgatgct-3’，3’-p(3’磷酸化)；sub2-fb:5’-aaggtttcctcguccctgggca-3’，5’-fam(5’端标记fam基团)3’-bhq1(3’端标记bhq1基团)。2.荧光检测以covid-19(2019新冠病毒)病毒n基因组为模板，针对设计合成探针组合，采用双酶法恒温扩增检测试剂盒进行检测。详细操作步骤如下所示：使用双酶法恒温扩增检测试剂盒配制50μlrt-rpa反应体系，1μlmnazymeparta(终浓度为200nm)，1μlmnazymepartb(终浓度为200nm)，1μlsub2-fb(终浓度为200nm)，29.5μlrehydrationbuffer,7.8μlnuclease-freewater，1μlrnaseinhibitor(40单位/μl)，模板5μl，280mmmgac2.5μl。将所有试剂预混后转入0.2ml反应管中，并充分混匀。盖紧后瞬时离心并涡旋后，将反应管置于恒温荧光检测仪中，37℃，15min，每隔9s收集一次荧光信号。3.荧光检测结果如图3所示，横坐标代表时间，纵坐标表示荧光累积量，随着时间的增加，荧光累积量不断增加，随后达到饱和状态。这足以证明，在15min内，mnazyme即可实现荧光的累积。实施例2：双酶法恒温扩增荧光检测1.引物对与mnazyme序列forwardprimer：5'-caagcctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaa-3'；reverseprimer：5'-ctcagcagcagatttcttagtgacagtttggcctt-3'；mnazymeparta：5’-aacttctcctgctagaatggctggcacaacgagaggaaacctt-3’，3’-p(3’磷酸化)；mnazymepartb:5’-tgcccagggaggctagctaatggcggtgatgct-3’，3’-p(3’磷酸化)；sub2-fb:5’-aaggtttcctcguccctgggca-3’，5’-fam(5’端标记fam基团)3’-bhq1(3’端标记bhq1基团)。所有的序列由上海生工生物工程有限公司合成。2.双酶法恒温扩增荧光检测以covid-19(2019新冠病毒)病毒n基因组为模板，针对设计合成的引物与mnazyme组合，采用twistampbasicrt试剂盒(twistdx)进行扩增验证。本专利利用特异的非均一性扩增技术，forwardprimer与reverseprimer的浓度比为1:5，即forwardprimer浓度为40nm，reverseprimer浓度为200nm。详细操作步骤如下所示：使用twistampbasicrt试剂盒配制50μlrt-rpa反应体系，其中forwardprimer0.2μl(终浓度40nm)，1μlreverseprimer(终浓度为200nm)，1μlmnazymeparta(终浓度为200nm)，1μlmnazymepartb(终浓度为200nm)，1μlsub2-fb(终浓度为200nm)，29.5μlrehydrationbuffer,7.8μlnuclease-freewater，1μlrnaseinhibitor(40单位/μl)，模板5μl，280mmmgac2.5μl。将模板和mgac之外的所有试剂预混后转入含有冻干酶制剂的0.2ml反应管中，并充分混匀。将5μl模板加入反应管中，并将2.5μlmgac加在反应管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋后，将反应管置于恒温荧光检测仪中，55℃，5min；37℃，10min，1min收集一次荧光信号，采集扩增曲线。扩增结束后立即进行琼脂糖电泳凝胶。ntc是阴性对照组，其添加5μl无核酸酶的水为模板。3.检测结果结果如图4、图5所示，rpa联合mnazyme恒温扩增技术检测了三个样本，均获得扩增曲线与电泳条带，检测条带在250bp左右，为covid-19(2019新冠病毒)病毒n基因序列大小，证明双酶法恒温扩增检测试剂盒可用于covid-19(2019新冠病毒)病毒检测。实施例3：双酶法恒温扩增检测方法灵敏度分析1.质粒标准品的构建：质粒标准品从上海生工生物购入质粒的倍比稀释将covid-19n阳性质粒v2(即含covid-19病毒n基因的质粒)进行倍比稀释使其浓度为105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、10copies/μl。2.灵敏度分析(1)rpa恒温扩增以浓度为105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、10copies/μl2019-ncovn阳性质粒v2作为rpa恒温扩增反应的模板，以mnazyme、forwardprimer、reverseprimer为探针与引物，详细操作步骤如下所示：使用twistampbasicrt试剂盒配制50μlrt-rpa反应体系，其中forwardprimer0.2μl(终浓度40nm)，1μlreverseprimer(终浓度为200nm)，1μlmnazymeparta(终浓度为200nm)，1μlmnazymepartb(终浓度为200nm)，1μlsub2-fb(终浓度为200nm)，29.5μlrehydrationbuffer,7.8μlnuclease-freewater，1μlrnaseinhibitor(40单位/μl)，模板5μl，280mmmgac2.5μl。将模板和mgac之外的所有试剂预混后转入含有冻干酶制剂的0.2ml反应管中，并充分混匀。将5μl模板加入反应管中，并将2.5μlmgac加在反应管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋后，将反应管置于恒温荧光检测仪中，55℃，5min；37℃，10min，1min收集一次荧光信号，采集扩增曲线。ntc是阴性对照组，其添加5μl无核酸酶的水为模板。(2)扩增结果结果如图6所示，横坐标为模板拷贝数，纵坐标为ct值，ntc无ct值，表明ntc未发生扩增，随着模板拷贝数的降低，ct值逐渐增加。在拷贝数为103copies/μl时，ct值为29；拷贝数为102copies/μl、10copies/μl时，ct值已均大于35，可考虑此数值不可靠。以上结果证明，当模板为103copies/μl及以上拷贝时有明显的扩增，ct值随模板拷贝数的增加而降低，可满足现场检测的要求。由此可见，本发明的双酶法恒温扩增检测方法，实现了rna快速扩增的目的。在rpa快速扩增的同时，mnazyme探针由于其本身具有催化特性，能实现同时超指数的发出荧光，缩短了仪器有效感知的时间，检测时间能在15分钟完成，而poct法--crispr等温检测法则需要30-40min(表2)，最终实现快速检测的目的,且灵敏度高最低可检测到1000拷贝数的靶核酸。由于mnazyme本身的高特异性，减少了假阳性和假阴性，提高了准确率。该方法不需要中大型的qpcr仪器，而通过便携恒温pcr仪就能实现。表2：本专利检测所需时间vs常用检测方法所需时间测定值(均值)本发明专利poct法--crispr等温检测法时间15min30min-40min序列表<110>广州达正生物科技有限公司<120>一种双酶法恒温扩增检测covid-19的试剂盒和检测方法<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1caagcctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaa35<210>2<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ctcagcagcagatttcttagtgacagtttggcctt35<210>3<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aacttctcctgctagaatggctggcacaacgagaggaaacctt43<210>4<211>33<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tgcccagggaggctagctaatggcggtgatgct33当前第1页12