一种含有三对二硫键的多肽的氧化和分离纯化方法与流程

1.本发明属于多肽药物制备技术领域，具体涉及一种含有三对二硫键的多肽的氧化、分离纯化方法。


背景技术：

2.多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。在许多重要的蛋白质和多肽中都含有一对或多对由cys残基侧链之间形成的二硫键，比如免疫球蛋白、生长素、酶和催产素等。二硫键在维持这些分子空间构象稳定性及由此决定的生物活性方面发挥着重要的作用，在分子生物学上也具有重要意义。另外，人们还有选择地在一些多肽和蛋白质中额外形成一对或多对二硫键，大大增强了这些分子的结构稳定性，乃至热力学稳定性，也提高了它们的生理活性。这样在多肽合成发展的过程中，二硫键的形成也成为人们研究的热点之一。在方法学上，多肽中二硫键形成是不难的，但要在特定的多肽特定的位置形成多对二硫键却非易事。对于合成含一对、两对或三对二硫键的多肽，现在已有相对成熟的正交选择的方法，包括一步法和序步法，这些方法在合成含有二硫键的多肽方面已取得很大的成功；对于合成含有多对二硫键特别的多肽如果只依靠一步法来进行氧化，二硫键连接的准确率低、易生成多种同分异构体产物、增加产物分离纯化难度从而产物收率降低，所以必须依靠序步法来达到特定位置二硫键的形成。


技术实现要素：

3.为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种含有三对二硫键的多肽的氧化、分离纯化方法。
4.本发明通过以下技术手段实现：
5.一种含有三对二硫键的多肽的氧化和分离纯化方法，其特征在于：
6.所述含有三对二硫键的多肽序列如下：
7.c(1)ggkakasc(9)lrmdyc(15)tac(18)srsc(22)gkc(25)-nh28.二硫键配对(1)c1-c18，(2)c9-c22，(3)c15-c25，
9.以上多肽序列对应的氨基酸序列如seq id no.1所示,cys-gly-glylys-ala-lys-ala-ser-cys-leu-arg-met-asp-tyr-cys-thr-ala-cys-ser-argser-cys-gly-lys-cys。
10.优选地，所述的一种含有三对二硫键的多肽的氧化和分离纯化方法，采用正交保护策略，根据形成二硫键的半胱氨酸位置选用三种不同的侧链保护基trt、acm和mob分别对六个半胱氨酸巯基进行保护，根据三种侧链保护基的脱除条件的不同，依次选择合适的脱除试剂分别脱除cys的侧链保护基，按照多步氧化法，定向形成三对二硫键，得到的粗肽经分离纯化、冻干，得到纯品多肽。
11.优选地，所述的一种含有三对二硫键的多肽的氧化和分离纯化方法，包括如下步骤：
12.s1、首先根据cys配对位置的不同选择cys侧链巯基保护基；c1和c18的侧链巯基由
trt保护，c9和c22的侧链巯基由acm保护，c15和c25的侧链巯基由mob保护；
13.s2、按照肽序和选好的保护氨基酸，用fmoc固相合成法从c端至n端依次缩合活化后的侧链保护的氨基酸，得线性全保护肽树脂；
14.s3、肽树脂经过裂解、乙醚沉降，干燥后得到带有acm和mob保护基的线性粗肽白色固体；
15.s4、氧化由s3制得的线性粗肽，环化形成第一对二硫键(c1-c18)，得到含acm和mob两对保护基和一对二硫键的样品，浓缩、冻干后得到白色固体；
16.s5、脱除s4制得的一环粗肽上cys(acm)的acm保护基，环化形成第二对二硫键(c9-c22)，得到含有两对二硫键和一对mob保护基的二环样品；
17.s6、脱除s5制得的二环粗肽上cys(mob)的mob保护基，环化形成第三对二硫键(c15-c25)，得到含有三对二硫键的粗肽；
18.s7、将s6制得的粗肽分离纯化、冻干，得含有三对二硫键的纯品肽。
19.优选地，所述s4中的环化方法为：将s32制得的线性粗肽溶于乙酸-水溶液，加入体积分数为10％～20％dmso，在10～30℃条件下反应0.5～2h。
20.优选地，所述s5中脱除s4制得的一环粗肽上cys(acm)的acm保护基、环化的方法为：10～30℃条件下加入i
2-meoh溶液，反应0.5～2h。
21.优选地，所述s6中脱除mob保护基的环化方法为：将二环肽溶于体积分数为10％乙酸溶液，加入0.2m乙酸汞，调节ph至4，在10～30℃条件下反应0.5～2h后，加入体积分数20％的h2o2溶液，在10～30℃条件下反应0.5～2h。
22.优选地，所述s7中纯化方法为采用反相高效液相色潽法对粗肽进行两步纯化。
23.优选地，所述纯化方法为，第一步纯化：流动相a相为体积分数0.1％tfa-h2o溶液，流动相b相为体积分数0.1％tfa-acn溶液；
24.第二步纯化对纯品转盐：流动相a相为体积分数0.1％乙酸-h2o溶液，流动相b相为体积分数0.1％乙酸-acn溶液；
25.两步纯化均为梯度洗脱：洗脱时间为40min，洗脱梯度为b相体积分数的20％～40％，流速为60ml/min，紫外检测波长220nm。
26.本发明中涉及的氨基酸如下所示：
27.半胱氨酸(c),甘氨酸(g)，赖氨酸(k)，丙氨酸(a)，丝氨酸(s),亮氨酸(l)，精氨酸(r)，蛋氨酸(m)，天冬氨酸(d)，酪氨酸(y)，苏氨酸(t)，天冬酰胺(n)，组氨酸(h)。
28.本发明的有益效果体现在：解决了现有技术的二硫键连接的准确率低、易生成多种同分异构体产物、增加产物分离纯化难度从而产物收率低的技术问题，提供了一种可定向形成二硫键、无同分异构体产物生成、产物分离纯化简单、产物收率高的含有三对二硫键的多肽的氧化、分离纯化方法。
附图说明
29.图1：本发明线性粗肽的液相色谱图。
30.图2：本发明线性粗肽的ms图(2984.1)。
31.图3：本发明含有三对二硫键的纯品肽的液相色谱图。
32.图4：本发明含有三对二硫键的纯品肽的ms图(2598.1)。
具体实施方式
33.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清晰、完整的描述。
34.本发明揭示了一种含有三对二硫键的多肽的氧化和分离纯化方法，所述多肽的序列如下：
35.c(1)ggkakasc(9)lrmdyc(15)tac(18)srsc(22)gkc(25)-nh2
36.二硫键配对(1)c1-c18，(2)c9-c22，(3)c15-c25
37.本发明所述的方法采用正交保护策略，根据形成二硫键的半胱氨酸位置选用三种不同的侧链保护基trt、acm和mob分别对六个半胱氨酸巯基进行保护，根据三种侧链保护基的脱除条件的不同，依次选择合适的脱除试剂分别脱除cys的侧链保护基，按照多步氧化法，定向形成三对二硫键，得到的粗肽经分离纯化、冻干，得到纯品多肽。
38.实施例1：线性粗肽的制备
39.按照肽序和选好的保护氨基酸，用fmoc固相合成法进行合成，合成完成后经过裂解、乙醚沉降，干燥后得到带有acm和mob保护基的线性粗肽白色固体(trt在裂解时已脱除)。线性粗肽的hplc图谱参见图1、ms图(2984.1)参见图2。
40.实施例2：一环粗肽的制备
41.将实施例1制得的线性粗肽溶于乙酸-水溶液，配成1mm的溶液，加入体积分数10％～20％的dmso，在25℃条件下反应1h后，将反应液冻干，得到一环粗肽。
42.实施例3：二环粗肽的制备
43.将实施例2制得的一环粗肽溶于乙酸-水溶液，配成1mm的溶液，加入质量分数10％的i
2-meoh溶液，在25℃条件下反应2h，将反应液冻干，得到二环粗肽。
44.实施例4：三环粗肽的制备
45.将实施例3制得的二环粗肽溶于体积分数10％乙酸，配成1mm的溶液，加入0.2m的乙酸汞，调节ph至4，在25℃条件下反应1h后，加入体积分数20％h2o2溶液，在25℃条件下反应2h后，得到三环粗肽溶液。
46.实施例5：粗肽的纯化
47.用反相高效液相色潽法对实施例4制得的三环粗肽进行两步纯化：第一步纯化：流动相a相为体积分数0.1％tfa-h2o溶液，流动相b相为体积分数0.1％tfa-acn溶液；第二步纯化对纯品转盐：流动相a相为体积分数0.1％乙酸-h2o溶液，流动相b相为体积分数0.1％乙酸-acn溶液；两步纯化均为梯度洗脱：c18制备柱(50
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250mm，10um)，洗脱时间为40min，洗脱梯度为b相20％～40％，流速为60ml/min，紫外检测波长220nm。经纯化、冻干得纯品肽。hplc图谱参见图3、ms图(2598.1)参见图4。
48.当然本发明尚有多种具体的实施方式，在此就不一一列举。凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。