一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术：

n-乙酰神经氨酸是一种功能性单糖，广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中，n-乙酰神经氨酸参与细胞识别、信号转导等多个生理过程。因此，n-乙酰神经氨酸被广泛应用于增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑发育。目前，n-乙酰神经氨酸主要采取天然产物提取法(鸡蛋、燕窝等)，存在其他产物难以分离，且成本较高；另外可以通过全细胞转化的方法获得，但是需要成本较高的底物乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸为底物，导致成本较高。

枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被fda认证为“generallyregardedassafe”(gras)安全级别。因此以枯草芽孢杆菌为宿主，通过代谢工程改造，以葡萄糖等廉价碳源为底物，高效从头合成神经氨酸是一种有效的策略。

目前在枯草中构建的n-乙酰神经氨酸代谢途径主要通过udp-n-乙酰氨基葡萄糖为前体的neuc关键酶合成途径，n-乙酰氨基葡萄糖为前体的age关键酶合成途径，以及n-乙酰氨基葡萄-6磷酸为前体的nane关键酶合成途径，由于途径涉及较多外源酶蛋白，同时引入多个酶蛋白容易导致细胞压力，不利于细胞生长和产物合成，因此难以实现多途径复合的策略，这个问题的存在严重限制了神经氨酸产量的提高，进一步限制了其市场应用。

技术实现要素：

为实现三条途径在枯草芽孢杆菌中高效表达，且不造成细胞代谢压力，本发明通过筛选不同强度的启动子对关键代谢途径的基因表达水平进行合理调控，以提高神经氨酸的含量。

本发明的第一个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，利用启动子强化了udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶(neuc)、n-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶(nane)、氨基葡萄糖-6-磷酸-n-乙酰基转移酶(gna1)、n-乙酰氨基葡萄糖异构酶(age)和n-乙酰神经氨酸合酶(neub)的表达；所述启动子的核苷酸序列选自seqidno.6～15。

在一种实施方式中，所述n-乙酰神经氨酸合酶(neub)来源于脑膜炎奈瑟菌(neisseriameningitidis)。

在一种实施方式中，所述udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶(neuc)的氨基酸序列如seqidno.1所示。

在一种实施方式中，所述n-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶(nane)的氨基酸序列如seqidno.2所示。

在一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸-n-乙酰基转移酶(gna1)的氨基酸序列如seqidno.3所示。

在一种实施方式中，所述n-乙酰氨基葡萄糖异构酶(age)的氨基酸序列如seqidno.4所示。

在一种实施方式中，所述n-乙酰神经氨酸合酶(neub)的氨基酸序列如seqidno.5所示。

在一种实施方式中，采用seqidno.6～8任一所示的启动子强化氨基葡萄糖-6-磷酸-n-乙酰基转移酶的表达。

在一种实施方式中，采用seqidno.11～15任一所示的启动子强化n-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达。

在一种实施方式中，采用seqidno.6所示的启动子强化n-乙酰神经氨酸合酶的表达。

在一种实施方式中，采用seqidno.11所示的启动子强化udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶的表达。

在一种实施方式中，采用seqidno.6～8或seqidno.12～14任一所示的启动子强化n-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶的表达。

在一种实施方式中，采用seqidno.6所示的启动子强化氨基葡萄糖-6-磷酸-n-乙酰基转移酶的表达，并用seqidno.15所示的启动子强化n-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达，并用seqidno.6所示的启动子强化n-乙酰神经氨酸合酶的表达，并用seqidno.11所示的启动子强化udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶的表达，并用seqidno.6所示的启动子强化n-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶的表达。

本发明的第二个目的是提供一种提高枯草芽孢杆菌n-乙酰神经氨酸产量的方法，是向枯草芽孢杆菌中引入脑膜炎奈瑟菌(neisseriameningitidis)来源的n-乙酰神经氨酸合酶，并以不同强度的启动子分别强化neuc和neub参与的由udp-n-乙酰葡萄糖合成n-乙酰神经氨酸的途径，强化gna1、age和neub参与的由葡萄糖胺-6-磷酸合成n-乙酰神经氨酸的途径，以及gna1、nane和neub参与的由6-磷酸-n-乙酰甘露糖苷合成n-乙酰神经氨酸的途径。

在一种实施方式中，所述方法通过多个启动子强化枯草芽孢杆菌udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶、n-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶，以及氨基葡萄糖-6-磷酸-n-乙酰基转移酶、n-乙酰氨基葡萄糖异构酶和n-乙酰神经氨酸合酶在基因组上的表达水平；所述启动子具有如seqidno.6～15任一所示的核苷酸序列。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌bsgn6-comk，其构建方法公开于论文《modularpathwayengineeringofkeycarbon-precursorsupply-pathwaysforimprovedn-acetylneuraminicacidproductioninbacillussubtilis》中。

本发明的第三个目是提供一种生产n-乙酰神经氨酸的方法，是将上述任一所述的重组枯草芽孢杆菌在含唾液酸的环境中培养，以生产神经氨酸。

在一种实施方式中，所述培养是在30～37℃培养16～72h。

在一种实施方式中，将所述重组枯草芽孢杆菌接种在lb培养基中，培养12～18h获得od为6～10的种子液，再以按体积比计1～10％的接种量转接至发酵培养基中进行发酵。

在一种实施方式中，所述发酵是在含有葡萄糖60g/l，胰蛋白胨6g/l，酵母粉12g/l，硫酸铵6g/l，磷酸氢二钾12.5g/l，磷酸二氢钾2.5g/l，硫酸镁3g/l的培养基中进行。

本发明还要求保护所述重组枯草芽孢杆菌在制备含神经氨酸或其衍生产品中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是用于制备药物或保健品。

在一种实施方式中，所述衍生产品包括但不限于抗病毒药物扎那米韦(zanamivir)或奥司他韦(oseltamivir)。

有益效果：

(1)本发明通过筛选不同来源的n-乙酰神经氨酸合酶，确定了在低表达水平下仍有较高催化活性的脑膜炎奈瑟菌(neisseriameningitidis)来源的n-乙酰神经氨酸合酶，并将其整合于重组枯草芽孢杆菌基因组上；

(2)本发明通过以10个不同强度启动子分别优化三条神经氨酸合成途径关键酶udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶(neuc)、n-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶(nane)，以及氨基葡萄糖-6-磷酸-n-乙酰基转移酶(gna1)、n-乙酰氨基葡萄糖异构酶(age)和n-乙酰神经氨酸合酶(neub)在基因组上的表达水平，并降低了关键酶neub的表达水平，从而降低了其对细胞造成的蛋白合成压力；并使枯草芽孢杆菌发酵72h后的n-乙酰神经氨酸产量达7.6g/l以上，具有很好的代谢工程应用前景。

附图说明

图1为神经氨酸合成途径图。

具体实施方式

udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶(neuc)的氨基酸序列如seqidno.1所示，核苷酸序列如seqidno.16所示；n-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶(nane)的氨基酸序列如seqidno.2所示，核苷酸序列如seqidno.17所示；氨基葡萄糖-6-磷酸-n-乙酰基转移酶(gna1)的氨基酸序列如seqidno.3所示，核苷酸序列如seqidno.18所示；n-乙酰氨基葡萄糖异构酶(age)的氨基酸序列如seqidno.4所示，核苷酸序列如seqidno.19所示；neisseriameningitidis来源的n-乙酰神经氨酸合酶(neub)的氨基酸序列如seqidno.5所示，核苷酸序列如seqidno.20所示。

启动子p1～p10的和核苷酸序列分别如seqidno.6～15；

大肠杆菌来源neub酶氨基酸列如seqidno.21所示，核苷酸序列如seqidno.22所示；

moritellaviscosa来源neub酶氨基酸列如seqidno.23所示，核苷酸序列如seqidno.24所示。

发酵培养基(g/l)：葡萄糖60，胰蛋白胨6，酵母粉12，硫酸铵6，磷酸氢二钾12.5，磷酸二氢钾2.5，硫酸镁3。

神经氨酸检测方法：采用agilent液相色谱进行检测，色谱柱为aminexhpx-87hcolumn(300×7.8mm)，紫外210nm检测吸收峰，流动相为10mm硫酸，流速为0.5ml/min，n-乙酰神经氨酸的出峰时间约为9.8分钟。

实施例1构建基因组重组整合neuc片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物neuc-l-f:

5’-gcgaacaggcatcctatacactgggacaa-3’和

neuc-l-r:5’-accgagctcgaattcttattagacggagtcttttttgcttttgccaatcagacgtgtaa-3’，扩增重组整合neuc左臂基因片段；

合成如seqidno.6～15所示的启动子p1～p10的片段；

合成如seqidno.16所示的neuc基因序列；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物neuc-r-l：

5’-acttgtcagactgccgggaaatcccggcagtcttttttccattaaaacacggcgacggagtctttttttatttcgtttttaagaagtagg-3’和neuc-r-r：

5’-ctaacacaatccattttgaagatgcctttttgca-3’，扩增重组整合neuc右臂基因片段；

将扩增得到的neuc左臂基因片段、启动子片段(分别如seqidno.1～10所示)、neuc基因片段和neuc右臂片段通过融合pcr技术构建成重组整合neuc基因片段，根据启动子的不同将其分别命名为neuc1～neuc10；其中，neuc1对应含有seqidno.6所示的p1启动子的neuc融合片段，neuc2对应含有seqidno.7所示的p2启动子的neuc融合片段，以此类推，neuc10对应含有seqidno.15所示的p10启动子的neuc融合片段。

实施例2构建基因组重组整合nane片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物nane-l-f:5’-gtgttcgtagtctctcgggagagtcattccatga-3’和nane-l-r:5’-cgcaataacgcaggcgttctgtgacattaacttatttcgcgtttaagagaacaggccttggtttgtgaca-3’，扩增重组整合nane左臂基因片段；

合成如seqidno.6～15所示的启动子p1～p10的片段；

合成如seqidno.17所示的nane基因片段；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物nane-r-l：

5’-gaataacttgtcagactgccgggaaatcccggcagtcttttttccattaaaacacggcatgactgtcagttctttcagccgct-3’和nane-r-r：

5’-caacgattgcgtttaatgtcagcatcagcccataca-3’，扩增重组整合nane右臂基因片段。

将扩增得到的nane左臂基因片段、启动子片段(分别如seqidno.6～15所示)、nane基因片段和nane右臂片段通过融合pcr技术，构建成重组整合nane基因片段，根据启动子的不同将其分别命名为nane1～nane10；其中，nane1对应含有seqidno.6所示的p1启动子的nane融合片段，nane2对应含有seqidno.7所示的p2启动子的nane融合片段，以此类推，nane10对应含有seqidno.15所示的p10启动子的nane融合片段。

实施例3构建基因组重组整合gna1片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物gna1-l-f:5’-cgtgatatcgtcattcagtctcttgaacgcca-3’和gna1-l-r:5’-cgcaataacgcaggcgttctgtgacattaacttatttcatgttctttttagttagacgattttaatacaagcctcgcca-3’，扩增重组整合gna1左臂基因片段；

合成如seqidno.6～15所示的启动子p1～p10的片段；

合成如seqidno.18所示的编码gna1的基因片段；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物gna1-r-l：5’-ataacttgtcagactgccgggaaatcccggcagtcttttttccattaaaacacggcccagtcataaaatagttttcctaataagacctgg-3’和gna1-r-r：5’-cctacttaagctgctaccacttgtga-3’，扩增重组整合gna1右臂基因片段。

将扩增得到的gna1左臂基因片段、启动子片段(分别如seqidno.6～15所示)、gna1基因片段和gna1右臂片段通过融合pcr技术，构建成重组整合gna1基因的片段，根据启动子的不同将其分别命名为gna11～gna110；其中，gna11对应含有seqidno.6所示的p1启动子的gna1融合片段，gna12对应含有seqidno.7所示的p2启动子的gna1融合片段，以此类推，gna110对应含有seqidno.15所示的p10启动子的gna1融合片段。

实施例4构建基因组重组整合age片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物age-l-f:5’-cgtgatatcgtcattcagtctcttgaacgcca-3’和age-l-r:5’-cgcaataacgcaggcgttctgtgacattaacttatttcatgttctttttagttagacgattttaatacaagcctcgcca-3’，扩增重组整合age左臂基因片段；

合成如seqidno.6～15所示的启动子p1～p10的片段；

合成如seqidno.19所示的编码age的基因片段；

以枯草芽孢杆菌基因组为模板，以引物age-r-l：5’-ataacttgtcagactgccgggaaatcccggcagtcttttttccattaaaacacggcccagtcataaaatagttttcctaataagacctgg-3’和age-r-r：5’-ataaccaacgcagcaagtggcaacct-3’，扩增重组整合age右臂基因片段。

将扩增得到的age左臂基因片段、启动子片段(分别如seqidno.6～15所示)、age基因片段和age右臂片段通过融合pcr技术，构建成重组整合age基因片段，根据启动子的不同将其分别命名为age1～age10；其中，age1对应含有seqidno.6所示的p1启动子的age融合片段，age2对应含有seqidno.7所示的p2启动子的age融合片段，以此类推，age10对应含有seqidno.15所示的p10启动子的age融合片段。

实施例5构建基因组重组整合neub片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物neub-l-f:5’-cggtgtctgtatatcacaaaaatagtgagcagggtaacga-3’和neub-l-r:5’-cgcaataacgcaggcgttctgtgacattaacttatttccacctattttgttacagcgtgtgccacttttatgca-3’，扩增重组整合neub左臂基因片段；

合成如seqidno.6～15所示的启动子p1～p10的片段；

合成如seqidno.20所示的编码age的基因片段；

以引物neub-g-l：5’-atgcaaaacaacaacgaatttaaaatcggca-3’和neub-g-r：5’-cgggatttcccggcagtctgacaagttattctgcaatagttattcgatatctgttttcttaatctgagctcctttgcgga-3’扩增neub片段；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物neub-r-l：5’-taacttgtcagactgccgggaaatcccggcagtcttttttccattaaaacacggcgcttgaacagctttttttgaataccttgtccagct-3’和neub-r-r：5’-gcgtcatcgcagtttttgcacctgact-3’扩增重组整合neub右臂基因片段。

将扩增得到的neub左臂基因片段、启动子片段(分别如seqidno.6～15所示)、neub基因片段和neub右臂片段通过融合pcr技术，构建成重组整合neub基因片段；根据启动子的不同将其分别命名为neub1～neub10；其中，neub1对应含有seqidno.6所示的p1启动子的neub融合片段，neub2对应含有seqidno.7所示的p2启动子的neub融合片段，以此类推，neub10对应含有seqidno.15所示的p10启动子的neub融合片段。

实施例6重组整合gna1基因的枯草芽孢杆菌的构建

分别将实施例3构建的重组整合gna11～gna110的基因片段转化至枯草芽孢杆菌bsgn6-comk(构建方法公开于论文《modularpathwayengineeringofkeycarbon-precursorsupply-pathwaysforimprovedn-acetylneuraminicacidproductioninbacillussubtilis》)基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌分别命名为bs-gna1-1～bs-gna1-10。

分别将重组枯草芽孢杆菌bs-gna1-1～bs-gna1-10接种于lb培养基中培养12～18小时，获得od约为6的种子液，再将种子液按1％接种量接种于发酵培养基中，于37℃、200rpm下培养72h。最终测定发酵液中检测到n-乙酰神经氨酸(neuac)前体物质n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)产量分别为：8.4g/l、8.1g/l、8.1g/l、7.9g/l、7.8g/l、7.2g/l、7.8g/l、7.1g/l、7.2g/l、7.2g/l。

实施例7重组整合age基因的枯草芽孢杆菌的构建

分别将实施例4构建的重组整合age1～age10的基因片段转化至实施例6构建的重组枯草芽孢杆菌bs-gna1-1基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌分别命名为bsg-age-1～bsg-age-10。

分别将重组枯草芽孢杆菌bsg-age-1～bsg-age-10接种于lb培养基中培养12～18小时，获得od约为6的种子液，再将种子液按1％接种量接种于发酵培养基中，于37℃、200rpm下，在发酵培养基中培养72h，测定发酵液中n-乙酰神经氨酸(neuac)前体物质n-乙酰基-d-氨基甘露糖(mannac)的产量分别为：0.5g/l、0.4g/l、0.8g/l、1.4g/l、0.1g/l、2.8g/l、3.2g/l、2.9g/l、3.1g/l、3.5g/l。

实施例8重组整合neub基因的枯草芽孢杆菌的构建

分别将实施例5构建的重组整合neub1～neub10的基因片段转化至实施例7构建的重组枯草芽孢杆菌bsg-age-10基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌分别命名为bsga-neub-1～bsga-neub-10。

分别将重组枯草芽孢杆菌bsga-neub-1～bsga-neub-10接种于lb培养基中培养12～18小时，获得od约为6的种子液，再将种子液按1％的接种量接种于发酵培养基中，于37℃、200rpm下，在发酵培养基中培养72h。测定发酵液中neuac产量的分别为：7.6g/l、3.4g/l、3.1g/l、2.8g/l、3.7g/l、2.2g/l、1.9g/l、2.1g/l、1.7g/l、1.9g/l。

实施例9重组整合neuc基因的枯草芽孢杆菌的构建

分别将实施例1构建的重组整合neuc1～neuc10的基因片段转化至实施例8构建的重组枯草芽孢杆菌bsga-neub-1基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌分别命名为bsgan-neuc-1～bsgan-neuc-10。

分别将重组枯草芽孢杆菌bsgan-neuc-1～bsgan-neuc-10接种于lb培养基中培养12～18小时，获得od约为6的种子液，再将种子液按1％接种量接种于发酵培养基中，于37℃、200rpm下，在发酵培养基中培养72h，测定发酵液中检测到neuac产量分别为：6.8g/l、6.6g/l、7.1g/l、8.1g/l、7.8g/l、9.1g/l、5.6g/l、5.8g/l、7.1g/l、7.9g/l。

实施例10重组整合nane基因的枯草芽孢杆菌的构建

分别将实施例2构建的重组整合nane1～nane10的基因片段转化至实施例9构建的重组枯草芽孢杆菌bsgan-neuc-6基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌分别命名为bsganc-nane-1～bsganc-nane-10。

分别将重组枯草芽孢杆菌bsganc-nane-1～bsganc-nane-10接种于lb培养基中培养12～18小时，获得od约为6的种子液，再将种子液按1％接种量接种于发酵培养基中，于37℃、200rpm下，在发酵培养基中培养72h。测定发酵液中的neuac产量，结果分别为：10.4g/l、9.6g/l、9.2g/l、8.5g/l、8.4g/l、8.9g/l、9.0g/l、9.2g/l、9.0g/l、8.8g/l，对比例1：仅通过强化age-neub途径合成neuac

按照实施例6～7相同的策略，不以启动子调控age或neub的表达，仅通过强化age-neub途径合成neuac，在37℃、200rpm下，在发酵培养基中培养72h的neuac产量最高只能达到2.75g/l。

对比例2：不同来源n-乙酰神经氨酸合酶对表达效果的影响

分别以实施例5相同的策略，将e.colik1和moritellaviscosa等来源的neub基因在枯草芽孢杆菌bsgn6-comk中表达，并通过不同启动子调控表达。在实施例10相同的培养条件下，发酵16～72h后的神经氨酸产量如表1所示。

表1表达不同来源neub的重组枯草芽孢杆菌神经氨酸产量

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用

<160>24

<170>patentinversion3.3

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glylysserleuglyvaltyrlysileserleuglucysvalproglu

130135140

leuleuprophetyrserglnpheglypheglnaspaspcysasnphe

145150155160

metthrglnargphe

165

<210>4

<211>388

<212>prt

<213>人工序列

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metglylysasnleuglnalaleualaglnleutyrlysasnalaleu

151015

leuasnaspvalleuprophetrpgluasnhisserleuaspserglu

202530

glyglytyrphethrcysleuaspargglnglylysvaltyraspthr

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115120125

leualaserglygluglutrpalalysaspvalalametglnalatyr

130135140

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145150155160

thrtyrproglythrargprometlysalaleualavalprometile

165170175

leualaasnleuthrleuglumetglutrpleuleuproglngluthr

180185190

leugluasnvalleualaalathrvalglngluvalmetglyaspphe

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serhisileaspcysphegluglyargleuileasnproglyhisgly

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serlysthrileasnglnalavalaspvalvalleuasnileleuasn

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385

<210>5

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<212>prt

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202530

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505560

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65707580

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100105110

serargalaalaalaleuargleuglnargmetaspileproalatyr

115120125

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130135140

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ileileglyleuserasphisthrleuaspasntyralacysleugly

210215220

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225230235240

metaspargproglyproaspilevalcyssermetasnproaspthr

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<211>116

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<211>113

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leuglulysilealalysleuproileproasplyslysileileile

130135140

serthrglymetalathrileaspgluilelysglnservalserile

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pheileasnasnlysvalprovalglyasnilethrileleuhiscys

165170175

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thrpheileglulyshisphethrleuasplyssermetserglypro

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thrthrlysargproglyasnglyileserprometglutrptyrasn

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leulysthralapheglumetvalaspalaalailegluglyglyala

354045

gluileilelyshisglnthrhisvalilegluaspglumetserser

505560

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65707580

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859095

lystyrilegluserlysglyalailepheileserthrpropheser

100105110

argalaalaalaleuargleugluargmetglyvalseralatyrlys

115120125

ileglyserglyglucysasnasntyrproleuleuaspleuileala

130135140

sertyrglylysprovalileleuserthrglymetasnaspilepro

145150155160

serilearglysservalgluilephearglystyrlysthrproleu

165170175

cysleuleuhisthrthrasnleutyrprothrproasphisleuile

180185190

argileglyalametgluglumetglnargglupheseraspvalval

195200205

valglyleuserasphisserileaspasnleualacysleuglyala

210215220

valalaalaglyalaservalleugluarghisphethraspasnlys

225230235240

alaargserglyproaspilecyscyssermetaspglyalaglucys

245250255

alagluleuileserglnserlysargmetalaglnmetargglygly

260265270

serlysglyalavallysglugluglnvalthrileaspphealatyr

275280285

alaservalvalthrilelysgluilelysalaglyglualaphethr

290295300

lysaspasnleutrpvallysargproglythrglyasppheleuala

305310315320

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325330335

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gatcttattgcgtcttatggcaaaccggtcatcttatcaacaggaatgaatgatattccg480

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caacgcgaatttagcgatgttgtggtcggactgagcgatcattctatcgataacctggct660

tgtctgggagctgtggctgctggagcttctgtcctggaaagacattttacagataacaaa720

gctcgctcaggcccggatatttgctgtagcatggatggagcggaatgtgctgaacttatc780

tctcaatcaaaaagaatggcccagatgcgcggcggatcaaaaggcgcagtcaaagaagaa840

caggttacaattgattttgcctatgcaagcgttgtgacaattaaagaaatcaaagccgga900

gaagcatttacaaaagataatctgtgggttaaacgcccgggcacaggagattttcttgcg960

gatgattatgaaatgcttttaggcaagaaagcaagccaaaacattgattttgatgtgcag1020

ctgaagaaagaatttatcaaataa1044