卡介菌甘露聚糖及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种卡介菌甘露聚糖及其制备方法和应用。


背景技术：

2.分枝杆菌属细菌(mycobacterium)是一类细长略弯曲的杆菌，因有分枝生长的趋势而得名。该属细菌主要包括人结核分枝杆菌(m.tuberculosis)、牛分枝杆菌(m.bovis)、非洲分枝杆菌(m.africanum)、坎纳分枝杆菌(m.canettii)、田鼠分枝杆菌(m.microti)、鸟分枝杆菌(m.avium)和麻风分枝杆菌(m.leprae)等。分枝杆菌的细胞外部结构由三个部位组成，分别为细胞膜、细胞壁和荚膜。
3.卡介苗(bacillus calmette gu
é
rin,bcg)是由减毒牛型分枝杆菌(m.bovis)悬浮液制成的活菌苗，为目前预防结核病最有效的疫苗。自1948年以来，全球已有超过30亿人接种，其安全性有效性已被证实。卡介菌多糖核酸注射液(bcgpolysaccharide nucleic acid，bcg-psn)系用卡介菌培养后收集菌体，采用热酚法提取菌体中的多糖与核酸，经纯化后以灭菌生理氯化钠溶液配置而成。其中，多糖含量为0.28～0.42mg/ml，核酸含量为40～100μg/ml。bcg-psn是我国首创的免疫调节剂，具有显著的免疫调节、抗炎和抗过敏作用，临床用于多种免疫失调或免疫水平下降及过敏性疾病，如难治性肺结核、支气管哮喘、支气管炎、病毒感染性疾病及皮肤变态反应疾病等。然而，bcg-psn的组成成分复杂，质量较难以控制，不良反应风险较大，影响其药用价值和在同类药物中的市场竞争力。


技术实现要素：

4.基于此，有必要提供一种结构新颖的具有免疫调节作用的卡介菌甘露聚糖及其制备方法和应用。
5.一种卡介菌甘露聚糖，所述卡介菌甘露聚糖具有如下通式i表示的结构：
[0006][0007]
其中，m和n表示重复单元数，且0＜n＜60，0≤m＜10。
[0008]
经药理学研究发现，本发明的卡介菌甘露聚糖可以浓度依赖性促进巨噬细胞raw264.7的增殖，且在12h和24h时效果显著；随着药物浓度的增加，卡介菌甘露聚糖吞噬中性红的能力明显增强，表明该卡介菌甘露聚糖能够增强巨噬细胞的吞噬功能；而且该卡介菌甘露聚糖能显著提高巨噬细胞的no释放，进而在宿主免疫防疫、组织修复等生理活动中发挥一定作用。进一步的定性夹心免疫检测(elisa)实验表明，该卡介菌甘露聚糖能够显著刺激巨噬细胞生成tnf-α，而tnf-α是一种主要由巨噬细胞和淋巴细胞分泌的细胞因子，在宿主防御机制中发挥重要作用，对肿瘤具有直接溶解和抑制增殖的作用。因此，该结构新颖的卡介菌甘露聚糖具有增加免疫活性，因而具有免疫调节的实际应用价值。
[0009]
在其中一个实施例中，所述卡介菌甘露聚糖的重均分子量为2000da～40000da，多分散系数为1～3。
[0010]
在其中一个实施例中，所述卡介菌甘露聚糖具有如下通式ii表示的结构：
[0011][0012]
其中，n表示重复单元数，且0<n<60。
[0013]
一种上述卡介菌甘露聚糖的制备方法，包括以下步骤：
[0014]
获取分枝杆菌属细菌菌体；
[0015]
提取所述分枝杆菌属细菌菌体的荚膜多糖；
[0016]
提取所述荚膜多糖中重均分子量为2000da～40000da的组分，得到所述卡介菌甘露聚糖。
[0017]
在其中一个实施例中，提取所述荚膜多糖的步骤包括以下步骤：将所述分枝杆菌属细菌菌体与表面活性剂溶液混合，然后离心并收集上清液。
[0018]
在其中一个实施例中，所述表面活性剂为非离子表面活性剂。
[0019]
在其中一个实施例中，所述表面活性剂为四丁酚醇和聚氧乙烯单叔辛基苯基醚中的一种或多种。
[0020]
在其中一个实施例中，提取所述荚膜多糖中重均分子量为2000da～40000da的组分的方法选自凝胶排阻层析柱法、透析法和超滤法中的一种或多种。
[0021]
在其中一个实施例中，所述分枝杆菌属细菌包括牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、坎纳分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和鸟分枝杆菌及其减毒细菌中的一种或多种。
[0022]
一种上述卡介菌甘露聚糖在制备免疫调节药物中的应用。
[0023]
一种药物组合物，包括上述卡介菌甘露聚糖及其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂合物，和药学上可接受的辅料。
[0024]
在其中一个实施例中，所述药物组合物的剂型为注射剂，所述辅料包括氯化钠。
[0025]
一种上述药物组合物在制备用于治疗和预防感冒、哮喘、过敏性疾病、胞内感染性疾病以及辅助抗肿瘤治疗的药物中的应用。
附图说明
[0026]
图1为卡介菌甘露聚糖的hplc图；
[0027]
图2为卡介菌甘露聚糖的单糖组成分析hplc图，其中图a为单糖标准品的hplc图，图b为卡介菌甘露聚糖的hplc图，man表示甘露糖，glc表示葡萄糖，gal表示半乳糖，ara表示阿拉伯糖；
[0028]
图3为卡介菌甘露聚糖的红外光谱图；
[0029]
图4为卡介菌甘露聚糖的核磁共振分析图，其中图a和图b为1h nmr谱，图c为
13
c nmr谱，图中字母a1～a6表示2,6-o-α-d-manp，b1～b6表示t-α-d-manp；
[0030]
图5为卡介菌甘露聚糖的核磁共振分析图，其中图a为1h-13
c hsqc nmr图，图b为1h-13
c hmbc nmr图；
[0031]
图6为不同时间系列浓度卡介菌甘露聚糖对raw264.7细胞增值的影响(n＝3，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05vs control)；
[0032]
图7为不同浓度卡介菌甘露聚糖对raw264.7细胞吞噬活性的影响(n＝3，***p<0.001，**p<0.01vs control)；
[0033]
图8为不同时间系列浓度卡介菌甘露聚糖对raw264.7细胞释放no的影响(n＝3，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05vs control)；
[0034]
图9为不同浓度卡介菌甘露聚糖对raw264.7细胞分泌细胞因子tnf-α的影响(n＝3，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05vs control)。
具体实施方式
[0035]
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0036]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0037]
本发明一实施例的卡介菌甘露聚糖，具有如下通式i表示的结构：
[0038][0039]
其中，m和n表示重复单元数，且0＜n＜60，0≤m＜10。该卡介菌甘露聚糖以α(1
→
6)糖苷键为主链，而侧链甘露糖以α(1
→
2)糖苷键连接到此主链上。
[0040]
bcg-psn中的多糖是其主要成分，在免疫调节相关的药效中发挥了重要作用，但卡介菌多糖可能来源于卡介菌的细胞质、细胞壁和荚膜等细胞结构，其种类和结构也极其复杂，本领域技术人员一直致力于发现卡介菌的不同类型的多糖及阐明其化学结构和生物功能，并开展相关应用开发工作。目前的研究显示，卡介菌中含有结构较为规整葡聚糖以及结构极其复杂的脂甘露聚糖和脂阿拉伯甘露聚糖，是否有其他类型的多糖仍不明确。
[0041]
本发明人对卡介菌经过深入的研究惊奇地发现，从苏通培养基或马铃薯培养基培养的卡介菌的菌体中，应用创新性方法提取纯化可获得一种结构新颖的卡介菌甘露聚糖。通过进一步的药理活性研究发现，该新发现的卡介菌甘露聚糖能够显著增强巨噬细胞的增殖活性、吞噬能力，诱导no和细胞因子tnf-α的生成，因而该卡介菌甘露聚糖具有用于免疫调节药物的制备的用途。因此，本发明提供的一种结构新颖的卡介菌甘露聚糖及其制备方法和药用组合物，以及在制备免疫调节药物中的应用，均为首次公开报道。
[0042]
在一个具体示例中，卡介菌甘露聚糖的重均分子量为2000da～40000da，多分散系数为1～3。优选地，卡介菌甘露聚糖的重均分子量为3000da～20000da。
[0043]
在一个具体示例中，当通式i中的m＝0时，卡介菌甘露聚糖具有如下通式ii表示的结构：
[0044][0045]
其中，n表示重复单元数，且0<n<60。
[0046]
本发明一实施例的上述卡介菌甘露聚糖的制备方法，包括以下步骤s1～s3：
[0047]
s1、获取分枝杆菌属细菌菌体。
[0048]
s2、提取分枝杆菌属细菌菌体的荚膜多糖。
[0049]
s3、提取荚膜多糖中重均分子量为2000da～40000da的组分，得到卡介菌甘露聚糖。
[0050]
在一个具体示例中，分枝杆菌属细菌菌体的获取可以通过对分枝杆菌属细菌进行液体或固体培养基法培养，然后收获菌体得到。具体地，将分支杆菌属细菌经选种、接种以及液体培养基或如马铃薯等固体培养基培养后，收集生长成熟的菌体。可选地，固体培养基制备过程为：制备苏通马铃薯培养液，将泡碱后的马铃薯片装入试管，然后倒入培养液，塞好棉塞，放入不锈钢盒中湿热灭菌。选取生长成熟，菌苔丰满的菌苔作为生产菌种。挑取少许菌苔均匀涂布于另一培养基上。将已接好种的培养基培养12～25天，温度控制在37℃～39℃。培养好的菌体应逐个检查，若有污染、浑浊等情况应废弃。收集卡介菌菌体，将其压干，称量。破碎菌体后备用。生产菌体不超过第12代。可以理解，分枝杆菌属细菌菌体的获取方法不限于此，可根据需要选择。
[0051]
在一个具体示例中，分枝杆菌属细菌包括但不限于牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、坎纳分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、鸟分枝杆菌以及它们减毒的分枝杆菌属细菌。优选地，上述分枝杆菌属细菌为牛分枝杆菌减毒的卡介菌(bacillus calmette gu
é
rin,bcg)。
[0052]
在一个具体示例中，提取荚膜多糖的步骤包括以下步骤：将分枝杆菌属细菌菌体与表面活性剂溶液混合，然后离心并收集上清液。可选地，表面活性剂可以任选离子表面活性剂和非离子表面活性剂，优选为非离子表面活性剂。可选地，表面活性剂溶液的浓度为0.02wt％～5wt％。优选地，表面活性剂为四丁酚醇(泰洛沙泊)或聚氧乙烯单叔辛基苯基醚
(triton x-114)。
[0053]
具体地，可将表面活性剂溶解于ph为6～10的缓冲液如pbs缓冲液中，作为菌体提取溶媒。菌体纯水洗涤后，加入含0.02wt％～5wt％表面活性剂的pbs缓冲液，使菌体悬浮摇动5min～60min，离心机离心，收集含有荚膜多糖的上清液。可以理解，菌体沉淀可按照上述步骤重复提取多次，合并上清，上清过微孔滤膜后，减压真空浓缩。
[0054]
在一个具体示例中，制备方法还包括以下步骤：将上述含有荚膜多糖的上清液与甲醇、乙醇或丙酮等低碳链的醇或酮混合使之产生沉淀，离心后收集沉淀，得到纯化的荚膜多糖。
[0055]
在一个具体示例中，提取荚膜多糖中重均分子量为2000da～40000da的组分的方法选自凝胶排阻层析柱法、透析法和超滤法中的一种或多种。具体地，可将纯化的荚膜多糖组分加去离子水复溶后，离心除去少量不溶物，任选凝胶排阻层析法、透析法或超滤法等方法进行纯化，收集含有甘露聚糖的流份或截留液或透过液，若含有盐需脱盐后，直接真空冷冻干燥或减压浓缩后醇沉减压干燥，即得卡介菌甘露聚糖。
[0056]
可以理解，对于凝胶排阻层析法，是根据荚膜多糖组分中多糖物质的分子量，合理选择凝胶材料，例如葡聚糖凝胶sephadex系列、琼脂糖凝胶sepharose系列、聚丙烯酰胺bio-gel p系列以及它们相互交联形成的凝胶填料，然后按照各个填料的实际性能进行装柱、上样以及用含盐或不含盐洗脱溶液依次洗脱并收集流份。因糖类物质无特征紫外吸收，可以采用硫酸苯酚法等显色检测流份，绘制流出曲线，合并各个流出峰，流出液可浓缩或不需要浓缩，装入透析袋透析或超滤膜包超滤脱盐，收集脱盐后的截留液，经真空冷冻干燥或真空减压干燥，即得纯化的卡介菌甘露聚糖。或者采用透析法或超滤法等方法进行纯化荚膜多糖组分时，选择适当分子量的超滤膜包进行切向流超滤截留处理。例如，荚膜多糖组分水溶液先经一个大于卡介菌甘露聚糖的分子量的透析袋或超滤膜包充分透析或超滤，收集透过液或流出液，除去大分子量的物质，然后再经小于卡介菌甘露聚糖的分子量的透析袋或超滤膜包充分透析或超滤，收集截留液，浓缩后经真空冷冻干燥或真空减压干燥，即得纯化的卡介菌甘露聚糖。
[0057]
本发明还提供一种上述卡介菌甘露聚糖的结构解析方法，包括以下步骤：
[0058]
(1)分子量测定：取卡介菌甘露聚糖样品，任选采用高效凝胶排阻色谱-示差检测器检测法(hpgpc-ri)和高效凝胶排阻色谱-多角度激光光散射仪检测法(hpgpc-mals)分析卡介菌甘露聚糖的分子量及其分布。
[0059]
(2)单糖组成分析：取卡介菌甘露聚糖样品，进行完全酸水解使之水解为单糖，然后采用3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(pmp)柱前衍生化后，经高效液相色谱仪(hplc)分析卡介菌甘露聚糖的单糖组成。
[0060]
(3)甲基化分析：取卡介菌甘露聚糖样品，用如碘甲烷等卤代甲烷试剂在碱性条件下，进行多糖甲基化，在碱性条件下水解后用硼氢化钠还原，用酸酐对甲基化糖醇进行乙酰化，萃取定容后，进行气相色谱仪联用质谱仪(gc-ms)分析，判断卡介菌甘露聚糖的糖苷键连接方式。
[0061]
(4)红外光谱分析：取卡介菌甘露聚糖样品，充分干燥后，采用固体溴化钾压片法，在红外光谱仪上测定样品的红外光谱。
[0062]
(5)核磁共振分析：取卡介菌甘露聚糖样品溶解于氘代重水(d2o)中，冷冻真空干
燥，重复三次重水交换，最后样品溶解到髙氘代度的重水中，检测样品的核磁共振谱包括一维1h和
13
c谱和1h-1
h cosy、1h-1
h tocsy、1h-1
hroesy、1h-13
c hsqc、1h-13
c hmbc二维相关谱。
[0063]
(6)综合数据解析：综合分析上述步骤的分析数据，得出卡介菌甘露聚糖的化学结构。
[0064]
按照上述结构解析方法，对应用本发明的制备方法从一株牛分枝杆菌菌株中提取纯化的卡介菌甘露聚糖进行结构分析。结果显示，该卡介菌甘露聚糖在hpgpc凝胶色谱峰上只显示一个对称性良好的色谱峰，而其重均分子量为～20kda，其多分散指数为1.40；单糖组成显示该卡介菌甘露聚糖由甘露糖组成；甲基化分析显示，该卡介菌甘露聚糖存在α(1
→
6)糖苷键和α(1
→
2)糖苷键；红外光谱分析显示，糖环和环上的羟基、乙酰基和氨基等吸收峰，以及在指纹图谱区有呋喃糖吸收信号峰都符合甘露聚糖的吸收峰；根据核磁共振谱数据，可以清晰地归属该多糖的1h和
13
c的信号。综合上述数据，该卡介菌甘露聚糖具有如通式i所示的结构特征：以α(1
→
6)糖苷键为主链，而侧链甘露糖以α(1
→
2)糖苷键连接到此主链上。
[0065][0066]
其中，n和m表示重复单元数，且0<n<60，0≤m<10。
[0067]
而且，对于来源于牛分枝杆菌减毒的卡介菌(bacillus calmette gu
é
rin,bcg)的甘露聚糖，按照本发明上述结构解析方法，其为具有通式ii所示结构的卡介菌甘露聚糖。
[0068][0069]
其中，n表示重复单元数，且0<n<60。显然，如通式ii所示结构的卡介菌甘露聚糖是如通式i所示卡介菌甘露聚糖当m＝0时的结构。
[0070]
本发明经药理学研究惊奇地发现，该卡介菌甘露聚糖可以浓度依赖性促进巨噬细胞raw264.7的增殖，且在12h和24h时效果显著；随着药物浓度的增加，卡介菌甘露聚糖吞噬中性红的能力明显增强，表明该卡介菌甘露聚糖能够增强巨噬细胞的吞噬功能；而且该卡介菌甘露聚糖能显著提高巨噬细胞的no释放，进而在宿主免疫防疫、组织修复等生理活动中发挥一定作用。进一步的定性夹心免疫检测(elisa)实验表明，该卡介菌甘露聚糖能够显著刺激巨噬细胞生成tnf-α，而tnf-α是一种主要由巨噬细胞和淋巴细胞分泌的细胞因子，在宿主防御机制中发挥重要作用，对肿瘤具有直接溶解和抑制增殖的作用。因此，该结构新颖的卡介菌甘露聚糖具有增加免疫活性，因而具有免疫调节的实际应用价值。
[0071]
为此，进一步本发明还提供上述卡介菌甘露聚糖在制备免疫调节药物中的应用。
[0072]
本发明一实施例的药物组合物，包括上述卡介菌甘露聚糖及其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂合物，和药学上可接受的辅料。可选地，上述辅料包括药用赋形剂、载体和/或稀释剂等。
[0073]
在一个具体示例中，上述药物组合物的剂型为注射剂，例如水针剂和注射用冻干粉针剂等，辅料包括氯化钠等。
[0074]
本发明还提供上述药物组合物在制备用于治疗和预防感冒、哮喘、过敏性疾病、胞内感染性疾病以及辅助抗肿瘤治疗的药物中的应用。
[0075]
以下结合附图以特定的具体实施例来详细说明本发明内容，但这些具体实施例对本发明的权利要求的范围不构成任何限制。
[0076]
实施例1卡介菌培养及菌体收集
[0077]
1.培养基制备：制备苏通马铃薯培养液，将泡碱后的马铃薯片装入试管，然后倒入
培养液，塞好棉塞，放入不锈钢盒中湿热灭菌。
[0078]
2.选种：选取生长成熟，菌苔丰满的菌苔作为生产菌种。
[0079]
3.接种：挑取少许菌苔均匀涂布于另一培养基上。
[0080]
4.培养：将已接好种的培养基培养12～25天，温度控制在37℃～39℃。
[0081]
5.菌体收集：培养好的菌体应逐支检查，若有污染、浑浊等情况应废弃。收集卡介菌菌体，将其压干，称量。破碎菌体后备用。生产菌体不超过第12代。
[0082]
本实施例中，卡介菌菌体培养3批次，各批次中，每支试管接种培养后收集得到菌体，3批次每支试管收集菌体平均重量为接种量的13.2、13.5、13.0倍。
[0083]
实施例2卡介菌甘露聚糖的提取纯化
[0084]
1.卡介菌胞外多糖提取
[0085]
1.1 提取试剂配制：含0.1％泰洛沙泊(四丁酚醇)和0.1m的ph6.7 pbs缓冲液配制：称取10.366g磷酸二氢钠，38.835g磷酸氢二钠，加水溶解，定容至3600ml备用。向pbs缓冲液加入3.6g泰洛沙泊，摇匀。
[0086]
1.2 菌体提取：称取按照实施例1培养的牛分枝杆菌减毒的卡介菌菌体500g于烧杯中，水洗，4000rpm
×
10min离心，弃上清，重复三次，硫酸苯酚法检测水洗液中无多糖组分。沉淀分别加入500ml含0.1％泰洛沙泊的pbs缓冲液(悬浮液浓度1g/ml)，摇动5min，4000rpm
×
10min离心，收集含有荚膜多糖的上清液。以上步骤重复提取3次，合并上清。上述沉淀水洗三次，离心(4000rpm
×
15min)弃去上清。沉淀溶于550ml水中，80℃水浴2h，离心(4000rpm
×
10min)弃去沉淀，取上清。重复三次，合并上请。
[0087]
1.3 卡介菌胞外多糖：上述所得所有上清4000rpm
×
10min离心，取上清，过0.22μm膜，浓缩，加入95％乙醇至乙醇终浓度为80％。4000rpm
×
15min离心，取沉淀，加水复溶，4000rpm
×
15min离心，取上清，重复三次，1000da透析，真空冷冻冻干燥，即得卡介菌胞外多糖900mg。
[0088]
2.卡介菌甘露聚糖纯化
[0089]
取200mg卡介菌胞外多糖，0.1m nacl(含0.02％nan3)溶解，上样于g100凝胶柱(2.0cm
×
120cm)，0.1m nacl(含0.02％nan3)洗脱，约2.5ml每管收集洗脱流份。苯酚硫酸法检测，绘制流出曲线，最后一个多糖流份为含甘露聚糖流份，收集该流份后，减压浓缩一半后，3kda透析袋对去离子水透析，0.1m硝酸银检测无氯离子后，透析截留液冻干，即得纯化的卡介菌甘露聚糖30mg。
[0090]
实施例3卡介菌甘露聚糖的结构解析
[0091]
1.实验过程
[0092]
1.1.分子量及其分布
[0093]
采用高效凝胶排阻色谱-示差检测器检测法(hpgpc-ri)分析实施例2制备的卡介菌甘露聚糖的分子量及其分布。
[0094]
色谱仪器：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；
[0095]
色谱条件：shodex ohpak sb-804hq(7.8mm
×
300mm)柱；柱温为35℃；示差检测器；流动相为0.1m nacl，流速0.5ml/min；
[0096]
测定过程：各取5mg甘露聚糖样品或已知分子量的右旋糖酐对照品加流动相配制为5mg/ml的溶液，过0.22μm微孔滤膜，滤过液50μl进高效液相色谱仪分析，记录色谱图。数
据采用gpc软件处理，绘制标准曲线，将数据带入方程，计算分子量。
[0097]
1.2 单糖组成分析
[0098]
酸水解：取实施例2制备的卡介菌甘露聚糖样品2mg，加水溶解至2mg/ml，取该溶液300μl加入5ml具塞试管中，加入4m的三氟乙酸溶液300μl，充n2，封管，110℃条件下水解反应4h。取出水解液，在70℃水浴锅中将该水解液蒸干，蒸干过程中适量加入甲醇以除去水解液中的三氟乙酸。蒸干后的样品加入50μl水溶解，备用。
[0099]
pmp衍生化：上述水溶液加入50μl 0.6m的氢氧化钠溶液和100μl 0.5m的3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(pmp)甲醇溶液，涡旋混匀；于70℃烘箱中衍生化反应60min；反应结束后冷却至室温，加入100μl 0.3m的盐酸溶液中和；中和后溶液加入500μl三氯甲烷萃取3次，水相用0.22μm微孔膜过滤后供hplc分析。标准单糖不进行酸水解，pmp衍生化方法同卡介菌甘露聚糖样品。
[0100]
色谱条件：仪器：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；色谱柱：eclipse xdb-c18(150mm
×
4.6mm
×
5μm)；柱温为30℃；流动相为0.1m乙酸铵缓冲液(ph 5.5)-乙腈(85:15)；流速：1ml/min；进样体积为20μl；dad检测器，检测波长为250nm。
[0101]
1.3 甲基化分析
[0102]
甲基化反应：称取实施例2制备的卡介菌甘露聚糖样品10mg置于5ml反应瓶中，依次加入4ml dmso、100mg氢氧化钠和600μl碘甲烷，充氮气超声反应1小时。反应结束后，加入2ml纯水，用1m盐酸溶液调节溶液ph值至中性，再加入6ml三氯甲烷对甲基化后样品进行萃取，取有机相40℃减压干燥并真空干燥12h除有机溶剂。
[0103]
甲基化多糖的酸水解：样品干燥后，加入2ml 2m tfa溶液，使甲基化产物溶解，并在120℃条件下对甲基化后的多糖进行酸水解4h。
[0104]
甲基化单糖的还原：上述水解液用1m naoh调ph为10～12，总体积约为5ml，加入50mg硼氢化钠，50℃水浴搅拌2h，反应后加入250μl冰乙酸终止反应，冻干机将样品冻干。
[0105]
甲基化糖醇的乙酰化：将1ml吡啶和1ml乙酸酐加入到干燥后冻干瓶中，转移到试管中封口，在100℃反应1h，加入1ml水破坏乙酸酐，再加2ml二氯甲烷萃取三次，有机相用n2吹至约100μl，进行gc-ms分析。
[0106]
gc条件：hp-5ms石英毛细管柱(30mm
×
0.25mm
×
0.25mm)；柱温：起始温度150℃，程序升温2℃/min至200℃，再5℃/min升温至280℃，保持20min；柱流量为1.0ml/min；进样口温度250℃；柱前压100kpa；分流比10:1；载气为高纯氦气。
[0107]
ms条件：电离方式ei；电子能量70；传输线温度250℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；质量范围35～500；采用wiley7n.l标准谱库计算机检索定性。
[0108]
1.4 红外光谱分析
[0109]
按照2015版《中国药典》第四部分采用固体压片法：取2mg样品经40℃真空干燥24h，采用kbr压片法，使用tensor 27傅立叶变换中红外光谱仪对样品进行4000～400cm-1
扫描，记录光谱图。
[0110]
1.5 核磁共振分析
[0111]
取实施例2制备的卡介菌甘露聚糖样品10mg溶于0.5ml d2o中，冷冻干燥，d2o交换三次后，将冷冻干燥样品溶于0.5ml d2o(99.9atom％d,contains0.05wt.％3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d
4 acid,sodium salt)中。使用avance800mhz核磁
共振波谱仪测定1h/
13
c nmr谱图以及二维图谱(1h-1
h cosy、1h-1
h tocsy、1h-1
h roesy、1h-13
c hmbc、1h-13
c hsqc)。检测结果采用mestrenova软件进行分析处理。
[0112]
2.实验结果
[0113]
本发明的卡介菌甘露聚糖的性状为：白色或类白色固体，无味，易溶于水，微溶于乙醇等有机溶剂，有引湿性。
[0114]
高效凝胶排阻色谱法分析(hpgpc-ri)结果表明，卡介菌甘露聚糖仅有一个对称的色谱峰，其重均分子量(mw)为5370da，多分散系数为1.08，如图1所示。
[0115]
单糖组成分析结果如图2所示，该卡介菌甘露聚糖经pmp柱前衍生后的hplc图显示未见有其他单糖的信号峰，仅有一个甘露糖的峰，说明该甘露聚糖单糖组成主要为甘露糖。
[0116]
甲基化分析结果表明，该甘露聚糖存在α(1
→
6)糖苷键和α(1
→
2)糖苷键。
[0117]
如图3所示，红外光谱(cm-1
)数据为：3405cm-1
为糖环上羟基o-h伸缩振动的特征吸收；2928cm-1
为糖环上亚甲基c-h伸缩振动；1130～975cm-1
为糖环上c-o-c伸缩振动；814cm-1
为α-d-甘露糖的构型特征吸收。
[0118]
核磁共振nmr检测分析部分结果见图4和图5，而详细1h和
13
c nmr信号的归属见表1。质子化学位移5.120ppm和5.044ppm分别为2,6-o-α-d-甘露糖(2,6-o-α-d-manp，简写为a)和末端d-α-甘露糖基(t-d-α-manp，简写为b)异头1h质子信号，2,6-o-α-d-manp的2位(h-2)和6位(h-6和h-6’)质子信号为4.039ppm和4.011(3.693)ppm以及其对应的c-2的化学位移为78.63ppm，所述化学位移相对于无取代甘露糖的相应的化学位移显著向低场移动，说明甘露糖基a的2位和6位的羟基有取代。98.15ppm和102.15ppm的c信号分别归属为甘露糖基a和b的c-1，而其c-h的耦合常数分别为171.2hz和173.6hz，均大于170hz，证实甘露糖基a和b的异头位构型应为α型。1h和
13
c远程相关hmbc谱清晰的显示，甘露糖基a的h-2(a2)和b的c-1(b1)有明显的相关信号(图5)，而甘露糖基a的c-1(a1)和自身的h-6(a6)也有相关信号，因此，甘露聚糖的连接方式为：甘露糖基a以(1
→
6)糖苷键形成主链，而甘露糖基b以α(1
→
2)糖苷键连接到甘露糖基a的主链上。
[0119]
综合上述数据可知，这个结构新颖的卡介菌甘露聚糖的化学结构式如通式ii所示，其结构特征为：(1)该卡介菌甘露聚糖是从一些分枝杆菌菌体中提取获得，其化学属性是细菌荚膜多糖；(2)该卡介菌甘露聚糖中，其单糖组成主要为甘露糖；(3)该卡介菌甘露聚糖的单糖连接方式为：以α(1
→
6)糖苷键为主链，而侧链甘露糖以α(1
→
2)糖苷键连接到此主链上。经国内外公开文献检索，该卡介菌甘露聚糖未见公开报道，为本发明人首次发现。
[0120]
表1卡介菌甘露聚糖的1h和
13
c nmr的归属
[0121]
[0122][0123]
2,6-o-α-d-manp表示
→
2,6manpα1
→
；t-α-d-manp表示末端(terminal)
–
d-manpα1
→
[0124]
实施例4卡介菌甘露聚糖的免疫调节活性实验
[0125]
1.受试品、试剂和细胞系
[0126]
卡介菌甘露聚糖，按照实施例2制备的甘露聚糖；mouse tnf alpha elisaready-set-go，美国ebioscience公司；脂多糖(lps)、对氨基苯磺酸和n-1-萘乙二胺盐酸盐，均为美国sigma公司；0.25％胰酶、生理盐水和水溶性甲臢化合物[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2h-四唑，内盐；mts]等试剂为市售生物级或医用级试剂。实验用细胞株为小鼠巨噬细胞系raw264.7。
[0127]
2.实验方法
[0128]
2.1 溶液配制
[0129]
样品溶液：精密称取样品适量，用无菌水溶解配制成10mg/ml的溶液，0.22μm无菌滤头滤过，4℃保存。临用前用细胞培养液稀释成所需浓度。
[0130]
pbs缓冲液：称取8g nacl、0.2g kcl、1.44g na2hpo4和0.24g k2hpo4，加蒸馏水800ml，混匀后，用盐酸调ph值至7.4，加蒸馏水定容至1000ml，分装后，高压蒸汽灭菌后4℃保存；
[0131]
10mmol/l nano2标准储存液：精密称取6.9mg nano2，加含血清培养基溶解，并定容至10ml，即为10mmol/l nano2储存液。
[0132]
griess试剂a：称取无水对氨基苯磺酸1.0g，加去离子水80ml溶解，加6ml浓度为85％浓磷酸，将上述试剂充分溶解后，定容至100ml。
[0133]
griess试剂b：称取n-1-萘乙二胺盐酸盐0.1g，加去离子水溶解，并定容至100ml，避光保存。
[0134]
0.078％中性红溶液：用0.9％的生理盐水制备0.078％的中性红储备液，常温保存，实验前用0.22μm的滤膜过滤。
[0135]
细胞溶解液：1.0m冰醋酸：无水乙醇＝1:1(v/v)。
[0136]
2.2 细胞培养
[0137]
细胞培养基：dmem(high glucose)培养基含10％的fbs和1％的青霉素、链霉素；
[0138]
细胞复苏：从液氮中快速取出细胞冻存管，置37℃水浴锅中使其解冻。解冻后，转入超净台内，用吸管反复吹打冻存管中的细胞悬液，并将其移入到离心管中，加入新鲜的细胞培养液4ml，1500rpm离心3min，无菌条件下吸掉上清，加入适量的细胞培养液，吹打均匀，制成细胞悬液后，分装于培养皿中，置于37℃，5％co2培养箱中培养。
[0139]
细胞传代培养：2天进行一次传代处理，用0.25％胰酶消化细胞，取对数生长期的细胞进行后续实验。
[0140]
细胞冻存：取对数生长期细胞，在无菌条件下用1ml胰酶室温下消化细胞1min后，加入适量培养液，吹打均匀，移至15ml离心管中，1500rpm离心3min，无菌条件下弃去上清
液，加入冻存液培养液1ml(dmem培养液：dmso＝9:1)，吹匀后转移至冻存管中密封，并先将冻存管置于4℃冰箱存放30min，转入-20℃冰箱存放后2h，于-80℃超低温冰箱过夜，最后投入液氮灌中长期保存。
[0141]
2.3 mts法检测巨噬细胞的增殖活性
[0142]
取对数生长期的raw264.7悬液调整细胞密度为2
×
106cells/ml，接种于96孔板中，每孔80μl。置于37℃，5％co2培养箱中培养4h，使细胞贴壁。设空白组、lps阳性对照组和不同浓度的卡介菌甘露聚糖，每孔分别加入80μl，设3个复孔。置于37℃，5％co2培养箱中继续孵育12h、24h、48h，每孔加入50μl mts溶液，继续孵育3小时，使反应充分进行。终止培养，震荡10min，将96孔板放在酶标仪上，在490nm波长下检测各孔od值，计算细胞增值率。
[0143]
2.4 对raw264.7细胞吞噬能力的影响
[0144]
按2.3项下细胞接种方法操作，置于37℃，5％co2培养箱中培养4h，使细胞贴壁。设空白组、阳性对照组lps和不同浓度的卡介菌甘露聚糖，每孔分别加入80μl，设3个复孔。按照细胞增殖的实验结果，采取置于37℃，5％co2培养箱中继续孵育24h，吸弃细胞上清，每孔加入0.075％中性红溶液100μl，继续培养1h。弃上清，每孔加入200μl预温的pbs，清洗细胞，重复操作3次。加入100μl细胞溶解液，酶标仪540nm波长处测定od值。
[0145]
2.5 对raw264.7细胞释放no的影响
[0146]
按2.3项下细胞接种方法操作，置于37℃，5％co2培养箱中培养4h，使细胞贴壁。设空白组、lps阳性对照组和不同浓度的卡介菌甘露聚糖，每孔分别加入80μl，设3个复孔。置于37℃，5％co2培养箱中继续孵育12h、24h、48h。培养结束后，取细胞上清液60μl到新的96孔板中，每孔加入60μl griess试剂a和60μl griess试剂室温条件下避光保存10min后，振板，570nm波长处读取od值。按亚硝酸钠标准曲线计算上清中no2的含量，以反应细胞上清中no的释放量。
[0147]
标准曲线绘制：取10mm的nano2储备液，用细胞培养液等倍稀释成100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0μmol/l的nano2，各取60μl于96孔板中，每组个3复孔。每孔加入60μl griess试剂a和60μl griess试剂室温条件下避光保存10min后，振板，570nm波长处读取od值。
[0148]
2.6 对raw264.7细胞分泌细胞因子tnf-α水平的影响
[0149]
按2.3项下细胞接种方法操作，置于37℃，5％co2培养箱中培养4h，使细胞贴壁。设空白组、lps阳性对照组和不同浓度的卡介菌甘露聚糖，每孔分别加入80μl，设3个复孔。置于37℃，5％co2培养箱中继续孵育24h。培养结束后，取细胞上清液按照elisa试剂盒说明书进行操作。
[0150]
3.实验结果
[0151]
3.1 对巨噬细胞增殖的影响
[0152]
以不同浓度(25～400μg/ml)卡介菌甘露聚糖和1μg/ml lps在12、24和48h不同时间分别作用于巨噬细胞，采用mts法检测细胞的增殖情况。结果如图6所示，作用12h和24h后，卡介菌甘露聚糖和lps均可促进巨噬细胞的增值，不同浓度(25～400μg/ml)卡介菌甘露聚糖处理后细胞数量与空白对照组均有显著差异；作用48h后，卡介菌甘露聚糖对巨噬细胞无明显增值作用。
[0153]
3.2 对raw264.7细胞吞噬活性的影响
[0154]
如图7所示，与空白对照组相比，卡介菌甘露聚糖各剂量处理组的吸光度值均有不同程度的升高，表明raw264.7细胞在卡介菌甘露聚糖的刺激下，吞噬中性红的能力提高，并且随着给药浓度的增加而细胞吞噬能力增加。
[0155]
3.3 对raw264.7细胞释放no的影响
[0156]
no是巨噬细胞活化的标志，是巨噬细胞吞噬病原微生物的主要效应分子。如图8所示，卡介菌甘露聚糖作用于巨噬细胞24h，不同浓度下巨噬细胞均被明显激活，细胞培养液中no分泌量上升，且呈现剂量效应，与正常组相比均呈现明显增加。这提示卡介菌甘露聚糖能够有效激活巨噬细胞，增强巨噬细胞的免疫功能。
[0157]
3.4 对raw264.7细胞分泌细胞因子的影响
[0158]
为考察卡介菌甘露聚糖对raw264.7细胞分泌细胞因子的影响，用elisa法检测细胞因子的释放。由图9可知，卡介菌甘露聚糖能够显著增加细胞因子tnf-α的释放，并呈剂量依赖关系。
[0159]
上述结果表明，卡介菌甘露聚糖能够增强巨噬细胞的增殖活性、吞噬能力，诱导no和细胞因子tnf-α的生成，卡介菌甘露聚糖对巨噬细胞具有显著的免疫调节活性。
[0160]
实施例5卡介菌甘露聚糖药物组合物的冻干粉针的制备
[0161]
1.材料
[0162]
同实施例2方法所得卡介菌甘露聚糖，药用级氯化钠。
[0163]
2.处方
[0164]
原辅料名称用量卡介菌甘露聚糖50g氯化钠4.5g注射用水500ml共制成1000支
[0165]
3.制备工艺
[0166]
称取处方量的卡介菌甘露聚糖和氯化钠加注射用水至全量，搅拌使溶解完全，间歇式热压法灭菌。加入0.3％的药用活性炭，搅拌20min；使用布氏漏斗及3.0μm微孔滤膜脱炭过滤除去热源。含量合格后用0.22μm的微孔滤膜过滤；分装于管制西林瓶中，每瓶0.5ml，半压塞，置冷冻干燥箱内，按设定的冻干曲线进行冻干，压塞，出箱，轧盖，目检合格，包装得成品。
[0167]
冻干过程：将样品进箱，降隔板温至-40℃，保持4h；冷阱降至-50℃，开始抽真空至250μbar。开始升华：1h匀速升温至-20℃，保持3h；3h匀速升温至-10℃，保持8h，真空保持100～250μbar；再进行干燥：2h升温至-5℃，保持2h，真空保持150～200μbar；0.5h升温至10℃，保持2h，真空保持80～100μbar；0.5h升温至40℃，保持4h，真空抽至最低。
[0168]
实施例6卡介菌甘露聚糖药物组合物的水针剂的制备
[0169]
1.材料
[0170]
同实施例2方法所得卡介菌甘露聚糖，药用级氯化钠。
[0171]
2.处方
[0172]
原辅料名称用量卡介菌甘露聚糖30g
氯化钠2.7g注射用水300ml共制成600支
[0173]
3.制备工艺
[0174]
称取处方量的卡介菌甘露聚糖和氯化钠加注射用水至全量，搅拌使溶解完全。加入0.3％的药用活性炭，搅拌20min；使用布氏漏斗及3.0μm微孔滤膜脱炭过滤除去热源。含量合格后用0.22μm的微孔滤膜过滤；分装于管安剖瓶中，每瓶0.5ml，熔封后，经湿热灭菌法灭菌，冷却，目检合格，包装得成品。
[0175]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0176]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。